流感病毒性肺炎線粒體相關(guān)生物標(biāo)志物識別及銀翹敗毒散潛在作用機制

吳貞琳，吳煜佳，張悅瑤，馮文文，劉金元，徐培平*

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué) 科技創(chuàng)新中心，廣東 廣州 510405

2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405

流感病毒性肺炎（influenza viral pneumonia，IVP）是一種由甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）感染引起的肺部炎癥，會導(dǎo)致肺部通氣功能障礙，并具有較高的感染率和死亡率[1]。IVP 的治療策略側(cè)重于癥狀的緩解（如使用糖皮質(zhì)激素）和抗病毒治療（如使用奧司他韋）[2]。由于IAV 表現(xiàn)出抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)化病毒的持續(xù)變異，導(dǎo)致對抗病毒藥物的耐藥性和嚴(yán)重的藥物不良反應(yīng)[3]。而中醫(yī)藥已被廣泛用于治療IVP[4]。

銀翹敗毒散（Yinqiao Anti-infective Powder，YQAIP）是一種中藥復(fù)方，由銀翹散、麻杏石甘湯、荊防敗毒散、柴葛解毒湯、白虎湯5 個經(jīng)典方加減而成，組成中藥有19 種：白芍、薄荷、蒼術(shù)、柴胡、川芎、防風(fēng)、茯苓、葛根、廣藿香、金銀花、荊芥、桔梗、連翹、麻黃、羌活、升麻、前胡、知母、生石膏。銀翹敗毒散在臨床上用于治療上呼吸道病毒感染和病毒性肺炎[5-8]，其組方已獲得國家發(fā)明專利（專利號：ZL2019111180871），但其治療IVP 的作用機制尚未闡明。

生物信息學(xué)是一門利用生物學(xué)、計算機科學(xué)和信息技術(shù)來分析生物測序數(shù)據(jù)集以幫助解決生物問題的學(xué)科。測序技術(shù)的顯著進步使生物信息學(xué)在許多領(lǐng)域應(yīng)用于藥物靶點的識別和驗證成為可能[15]。通過生物信息學(xué)技術(shù)識別疾病中潛在的生物標(biāo)志物可以幫助醫(yī)生預(yù)測疾病預(yù)后和對治療的反應(yīng)[16-17]。例如，差異基因表達(dá)分析[15]和機器學(xué)習(xí)算法［如隨機森林（random forest，RF）模型、支持向量機（support vector machines，SVM）模型和拉索回歸（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）分析］用于分析病理過程和相關(guān)特征基因，以識別潛在的生物標(biāo)志物[18]。

本研究使用4 個IVP 相關(guān)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)集（GSE63786、GSE37572、GSE43302、GSE97555），并使用機器學(xué)習(xí)算法分析線粒體基因表達(dá)數(shù)據(jù)，鑒定識別與IVP 和線粒體相關(guān)的關(guān)鍵基因。通過計算機分子對接模擬分析銀翹敗毒散中1 831 種活性成分與關(guān)鍵基因的結(jié)合作用，并進行銀翹敗毒散體內(nèi)抗IVP 作用及對相關(guān)線粒體關(guān)鍵基因的影響研究，探討銀翹敗毒散治療IVP 可能的線粒體相關(guān)機制。

