劉 妍, 孫圣麟, 洪 雁,3, 顧正彪, 程 力, 陳召桂, 陳 爽
(江南大學(xué)食品學(xué)院1,無錫 214122) (嘉興未來食品研究院2,嘉興 314000) (江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室3,無錫 214122) (浙江五芳齋實業(yè)股份有限公司4,嘉興 314000)
即食米制品具有種類多樣、營養(yǎng)豐富、食用方便等優(yōu)點,成品細(xì)韌軟糯,香甜可口,近些年來受到消費者的廣泛歡迎。米糕的生產(chǎn)也經(jīng)歷多個發(fā)展過程,最初的原料只有大米,隨著米糕種類不斷多元化,制作米糕常用的原料主要有糯米、粳米、秈米、薏米、紫米、小米、黑米等,通過引入不同的加工工藝,逐漸形成了較為穩(wěn)定的米糕制作體系。但由于米糕的主要成分是淀粉,淀粉的回生導(dǎo)致米糕在生產(chǎn)、加工、運輸和銷售的過程中出現(xiàn)黏性變差、老化變硬和儲藏期較短的問題,因此控制淀粉的回生是解決米糕變質(zhì)的有效手段之一[1]。
影響淀粉回生的因素主要有淀粉種類、淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)、添加劑[2]、環(huán)境條件、溶液pH值及無機離子等。Vandeputte等[5]研究發(fā)現(xiàn)支鏈淀粉側(cè)鏈聚合度(DP)在6~9或者大于25,淀粉不容易回生,DP值在12~22之間則會促進回生。Zhang等[6]表明香蕉淀粉因具有含量較高的支鏈淀粉超長鏈(DP>36)導(dǎo)致其回生速度較快。此外,淀粉的分子質(zhì)量分布、鏈長分布、直/支鏈淀粉含量、短/長程有序性及半結(jié)晶層狀結(jié)構(gòu)等也會對回生產(chǎn)生一定的影響。盡管淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)對其回生特性的影響規(guī)律已被廣泛報道,但不同種類淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)與其回生特性之間的關(guān)系深入系統(tǒng)地研究仍較少。
因此,本研究選擇米糕產(chǎn)品中4種具有代表性的米粉(小米、黑米、糯米和粳米)作為研究對象,分別從4種米粉中提取淀粉,再對其精細(xì)結(jié)構(gòu)和回生特性進行研究,明確精細(xì)結(jié)構(gòu)對其回生特性的影響規(guī)律,以期為即食米制品的質(zhì)量控制提供參考。
小米粉、黑米粉、糯米粉及粳米粉,米粉目數(shù)均為60目。
氫氧化鈉、硼酸、濃硫酸、溴化鋰、醋酸鈉等均為分析純;直鏈淀粉試劑盒;異淀粉酶(酶活10 000U/mL,酶學(xué)編號3.2.1.68)。
MS-H-S10多通道磁力攪拌器,RJ-LD-50G低速大容量離心機,StarchMaster 2快速黏度分析儀,TA.XT plus物性分析儀,DISCOVERY DSC 25差示掃描量熱儀,1260 Infinity Ⅱ凝膠滲透色譜,ICS-5000A Plus高效陰離子交換色譜,IS10傅里葉紅外光譜儀,D2 PHASER X射線衍射儀,SAXSpoint 2.0小角X射線散射儀。
1.3.1 米淀粉的提取
參考張杰[7]的方法并略有改動:稱取一定質(zhì)量米粉分散在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.03%NaOH溶液中,以1∶5(m/V)混合,磁力攪拌浸泡24 h。浸泡后多次離心(3 900 r/min,5 min),棄去上清液并刮去最上層和下層沉淀物質(zhì),用去離子水洗滌中間淀粉層數(shù)次后將沉淀放入40 ℃烘箱中干燥24 h,粉碎機粉碎,過100 μm篩得到米淀粉,密封置于干燥器中備用。
1.3.2 組分測定
水分含量測定參照GB 5009.3—2016中直接干燥法;灰分含量測定參照GB 5009.4—2016中總灰分的測定方法,蛋白質(zhì)含量測定參照GB 5009.5—2016中凱氏定氮法;脂肪含量測定參照GB 5009.6—2016中索式抽提法,淀粉含量測定采用Megazyme的總淀粉測定試劑盒,直鏈淀粉含量測定采用Megazyme的直鏈淀粉試劑盒。
1.3.3 回生性質(zhì)測定
1.3.3.1 糊化性質(zhì)
采用快速黏度分析儀(RVA)測定樣品的糊化特性,將淀粉與去離子水在RVA鋁盒中混合均勻,配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%(干基)的懸浮液,以測試程序中的標(biāo)準(zhǔn)1開始測定。通過糊化曲線中的終值黏度和谷值黏度大小判定各種淀粉的回生趨勢。
1.3.3.2 質(zhì)構(gòu)特性
用物性分析儀對淀粉乳進行全質(zhì)構(gòu)分析,配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%的淀粉乳,完全糊化后儲存于鋁盒中,測定第0天和第5天樣品的質(zhì)構(gòu)參數(shù)。測定條件:使用P/25探頭,測前速度為1 mm/s,測試速度為5 mm/s,測后速度為5 mm/s,觸發(fā)力為2 g,下壓距離10 mm。
1.3.3.3 熱力學(xué)性質(zhì)
稱取2.5~3.0 mg淀粉于坩堝中,按照樣品:去離子水質(zhì)量比為1∶3(以濕基計)的比例加入去離子水,放入4 ℃冰箱平衡24 h,以空坩堝為空白對照,使用差示掃描量熱儀(DSC)對樣品進行糊化,測試條件:溫度掃描范圍為30~100 ℃,升溫速率10 ℃/min,氮氣流速為50 mL/min。糊化后的樣品在4 ℃下儲藏14 d后測定其回生性質(zhì),測定條件同糊化測定條件。
