(Pyr1) Apelin-13對布比卡因誘導停搏乳鼠心肌細胞PI3K/Akt通路的干預

林婷婷，陳超星，鮑娜娜，施克儉，董嬌嬌，劉樂

溫州醫科大學附屬第一醫院 麻醉科，浙江 溫州 325015

布比卡因是臨床上常見的酰胺類局部麻醉藥，廣泛用于局部浸潤麻醉、硬膜外麻醉、神經阻滯等麻醉方法中[1]。但臨床上操作不當致使布比卡因不慎入血或用量過大或機體高敏時，可能會引起嚴重的心臟毒性，造成循環衰竭甚至心臟停搏[2]。APJ受體是細胞膜上存在的一種七次跨膜G蛋白耦聯受體，廣泛分布于全身多個重要臟器，隨后在1998年發現其特異性配體Apelin[3]。多年研究表明， Apelin/APJ系統有助于改善心力衰竭[4-5]、動脈粥樣硬化[6]、心肌缺血再灌注損傷[7]、心律失常[8-9]、高血壓[10]、心肌肥厚[11-12]等多種心血管系統疾病。前期本團隊首次發現布比卡因誘導的在體大鼠心臟停搏模型中，Apelin-13 可明顯提高大鼠復蘇率及加快血流動力學恢復[13]。但截至目前，Apelin逆轉布比卡因心肌毒性的具體機制尚未完全明確。本研究制備體外布比卡因誘導的乳鼠心肌細胞停搏模型，給予外源性（Pyr1）Apelin-13處理，觀察其細胞搏動和線粒體改變情況，并探討Apelin/APJ系統在布比卡因心肌毒性中的作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD大鼠新生1～3 d的乳鼠，由溫州醫科大學實驗動物中心提供，生產許可證號：SCXK（浙）2020-0001。

1.1.2 實驗試劑 布比卡因（美國Sigma公司，B5274-5G）， （Pyr1）Apelin-13（美國Tocris公司，217082-60-5），大鼠Apelin-13酶聯免疫試劑盒（上海Boyun Biotech公司，BP-E20321），乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，A020-2），兔抗GAPDH抗體（美國CST公司，#5174），兔抗APJ受體（美國Abcam公司，ab214369），兔抗PI3K抗體（美國CST公司，#4292），兔抗p-PI3K抗體（美國Affinity公司，#AF3241），兔抗Akt抗體（美國CST公司，#9272），兔抗p-Akt抗體（美國CST公司，#4060）

1.1.3 心肌細胞提取及培養 取SD大鼠乳鼠，用75%乙醇消毒后，剪開胸骨，迅速取出心臟置于預冷PBS中清洗。剪碎心室組織，加入心肌細胞消化液移至37 ℃水浴機械攪拌8 min，收集組織上方消化液至含10% FBS的DMEM培養液的離心管中終止消化，剩下組織再次加入消化液重復8次。收集的心肌細胞懸液進行差速貼壁1 h，去除非心肌細胞。用含0.1 mmol/L BrdU的DMEM培養液調整細胞濃度至2× 106/mL接種于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養箱（美國Thermo公司）過夜培養，第2天更換新的培養液。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 提取心肌細胞后培養48 h觀察到心肌細胞互相融合，單層貼壁，細胞發生同步搏動且搏動率達80%～85%。記錄各組細胞10 s基礎自主搏動次數后，隨機分成4組，按照以下藥物處理 6 h：空白培養基組（DMSO組）、布比卡因1 mmol/L組（Bup組）、 （Pyr1）Apelin-13 2 μmol/L組（Apl組）和布比卡因1 mmol/L+（Pyr1）Apelin-13 2 μmol/L組（BAp組）。藥物劑量及處理時間參考本團隊先前研究[14]。

1.2.2 乳鼠心肌細胞搏動次數 通過顯微鏡計數視野下10 s心肌細胞自主搏動次數。藥物處理完畢后時間記為T0，更換全新普通培養液，去除藥物后 1、2、4、8、12 h分別記為T1、T2、T4、T8、T12，記錄以上各時間點細胞搏動次數，計算細胞各時間點搏動次數與基礎搏動次數的比值。

1.2.3 電鏡下觀察乳鼠心肌細胞線粒體形態 T12時棄去培養液，胰酶消化收集細胞，低速離心細胞成團，加入2.5%戊二醛固定細胞團，4 ℃過夜。第2天細胞團再用1%鋨酸固定1 h，1%醋酸鈾塊染2 h。通過乙醇梯度脫水10 min，純丙酮深度脫水10 min， 包埋液與丙酮1:1混合37 ℃烘箱2 h，包埋液與丙酮4:1 混合37 ℃烘箱過夜。加入純包埋液，45 ℃烘箱3 h，65 ℃烘箱48 h。干燥后制成半薄切片和超薄切片，經醋酸鈾-枸櫞酸鉛復染后在透射電鏡（日本HITACHI公司）下觀察其線粒體形態。