1 材料與儀器

1.1 藥物

銀翹敗毒散由19 味中藥組成：白芍10 g、薄荷5 g、蒼術(shù)10 g、柴胡10 g、川芎10 g、防風(fēng)10 g、茯苓15 g、葛根15 g、廣藿香10 g、金銀花15 g、荊芥10 g、桔梗10 g、連翹15 g、麻黃10 g、前胡10 g、羌活10 g、升麻10 g、知母10 g，生石膏30 g，所有藥材飲片均購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房，由藥學(xué)室胡英杰研究員鑒定，見表1。將銀翹敗毒散的組成中藥飲片放入1 000 mL 燒杯中，加入純水至藥物表面上方約5 cm 處，在水中浸泡30 min，用大火（240 ℃左右）煮沸，并在小火（60 ℃左右）下保持沸騰30 min。收集藥液，繼續(xù)加入適量純水煮沸15 min，合并2 次煮沸的溶液，過濾濃縮至300 mL（藥物質(zhì)量濃度0.7 g/mL），4 ℃保存?zhèn)溆谩＠晚f林購自浙江瑞新藥業(yè)股份有限公司（批號20230206）；奧司他韋膠囊購自羅氏制藥有限公司（批號M1050）。

表1 銀翹敗毒散組成中藥的基原及其活性成分?jǐn)?shù)量Table 1 Origin and active ingredients quantity of traditional Chinese medicine composed of YQAIP

1.2 試劑、病毒和動物

放射免疫沉淀緩沖液（RIPA，中國Exon 生物技術(shù)公司）；抗Pnpt1（批號37838）、抗Mthfd2（批號27411-1）抗體均購自美國Signalway Antibody LLC.；抗Lactb 抗體（批號A13145-1）購自中國博斯特生物科技有限公司；抗磷酸甘油醛脫氫酶（reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號KC-5G4，中國康辰生物技術(shù)公司）。聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜（美國Millipore Corporation）。甲型流感病毒（A/FM/1/47H1N1，F(xiàn)M1）由中國疾病預(yù)防控制中心捐贈，通過在9 d 大的雞胚中傳代48 h，用Reed-Muench 法測定小鼠 FM1 半數(shù)致死劑量（LD50）＝1×10-3.6。病毒在使用前儲存于-80 ℃冰箱中。雌性BALB/c 小鼠，SPF 級，體質(zhì)量13～15 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗中心（質(zhì)量合格證號440072000122745）。動物實驗符合《廣東省實驗動物管理條例》，并經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物福利委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)文號20230328002）。

1.3 儀器

ELx800 酶聯(lián)檢測儀（美國Bio-Tek 公司）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物技術(shù)有限公司）；PrimeScriptTM 第1 鏈cDNA 合成試劑盒（日本Takara 公司）；化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（天津冠橋醫(yī)療器械有限公）。

1.4 生物信息學(xué)研究材料

芯片數(shù)據(jù)集從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載。機器學(xué)習(xí)算法采用相關(guān)R 包（R＝4.03）。銀翹敗毒散藥物成分及結(jié)構(gòu)來自中醫(yī)藥整合藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)計算研究平臺（TCMIP，http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/home/login/login.html ） 和 PubChem 數(shù)據(jù)庫（ http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；Pymol 2.3 軟件；Autodock vina 1.1 軟件。線粒體基因數(shù)據(jù)庫（MitoCarta 3.0 database，https://www.broadinstitute.org/mitocarta/mitocarta30-inventory-mammalian-mitochondrial-proteins-andpathways）。蛋白配體相互作用分析軟件Ligplot＋v2.2 。 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（ PDB ， https://www.rcsb.org/）。分子對接軟件AutoDock Vina 1.0。

2 方法

2.1 線粒體基因集下載

從MitoCarta 3.0 數(shù)據(jù)庫中收集了1 140 只小鼠的線粒體相關(guān)基因[19]。該數(shù)據(jù)庫包括149 個線粒體功能術(shù)語，如線粒體凋亡、線粒體自噬、線粒體免疫、線粒體氧化應(yīng)激、線粒體電子轉(zhuǎn)移、線粒體銅代謝等。