1.3.4 相對分子質(zhì)量測定
準(zhǔn)備稱取10 mg樣品于10 mL樣品瓶中,然后放入轉(zhuǎn)子并加入2.0 mL流動相(99.5%DMSO+0.5%LiBr),擰緊瓶蓋并密封。將樣品置于沸水浴中持續(xù)攪拌,并保持微沸狀態(tài),平衡至少12 h。進樣前,樣品須過0.22 μm有機濾膜(黃色濾膜),確保樣品無渾濁。采用1260 Infinity Ⅱ凝膠色譜系統(tǒng)測定,測試條件參考梁尚云[8]的報道并略有改動:柱溫:50 ℃,流速:0.6 mL/min,dn/dc值為0.066 mL/g。
1.3.5 鏈長分布測定
將10 mg淀粉分散于2.0 mL醋酸鈉緩沖液中,沸水浴加熱并持續(xù)攪拌30 min,將樣品置于40 ℃水浴搖床中平衡15 min,然后加入100 μL異淀粉酶反應(yīng)24 h,使淀粉完全脫支;沸水浴30 min終止反應(yīng);冷卻至室溫后,將樣品全部轉(zhuǎn)移至5 mL離心管中,10 000 r/min條件下離心10 min,取適當(dāng)量上清液過0.22 μm濾膜后采用高效陰離子交換色譜(HPSEC-PAD)進行淀粉鏈長分布測定,測試條件參考Ren等[9]的方法。
1.3.6 短程有序性
參考Pourfarzad等[10]的方法采用傅里葉變換紅外光譜儀(FT-IR)測試樣品紅外光譜,利用OMNIC軟件對800~1 200 cm-1進行傅里葉自去卷積處理,設(shè)置條件:半峰寬:20.5 cm-1,增強因子:2,短程有序性為1 045 cm-1/1 022cm-1和1 022 cm-1/995 cm-1的峰強度比值。
1.3.7 結(jié)晶結(jié)構(gòu)測定
采用X射線衍射(XRD)測定,參考焦雪艷等[11]的方法并略有改動,測試條件為:銅靶,管壓30 kV,電流10 mA,步長0.05,掃描速度30(°)/min,衍射角(2θ)掃描范圍為4°~40°。應(yīng)用MDI Jade 6軟件進行數(shù)據(jù)分析。
1.3.8 半結(jié)晶層狀結(jié)構(gòu)測定
配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的淀粉漿,混合均勻,室溫下平衡24 h,空白為純水樣品,用于SAXA分析。測試條件參考Zhang等[12]的方法,波長λ=0.154 0 nm的單色Cu-Kα射線,工作電壓50 kV,功率為30 W,測試時間20 min,測試過程中光學(xué)元件及樣品室均要處于真空狀態(tài)。
1.3.9 數(shù)據(jù)處理
數(shù)據(jù)處理所有實驗均設(shè)置3個平行,實驗數(shù)據(jù)用平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。數(shù)據(jù)作圖用軟件Origin 8.5,數(shù)據(jù)顯著性分析和相關(guān)性分析用軟件SPSS 17.0,通過單因素方差分析(ANOVA),P值低于0.05和0.01分別表示顯著和相當(dāng)顯著的差異;采用皮爾遜相關(guān)和聚類分析。
4種米淀粉的基本組分如表1所示。米淀粉純度最高的是粳米淀粉,總淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達90.59%,最低的是黑米淀粉,總淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為79.61%。這與黑米中富含大量花青素有關(guān)系,在浸泡、反復(fù)洗滌的過程中,色素會摻雜在淀粉層導(dǎo)致部分淀粉的流失[13,14],同時黑米淀粉的脂肪含量和灰分含量均較高。小米淀粉的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,可達0.60%。直鏈淀粉含量相差較大,小米淀粉的直鏈淀粉含量是最高的,比糯米淀粉的直鏈淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)高出10.89%,這與楊夢恬[15]的研究結(jié)果一致。直鏈淀粉的含量很大程度上影響米淀粉的回生特性。在回生的過程中,直鏈淀粉分子的遷移運動使得分子之間能夠平行排布,彼此鏈上的羥基均束縛在非常近的范圍內(nèi),再通過羥基間的氫鍵吸引作用構(gòu)成聚合體,直鏈淀粉含量高,回生速率可能就越大[16]。
2.2.1 糊化特性分析
表2顯示了不同米淀粉糊化特性參數(shù)?;厣禐榻K值黏度和谷值黏度的差值,能夠反映淀粉糊冷卻后的穩(wěn)定性和回生特性,通常作為評價淀粉糊老化程度的指標(biāo),淀粉糊的回生值越大,說明其越容易發(fā)生回生,導(dǎo)致其硬度和韌性相應(yīng)增大。由表2可以看出,4種淀粉的回生值具有較大差異,糯米淀粉的回生值最小,僅有162 mPa·s,而黑米淀粉具有最大的回生值(1 007 mPa·s),這說明黑米淀粉最容易老化、凝膠能力最強。但根據(jù)2.1基本組分中直鏈含量來看,黑米淀粉的直鏈含量低于小米淀粉,這可能因為淀粉回生能力的強弱不僅受直鏈淀粉含量的影響,還會受到淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的影響。終值黏度指的是體系溫度降低后,淀粉分子開始交互相連,此時淀粉糊的黏度為終值黏度[17]。與小米、黑米和粳米淀粉相比,糯米淀粉的終值黏度較小(737 mPa·s),說明短期內(nèi)糯米淀粉分子聚集能力較差,回生速率較慢。