1.2.4 細胞培養液LDH含量 T12時收集各組培養液，低速低溫離心，留取上清液待測。根據試劑盒說明書采用比色法檢測上清液中LDH含量。最后組間數據比較時，以DMSO組為對照組，計算其他組與DMSO組的相對值。

1.2.5 心肌細胞中Apelin-13蛋白測定 T12時各組細胞低速低溫離心，棄去上清液，收集下層細胞團待測。根據大鼠Apelin-13酶聯免疫試劑盒說明書采用雙抗體夾心原理檢測心肌細胞中Apelin-13蛋白。最后組間數據比較時，以DMSO組為對照組，計算其他組與DMSO組的相對值。

1.2.6 Western blot檢測心肌細胞APJ和PI3K/Akt通路蛋白的相對表達量 T12時棄去培養液，加入預冷PBS清洗，用含1% PMSF的培養細胞總蛋白提取劑提取蛋白，BCA法測定濃度并配置上樣蛋白。配制SDS-PAGE 10%分離膠，5%濃縮膠電泳，采用濕法轉膜將蛋白轉印至PVDF膜。裁剪膜所需條帶，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉1 h，加入兔抗GAPDH（1:1 000）、兔抗APJ（1:500）、兔抗PI3K（1:1 000）、兔抗p-PI3K（1:1 000）、兔抗Akt（1:1 000）和兔抗p-Akt（1:1 000）、一抗液浸沒相應條帶于4 ℃水平搖床過夜，次日加入山羊抗兔IgG（H+L）HRP（1:5 000）室溫孵育1 h，后加入ECL發光液，用凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）自動顯影讀取條帶灰度值，以GAPDH為內參，計算目的蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值。最后組間數據比較時，以DMSO組為對照組，計算其他組與DMSO組的相對值。

1.3 統計學處理方法

2 結果

2.1 4組乳鼠心肌細胞自主搏動變化

與DMSO組比：aP ＜0.05；與Bup組比：bP ＜0.05；與Apl組比：cP ＜0.05。圖1 4組乳鼠心肌細胞自主搏動變化

單純布比卡因處理后，T0時全部心肌細胞停止搏動，布比卡因誘導心肌細胞停搏模型制備成功。各組間細胞自主搏動次數差異有統計學意義（P＜0.001）。與DMSO組比，Bup組搏動次數全程減少；Apl組搏動次數在T0、T1明顯增加；BAp組搏動次數在T0、T1、T2明顯減少，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與Bup組比，Apl組搏動次數全程增加；BAp組搏動次數在T0、T1、T2明顯增加，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與Apl組比，BAp組搏動次數在T0、T1、T2、T4明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1。

2.2 4組乳鼠心肌細胞電鏡下線粒體形態

DMSO組及Apl組線粒體呈圓形或卵圓形，結構完整，嵴呈板層狀，排列整齊、致密；Bup組線粒體明顯腫脹，結構破壞空泡化，嵴移向周圍，變短溶解；BAp組線粒體較Bup組結構明顯改善，嵴變致密，空泡減少。見圖2。

圖2 4組乳鼠心肌細胞電鏡下線粒體形態

2.3 4組細胞培養液LDH含量比較

與DMSO組比，Bup組和BAp組的細胞培養液LDH含量均明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。與Bup組比，Apl組和BAp組細胞培養液LDH含量均明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。與Apl組比，BAp組細胞培養液LDH含量明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 4組乳鼠心肌細胞培養液LDH含量變化

2.4 4組乳鼠心肌細胞Apelin/APJ表達

與DMSO組比較，Bup組心肌細胞Apelin-13及APJ蛋白表達均明顯下調，Apl組心肌細胞Apelin-13及APJ蛋白表達均明顯上調，BAp組心肌細胞Apelin-13 蛋白表達明顯下調，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與Bup組比，Apl組和BAp組心肌細胞Apelin-13及APJ蛋白表達均明顯上調，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與Apl組比，BAp組心肌細胞Apelin-13及APJ蛋白表達均明顯下調，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 4組乳鼠心肌細胞Apelin/APJ表達