大腸癌是消化道常見惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率居第3位［1］。為有效提高大腸癌生存率，衛(wèi)生部頒布的結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2010版)［2］已將術(shù)后化療列入了晚期或轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的輔助治療原則，且術(shù)后化療為1個療程連續(xù)6次用藥的方案。面對連續(xù)多次化療的化療方案，患者不僅會擔(dān)心化療反應(yīng)和不良反應(yīng)，也會產(chǎn)生負(fù)性心理狀態(tài)并發(fā)生累積效應(yīng)，嚴(yán)重影響患者治療和康復(fù)效果。本文通過對結(jié)腸癌術(shù)后連續(xù)多次入院化療患者的焦慮狀況進行連續(xù)評估，旨在了解患者在1個療程內(nèi)每次接受化療前的焦慮狀況，從而為結(jié)腸癌術(shù)后化療患者的心理評估及護理對策提供科學(xué)依據(jù)。

2.2 通過機器學(xué)習(xí)算法篩選IVP 潛在的線粒體相關(guān)標(biāo)志物

從GEO 數(shù)據(jù)庫中獲得4 個IVP 相關(guān)基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集（GSE63786、GSE37572、GSE43302、GSE97555）。GSE63786 作為分析的測試集，GSE37572、GSE43302 和GSE97555 作為驗證集。數(shù)據(jù)集使用R 包“sva”和“l(fā)imma”進行標(biāo)準(zhǔn)化。使用R 軟件包“l(fā)imma”分析組間差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）［|log2fold change (FC) |＝0.5，P＜0.05］。

4 種機器學(xué)習(xí)算法［RF、支持向量機（support vector machines，SVM）、分布式梯度增強模型（eXtreme gradient boosting，XGBoost）、廣義線性模型（generalize linear model，GLM）］基于GSE63786數(shù)據(jù)集進行分析。使用“DALEX” R 包的解釋函數(shù)來分析上述4 個模型，繪制殘差的分布圖，并基于測試集提取最佳模型。分析每個變量的顯著性，并選擇每個模型的前10 個最重要的解釋變量進行進一步研究[20]。使用“root-mean-square”方法建立預(yù)測IVP 發(fā)生的列線圖模型。通過決策曲線分析評價模型的診斷價值。在外部芯片驗證集（GSE37572、GSE43302 和GSE97555）中驗證。同時，使用“pROC” R 軟件包對top 10 基因進行評估。

2.3 分子對接分析

從TCMSP（https://www.tcmsp-e.com/）、PubMed（ https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/ ）、 中國知網(wǎng)（https://www.cnki.net/）數(shù)據(jù)庫搜索銀翹敗毒散組成藥物的活性成分[21]。3 種主要的線粒體晶體結(jié)構(gòu)蛋白已被確定為潛在的藥物靶點，從PDB 數(shù)據(jù)庫下載其蛋白質(zhì)的3D 結(jié)構(gòu)（PDB 格式）。利用AutoDock Vina 軟件進行分子對接模擬[22]。蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)包括 β-內(nèi)酰胺酶狀絲氨酸蛋白酶（serine betalactamase-like protein，Lactb，PDB：7V1Y；以13.91、10.98、15.60 nm 為中心的對接盒子）、多核苷酸磷酸化酶1（polynucleotide phosphorylase 1，Pnpt1；PDB：3U1K；以0.526 1、-2.225 5、-0.401 0 nm 為中心的對接盒子）和亞甲基四氫葉酸脫氫酶 2（methylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2，Mthfd2，PDB：6S4E；以9.857 5、1.939 9、0.186 0 nm 為中心的對接盒子）。使用AutoDockTools（v1.5.6）制備蛋白質(zhì)和分子。使用PyMOL（v2.3）軟件構(gòu)建分子圖譜[23]。使用Ligplot＋v2.2 分析蛋白質(zhì)與配體的相互作用[24]。

2.4 動物實驗分組及給藥

將小鼠隨機分為對照組、模型組、銀翹敗毒散組、奧司他韋組（10 mg/kg），每組10 只。經(jīng)過急毒實驗，獲得小鼠對銀翹敗毒散的最大耐受劑量為120 g 生藥/kg，按銀翹敗毒散成人臨床劑量為3 g/(kg·d)，10 倍劑量（30 g/kg）設(shè)置為小鼠銀翹敗毒散中劑量，設(shè)置3 個劑量組即低劑量（15 g/kg）、中劑量（30 g/kg）、高劑量（60 g/kg）。對照組和模型組小鼠ig 蒸餾水，給藥體積20 mL/kg。