表2 不同米淀粉糊化特性參數(shù)

表3 不同米淀粉凝膠儲藏5 d后質(zhì)構(gòu)參數(shù)
2.2.2 質(zhì)構(gòu)特性分析
隨著儲藏時間的延長,淀粉凝膠的硬度、黏性等指標(biāo)會發(fā)生變化,因此,可以通過測定淀粉凝膠的質(zhì)構(gòu)參數(shù)來反映其回生特性,結(jié)果如表3所示。與儲藏0 d的小米淀粉、黑米淀粉、糯米淀粉和粳米淀粉凝膠相比,儲藏5 d后相應(yīng)米淀粉凝膠的硬度分別增加了42.77%、32.55%、57.46%和80.78%。盡管糯米淀粉凝膠和粳米淀粉凝膠的硬度增長幅度較大,但由于這2種米淀粉凝膠初始硬度較小,導(dǎo)致其儲藏5 d后的凝膠硬度較小。小米淀粉、黑米淀粉和粳米淀粉凝膠儲藏后黏性分別降低了13.15%、33.40%和23.79%,糯米淀粉凝膠的黏性提高了208.07%,糯米淀粉凝膠的黏性增長顯著,且與其他米淀粉相比,糯米淀粉儲藏前后的凝膠硬度均較小,說明其凝膠的質(zhì)地最為柔軟。這是由于直鏈淀粉含量的不同導(dǎo)致形成凝膠時,直鏈淀粉含量越多,淀粉分子間的交聯(lián)程度越大,因此形成的凝膠硬度會較大。因此,與其他米淀粉相比,小米淀粉更容易發(fā)生回生,而糯米淀粉的抗回生性能較好。
2.2.3 熱力學(xué)性質(zhì)分析
DSC法可以測定淀粉回生的趨勢[18],不同米淀粉儲藏14 d后的熱力學(xué)參數(shù)如表4所示。經(jīng)過14 d儲藏后,4種已經(jīng)糊化的米淀粉表現(xiàn)出不同的回生趨勢,熱焓值從大到小為:小米淀粉>黑米淀粉>粳米淀粉>糯米淀粉,熱焓值與淀粉回生程度呈正相關(guān)。所以小米淀粉的回生程度最大,糯米淀粉的熱焓值為0.74 J/g,遠(yuǎn)低于其他3種米淀粉的熱焓值,說明糯米淀粉回生程度較低,糊化過程解開雙螺旋所需要的能量少,淀粉顆粒結(jié)構(gòu)與其他3種米淀粉相比不緊密,在相轉(zhuǎn)變的過程中所需要的能量較小。