2.5 4組乳鼠心肌細胞PI3K/Akt通路蛋白表達

與DMSO組比較，Bup組心肌細胞p-PI3K和p-Akt蛋白表達均明顯下調，Apl組心肌細胞p-Akt蛋白表達明顯上調，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與Bup組比，Apl組和BAp組心肌細胞p-PI3K和p-Akt蛋白表達均明顯上調，差異均有統計學意義（P＜0.05）。與Apl組比，BAp組心肌細胞p-PI3K和p-Akt蛋白表達均明顯下調，差異均有統計學意義（P＜0.05）。4組心肌細胞PI3K和Akt總蛋白表達均差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5。

圖5 4組乳鼠心肌細胞PI3K/Akt通路蛋白表達

3 討論

對于布比卡因所致的循環虛脫甚至心臟停搏這種危急情況，尋求安全有效的搶救藥具有極其重要的臨床價值。Apelin作為一種多肽類物質，翻譯修飾過程中切割成不同活性片段，如Apelin-36、 Apelin-17和Apelin-13等，而（Pyr1）Apelin-13是焦谷氨酰胺形式的Apelin-13，因其較高的抗降解性、穩定的生物活性而被廣泛用于體內外研究中[4，15]。 乳鼠心肌細胞是一種具有自發性節律搏動的心肌細胞。LDH作為催化乳酸和丙酮相互轉化的同工酶，穩定存在于動物組織中，而在心臟組織中活性較高。當心肌細胞膜受損，LDH即被釋放到細胞外，故檢測細胞培養液中LDH含量可判斷細胞受損程度。本研究制備布比卡因誘導的乳鼠心肌細胞停搏模型，給予（Pyr1）Apelin-13處理，結果表明（Pyr1）Apelin-13 可以加快心肌細胞搏動的恢復，明顯改善布比卡因所致的線粒體損傷，顯著減少培養液中LDH含量。這結果與本團隊先前在在體大鼠[13]實驗中報道的相符合。這提示（Pyr1）Apelin-13可以逆轉布比卡因心肌毒性，具有潛在的臨床應用價值，給治療布比卡因心肌毒性提供了新的思路。

布比卡因通過抑制離子通道功能[16]、抑制能量代謝[17]和加劇氧化應激[18]等方面作用于心肌細胞從而產生心肌毒性。近年來研究報道Apelin不僅可加快心臟的傳導[9]、增強離子通道電流[15，19]、增強心肌收縮力[5]，還能改善心肌細胞能量代謝[11]、 減輕心肌細胞氧化應激[7]，這些表現都與布比卡因心肌毒性的機制相拮抗。本研究結果顯示：與DMSO組比較，Bup組心肌細胞Apelin-13及APJ蛋白表達顯著下降；而BAp組Apelin-13及APJ蛋白表達較Bup組明顯上調。這提示布比卡因可抑制內源性 Apelin/APJ蛋白表達，而外源性（Pyr1）Apelin-13可啟動心肌細胞Apelin/APJ系統，改善布比卡因對其的抑制作用。

PI3K是一種磷脂酰肌醇激酶，由調節亞基p85和催化亞基p110構成，被認為是最重要的調節蛋白之一。而Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激 酶，是PI3K的主要下游分子。PI3K/Akt通路在心肌細胞功能、大小和存活的調控中起核心作用[20]。越來越多的研究表明Apelin/APJ系統通過激活PI3K/Akt通路發揮心臟保護作用。LI等[8]報道在小鼠急性心肌梗死模型中，外源性Apelin預處理可減輕小鼠急性缺血性心律失常發生，而聯用PI3K抑制劑LY294002處理后，可消除Apelin的心肌保護作 用。另有研究報道體內Apelin過表達的大鼠在糖尿病心肌缺血再灌注損傷中可通過激活PI3K通路改善心功能、減少心肌損傷面積、減少心肌細胞凋亡及氧化應激[7]。在H9C2心肌細胞研究中，Apelin-13 通過激活PI3K/Akt信號通路減輕葡萄糖剝奪誘導的心肌細胞自噬[21]和苯腎上腺素誘導的心肌細胞肥大[12]。本研究中，與DMSO組比較，Bup組抑制心肌細胞中p-PI3K及p-Akt蛋白表達；而BAp組p-PI3K及p-Akt蛋白表達較Bup組則顯著上調；但各組間PI3K及Akt蛋白的表達差異無統計學意義，與YE等[14]報道相符。這提示（Pyr1）Apelin-13也許通過激活PI3K/Akt磷酸化逆轉布比卡因誘導的心肌細胞停搏。外源性（Pyr1）Apelin-13可逆轉布比卡因誘導的心肌細胞停搏，其機制也許與激活PI3K/Akt磷酸化有關。