2.5 肺指數(shù)的測定

除對照組外，其他各組小鼠麻醉后滴鼻感染流感病毒A/FM/1/47（FM1，H1N1）15LD50的劑量。感染4 h 后，各組小鼠開始ig 給藥，每天1 次，持續(xù)4 d，并在感染后第5 天斷頸處死小鼠，并收集肺樣本進行相關(guān)檢測。測量小鼠體質(zhì)量和肺質(zhì)量，計算肺指數(shù)。

肺指數(shù)＝肺質(zhì)量/體質(zhì)量

2.6 生存保護實驗

除對照組外，其他各組小鼠麻醉后滴鼻感染流感病毒A/FM/1/47（FM1，H1N1）5LD50的劑量。感染4 h 后，各組小鼠開始ig 給藥，每天1 次，持續(xù)4 d。觀察小鼠死亡情況，15 d 內(nèi)存活者以15 d 計。

2.7 肺組織病理變化的檢測

取“2.5”項各組小鼠肺組織，將肺固定在10%福爾馬林中，包埋在石蠟中，切成5 μm 的切片，并用蘇木精和伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色。隨機選擇肺切片區(qū)域，并分別用光學(xué)顯微鏡放大100 倍。肺組織的病理評分以0～3 的半定量方式進行分級[4]。

2.8 肺組織炎癥因子的測定

取“2.5”項各組小鼠肺組織按1∶10 比例加入PBS 緩沖液，進行無菌研磨。將組織勻漿液3 000 r/min離心15 min，收集上清液。通過Bio-Tek ELx800酶聯(lián)檢測儀測定450 nm 處的吸光度（A）測定肺組織中TNF-α、IL-1β和IFN-γ的水平。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

2.9 實時定量PCR 測定肺組織相關(guān)基因的表達(dá)

取“2.5”項各組小鼠肺組織，使用Prime ScriptTM 第1 鏈cDNA 合成試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。病毒載量檢測A/FM/1/47H1N1 的基質(zhì)基因，其引物參考Liao等[25]報道。Pnpt1、Lactb、Mthfd2引物通過NCBI Primer-BLAST 設(shè)計。Pnpt1引物，正向：5’-CACTATGGAGTAGCGCAGGG-3’，反向：5’-CTGCAGTGTCACCTGACTGTA-3’；Lactb引物，正向：5’-TCCTATGTGAAAAGGAACTAAGAGA-3’，反向：5’-GAACTCCTCAGTCATTCCTCCT-3’；Mthfd2引物，正向：5’-TTATCATAGTGATGGAGAGCAGTT-3’，反向：5’-GGCCTGTGATCTCTCAGTGT-3’；內(nèi)參β-actin正向：5’-ACAGAGCCTCGCCTTTGC-3’，反向：5’-GATATCATCATCCATGGTGAGCTGG-3’。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)模式（2-ΔΔCt）分析PCR 產(chǎn)物表達(dá)水平。基因相對表達(dá)量（relative expression，RQ）與對照組結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)化為1。

2.10 Western blotting 分析肺組織線粒體相關(guān)蛋白的表達(dá)

取“2.5”項各組小鼠肺組織用放射免疫沉淀緩沖液（RIPA）均化，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）樣品緩沖液裂解，煮沸，離心并收集上清液。4 ℃、12 000×g離心勻漿5 min。通過10% SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)樣品（50 μg），并將其轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。將膜浸泡在甲醇中1～2 min，分別加入抗Pnpt1（1∶200）、抗Lactb（1∶500）、抗Mthfd2（1∶300）和抗GAPDH（1∶5 000）抗體，過夜。使用化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒進行免疫測定。將相對蛋白質(zhì)水平標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH。通過使用凝膠分析軟件（GelPro5.0，Media Cybernetics，Bethesda，美國）計算每個區(qū)域的平均光密度來進行量化。

2.11 統(tǒng)計分析

使用統(tǒng)計軟件PASW（版本18.0：IBM SPSS，美國）進行統(tǒng)計分析。使用Wilcoxon 檢驗對各組之間基因表達(dá)水平的差異進行統(tǒng)計分析。使用單因素方差分析（ANOVA）進行多組比較，進行LSD 檢驗以確定組間的差異。GraphPad Prism 軟件（版本5.0）用于繪圖。

3 結(jié)果

3.1 基于機器學(xué)習(xí)算法的線粒體關(guān)鍵基因識別與驗證

測試集（GSE63786）中包含36 個IVP 和42 個對照小鼠肺組織的mRNA 表達(dá)譜。按照Padj＜0.05和|log2FC|＞0.5 標(biāo)準(zhǔn)篩選對照組和IVP 組之間的DEGs 與線粒體的相關(guān)基因。在對IVP 的線粒體基因和DEGs 進行聯(lián)合分析后，篩選出190 個基因作為IVP 中的線粒體相關(guān)差異基因（mitochondriarelated differential genes，MRDGs），其中125 個下調(diào)基因和65 個上調(diào)基因（圖1）。

圖1 線粒體相關(guān)差異基因火山圖Fig.1 Volcano plot of mitochondrial related differentially expressed genes

為了進一步縮小線粒體關(guān)鍵基因的范圍，建立了4 個基于機器學(xué)習(xí)算法的模型。選擇190 個MRDGs 作為構(gòu)建機器學(xué)習(xí)模型的候選基因。在GSE63786 數(shù)據(jù)集上進行RF、SVM、XGB 和GLM模型分析。如圖2 所示，GLM 模型被確定為最差的模型，因為其具有很大的樣本殘差（圖2-A、B），并且曲線下面積（area under curve，AUC）值小于0.7（圖2-D）。SVM 模型被認(rèn)為是最好的模型，因為其具有最小的樣本殘差，AUC 值為1.000（圖2-D）。最后從RF、SVM 和XGB 模型中選擇30 個最重要基因在驗證集中進一步分析（圖2-C）。在驗證集中，發(fā)現(xiàn)IVP 組中只有Lactb、胞苷單磷酸激酶2（cytidine monophosphate kinase 2，Cmpk2）、Pnpt1、Mthfd2、線粒體核糖體蛋白21（mitochondrial ribosomal protein 21，Mrpl21）、Mrpl45和線粒體內(nèi)膜翻譯酶23（translatase of inner mitochondrial membrane 23，Timm23）表達(dá)水平增加，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖3-A～C）。隨后進行接受者操作特性曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）分析，以確認(rèn)上述7 個關(guān)鍵基因的診斷意義（圖3-D～F）。ROC 值通常在0.5～1.0。該值越接近1，模型估計越準(zhǔn)確。在驗證集中，有3 個關(guān)鍵基因的AUC 值均大于0.9，ROC 值范圍為0.920～1.000（圖3-D～F）。結(jié)果表明，在3 個驗證數(shù)據(jù)集中，這7 個關(guān)鍵基因的預(yù)測精度非常高。

圖2 機器學(xué)習(xí)模型的構(gòu)建和評估Fig.2 Construction and evaluation of machine learning models

圖3 驗證集GSE37572、GSE43302 和GSE97555 中關(guān)鍵基因診斷價值的鑒定和驗證Fig.3 Identification and validation of diagnostic value of key genes in validation sets GSE37572, GSE43302 and GSE97555

3.2 預(yù)測銀翹敗毒散治療IVP 可能的線粒體潛在機制

通過檢索TCMSP、PubMed、中國知網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫，從銀翹敗毒散中共篩選出1 831 種活性成分（表1）。利用分子對接分析，基于7 種IVP 相關(guān)的線粒體生物標(biāo)志物來預(yù)測銀翹敗毒散治療IVP 潛在機制。選擇了3 種具有3D 蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)（Lactb、Pnpt1 和Mthfd2）進行分子對接分析，并計算銀翹敗毒散活性成分與3 種潛在靶蛋白的結(jié)合能。1 093 個銀翹敗毒散生物活性成分對關(guān)鍵基因Lactb、Pnpt1和Mthfd2具有良好的結(jié)合親和力（＜-5.0 kcal/mol，1 kcal＝4.2 kJ）。表2 列舉了具有最高結(jié)合能（≤-9.0 kcal/mol）的小分子化合物，它們對Lactb、Pnpt1和Mthfd2表現(xiàn)出較高的結(jié)合親和力，這些可能是潛在的IVP 抑制劑。根據(jù)文獻報道，化合物的結(jié)合自由能大于-5.5 kcal/mol，表明該化合物處于非活性狀態(tài)[26]。Lactb-eugenin、Pnpt1-穗花杉雙黃酮和Mthfd2-原金絲桃素復(fù)合物的結(jié)合能分別是-9.8、-11.4 和-10.4 kcal/mol。3 個關(guān)鍵靶標(biāo)和藥物的最佳結(jié)合模式（最佳結(jié)合能）如圖4 所示。Eugenin 和Lactb催化結(jié)合位點的結(jié)合模式分析結(jié)果表明，其殘基Asp286、Thr486、Gly488、Phe287、Ser527、Lys394、Val528、Ser493、Thr325、His222和Ser453 參與了氫鍵相互作用并貢獻了14 個氫鍵（圖4-A、B）。穗花杉雙黃酮與Pnpt1的結(jié)合模式表明，Ile418、Lys456、Arg192、Asn215、Asn416 和Asp420 6 個氨基酸殘基參與了7 個氫鍵的形成（圖4-C、D）。原金絲桃素和Mthfd2之間的相互作用表明，殘基Lys88、Val274 和Ile276 與原金絲桃堿處于氫鍵接觸，并且它們共享4 個氫鍵（圖4-E、F）。

圖4 Lactb、Mthfd2、Pnpt1 和活性成分之間的相互作用Fig.4 Interactions between Lactb, Mthfd2, Pnpt1 and active ingredients

表2 銀翹敗毒散活性成分與3 種線粒體關(guān)鍵基因分子對接情況 (結(jié)合能≤-9.5 kcal·mol-1)Table 2 Docking status of active ingredients in YQAIP with three key genes of mitochondria (binding energy ≤ -9.5 kcal·mol-1)

3.3 銀翹敗毒散對IVP 小鼠肺部損傷的影響

為了評估銀翹敗毒散對IVP 小鼠的治療作用，本研究進行了肺指數(shù)和生存保護作用研究。模型組小鼠肺部出現(xiàn)炎癥，細(xì)支氣管和肺間質(zhì)有中性粒細(xì)胞浸潤，支氣管積液，大面積出血（圖5，紅色箭頭所示）。相比之下，3 個劑量銀翹敗毒散給藥后，這些病變得到了不同程度的改善（圖5-A、B）。與模型組相比，銀翹敗毒散中、高劑量組和奧司他韋組小鼠的肺指數(shù)及病毒載量顯著下降（P＜0.01、0.001）（圖5-C、D）。生存保護實驗表明，銀翹敗毒散高劑量組小鼠存活率為50%，中、高劑量組能延長小鼠生存時間，與模型組相比差異顯著（P＜0.05、0.01、0.001）（圖5-E、F）。結(jié)果表明，銀翹敗毒散可以有效改善IAV 引起的肺損傷。

圖5 銀翹敗毒散對IVP 小鼠肺部損傷的影響 (n = 10）Fig.5 Effect of Yinqiao Xidu Powder on lung injury of IVP mice (n = 10)

3.4 銀翹敗毒散對IVP 小鼠肺組織細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響

流感病毒引起的肺部炎癥和隨后的急性肺損傷與多種促炎細(xì)胞因子的過度分泌密切相關(guān)。IL-1β、IFN-γ和TNF-α 是炎癥過程中的關(guān)鍵促炎細(xì)胞因子。如圖6所示，模型組小鼠肺組織IL-1β、IFN-γ和TNFα 水平顯著增加；銀翹敗毒散中、高劑量能顯著抑制促炎細(xì)胞因子IL-1β、IFN-γ和TNF-α 的過度分泌。

圖6 銀翹敗毒散對IVP 小鼠肺組織TNF-α (A)、IL-1β (B)、IFN-γ (C) 水平的影響 (±s , n=10)Fig.6 Effect of YQAIP on levels of TNF-α (A), IL-1β (B) and IFN-γ (C) in lung tissue of IVP mice (±s , n=10)

3.5 銀翹敗毒散對IVP 小鼠肺組織線粒體相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

如圖7 所示，模型組小鼠肺組織Lactb、Pnpt1和Mthfd2mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著增加，而銀翹敗毒散高劑量（60 g/kg）可顯著抑制Lactb、Pnpt1和Mthfd2mRNA 和蛋白的表達(dá)（圖7-A～C）（P＜0.01、0.001）。

圖7 銀翹敗毒散對IVP 小鼠肺組織線粒體相關(guān)基因mRNA (A) 和蛋白 (B) 表達(dá)水平的影響 (±s , n=6)Fig.7 Effect of YQAIP on mRNA (A) and protein (B) expression levels of mitochondria-related genes in lung tissue of IVP mice (±s , n=6)

4 討論

本研究使用4 種機器學(xué)習(xí)方法（RF、SVM、GLM 和XGB）對GEO 數(shù)據(jù)庫的4 個小鼠IVP 數(shù)據(jù)集鑒定識別了與IVP 發(fā)病相關(guān)的線粒體關(guān)鍵基因。共識別出Lactb、Cmpk2、Pnpt1、Mthfd2、Mrpl21、Mrpl45和Timm237 個關(guān)鍵基因，它們可能在IVP的進展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并被確定為IVP 的潛在治療靶點。

Lactb是一種參與肽聚糖合成的線粒體膜蛋白[27]。Lactb可在膜間空間形成纖維狀線粒體膜，影響磷脂酰絲氨酸向磷脂酰乙醇胺的轉(zhuǎn)化，并直接或間接調(diào)節(jié)線粒體磷脂代謝[28]。Lactb可誘導(dǎo)線粒體ROS 的產(chǎn)生、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）水平增加和線粒體膜電位的降低，導(dǎo)致DNA損傷、線粒體功能障礙和/或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡[29]。同時，Lactb誘導(dǎo)核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路促進NF-κB 介導(dǎo)的促炎反應(yīng)[30]。

Cmpk2是一種線粒體核苷酸激酶[31]。Cmpk2依賴性mtDNA 合成對于暴露于NLRP3 激活劑后產(chǎn)生氧化的mtDNA 片段是必要的[32]。作為一種線粒體蛋白，Cmpk2在登革熱病毒（dengue virus，DENV）誘導(dǎo)的線粒體操作中至關(guān)重要[33]。在病毒感染細(xì)胞的細(xì)胞器中，線粒體是觸發(fā)抗病毒免疫的關(guān)鍵細(xì)胞器，有時可能成為病毒逃避免疫監(jiān)視的目標(biāo)[34]。

Mrp由1 個小的28S 亞基和1 個大的39S 亞基組成。部分Mrp參與多種細(xì)胞過程，包括細(xì)胞增殖、體外核糖體循環(huán)調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡[35]。Mrp通過線粒體翻譯和有絲分裂核糖體蛋白誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞凋亡和增殖[36]。病毒是一種特殊的細(xì)胞內(nèi)“寄生蟲”，其生存取決于它們在體內(nèi)復(fù)制的能力，病毒與真核細(xì)胞周期的所有階段都相互作用。許多病毒通過與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期過程的宿主因子相互作用來促進復(fù)制[37]。

Mthfd2是一種與葉酸偶聯(lián)的線粒體代謝酶[38]。Mthfd2參與葉酸單碳代謝和四氫葉酸輔因子循環(huán)，為維持細(xì)胞活力和增殖提供重要的前體，可誘導(dǎo)磷脂酰肌醇-3- 羥激酶（ phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路的激活，該通路在細(xì)胞代謝中起著至關(guān)重要的作用[39]。Mthfd2介導(dǎo)的Akt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以有效調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，支持病毒感染細(xì)胞的自我更新和增殖。

Timm基因編碼一種伴侶蛋白，屬于進化上保守的Timm 家族，其有助于蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)運輸?shù)骄€粒體[40]。Timm23可以阻止疏水性前體的聚集，并引導(dǎo)蛋白質(zhì)通過線粒體膜，這與過氧化物酶體脂質(zhì)代謝途徑有關(guān)[41]。

Pnpt1是一種I 型干擾素誘導(dǎo)的核糖核酸外切酶，可介導(dǎo)mRNA 降解[42]。Pnpt1的過表達(dá)增強了細(xì)胞凋亡[43]。

這7 個線粒體關(guān)鍵基因均參與了細(xì)胞的生長、代謝、增殖、細(xì)胞凋亡等環(huán)節(jié)，與病毒復(fù)制與感染等進展密切相關(guān)，因此，這7 個線粒體相關(guān)基因可能是IVP 的關(guān)鍵基因和潛在的治療靶點。

本研究在體內(nèi)評估了銀翹敗毒散對IVP 的治療作用及對線粒體關(guān)鍵基因的影響，并使用分子對接技術(shù)來篩選和鑒定銀翹敗毒散作用于線粒體關(guān)鍵基因的活性成分。結(jié)果表明，銀翹敗毒散對IAV 引起的病毒性肺炎具有一定的保護作用，能改善IVP 小鼠肺組織的炎癥反應(yīng)，降低炎癥因子水平。分子對接結(jié)果表明，銀翹敗毒散的活性成分對3 個線粒體關(guān)鍵基因Lactb、Pnpt1和Mthfd2具有中等至較強的結(jié)合親和力（-9.5～-10.9 kcal/mol）。銀翹敗毒散中的1 093 種活性成分可以下調(diào)這3 個線粒體關(guān)鍵基因的表達(dá)。IVP 小鼠肺組織中3 個線粒體基因Lactb、Pnpt1和Mthfd2mRNA 和蛋白水平明顯上調(diào)，而銀翹敗毒散能有效降低3 個線粒體基因表達(dá)水平。

5 結(jié)論

本研究使用生物信息學(xué)和機器學(xué)習(xí)算法鑒定了7 種與IVP 和線粒體相關(guān)的生物標(biāo)志物。通過體內(nèi)抗病毒實驗和分子對接技術(shù)研究表明銀翹敗毒散可能通過丁子芽鞣素、原金絲桃素和穗花杉黃酮等活性成分作用于Lactb、Pnpt1和Mthfd2，調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等生物學(xué)過程，并在介導(dǎo)抗IVP 作用中發(fā)揮作用。3個線粒體關(guān)鍵基因Lactb、Pnpt1和Mthfd2在IVP 小鼠肺組織中高表達(dá)，而銀翹敗毒散則能抑制這種高表達(dá)，這可能是銀翹敗毒散治療IVP 的潛在機制之一。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突