表4 不同米淀粉儲藏14 d后的熱力學(xué)參數(shù)
不同米淀粉的重均相對分子質(zhì)量(Mw)如表5所示。4種米淀粉中粳米淀粉的支鏈淀粉Mw最大(2.33×107g/mol),最小的是糯米淀粉的支鏈淀粉Mw(1.61×107g/mol)。直鏈淀粉含量對相對分子質(zhì)量有一定的影響。直鏈含量的高低影響著淀粉回生的程度,大部分研究顯示兩者呈正相關(guān)趨勢。根據(jù)表1來看,4種米淀粉中小米淀粉直鏈含量最高,結(jié)合凝膠滲透色譜(GPC)參數(shù)來看,小米淀粉的重均分子質(zhì)量不是最大的,這說明回生不僅受到相對分子質(zhì)量的影響,還會受到其他精細(xì)結(jié)構(gòu)的影響。

表5 不同米淀粉的重均相對分子質(zhì)量
表6為不同米淀粉的支鏈淀粉鏈長分布信息。按照鏈長的不同,將支鏈淀粉側(cè)鏈分為四個部分,分別是A鏈(6

表6 不同米淀粉的鏈長分布/%
紅外光譜中1 045 cm-1/1 022 cm-1和1 022 cm-1/995 cm-1的峰強度比值能夠反映淀粉顆粒的短程有序性,結(jié)果如表7所示。1 045 cm-1/1 022 cm-1的比值越大或1 022 cm-1/995 cm-1的比值越小,表明淀粉顆粒表面有序度越高。從表7可知,小米淀粉的1 045 cm-1/1 022 cm-1比值最大,且1 022 cm-1/995 cm-1比值最小,說明小米淀粉的表面有序度最高。有研究認(rèn)為,支鏈淀粉分子中長鏈會形成較長的螺旋結(jié)構(gòu),同時會使鏈之間的氫鍵結(jié)合更牢固,易發(fā)生重新結(jié)晶,而較短的支鏈形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,不易重新結(jié)晶[22]。黑米、糯米和粳米淀粉的中長鏈占比較低,因此,這3種米淀粉形成的雙螺旋穩(wěn)定性較差,其顆粒表面有序度較低,導(dǎo)致其不容易發(fā)生回生現(xiàn)象。

表7 不同米淀粉短程分子有序度及相對結(jié)晶度
不同米淀粉的X-射線衍射圖譜如圖1所示,從圖中可以看出,4種米淀粉均表現(xiàn)出典型的A型衍射峰,分別在15°、17°、18°和23°(2θ)處有明顯的衍射峰。由表7可以看出,小米淀粉的相對結(jié)晶度最大(29.12%),黑米淀粉的相對結(jié)晶度最小(23.41%)。通過比較發(fā)現(xiàn),本實驗所用4種米淀粉測得的直鏈淀粉含量與相對結(jié)晶度沒有明顯的線性關(guān)系,但有報道認(rèn)為,淀粉的相對結(jié)晶度隨著直鏈淀粉含量的增加而減小,這說明淀粉的相對結(jié)晶度除了受其直/支比的影響,還可能受到其他結(jié)構(gòu)特性的影響。有研究發(fā)現(xiàn),鏈長分布對結(jié)晶度大小也會產(chǎn)生一定的影響。Shevkani等[23]認(rèn)為DP>13的鏈占比大時,淀粉容易形成較穩(wěn)定的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。根據(jù)支鏈淀粉鏈長分布的分析結(jié)果(表6),當(dāng)?shù)矸鄯肿又械闹虚L鏈占比高時(DP>13),淀粉容易發(fā)生回生現(xiàn)象,所以推斷當(dāng)?shù)矸鄣闹虚L鏈占比較高時,形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定,淀粉分子的表面有序性和相對結(jié)晶度更高;反之,當(dāng)?shù)矸鄣闹虚L鏈占比較低時,表面有序度和相對結(jié)晶度高的淀粉分子也易發(fā)生回生。

圖1 不同米淀粉的X-射線衍射圖譜
小角衍射可以對不同米淀粉的層狀結(jié)構(gòu)進行分析,表8和圖2分別為不同米淀粉的SAXS參數(shù)和散射曲線。將4種米淀粉的SAXS雙對數(shù)曲線中低角度散射矢量區(qū)進行回歸擬合,得到的α值如表8所示。小米淀粉為質(zhì)量分形,黑米、糯米和粳米淀粉為表面分形,且糯米和粳米淀粉的α值更大。表面分形的半結(jié)晶結(jié)構(gòu)比質(zhì)量分形的半結(jié)晶結(jié)構(gòu)更緊密,有序化程度更高,因此黑米、糯米和粳米的半結(jié)晶結(jié)構(gòu)比小米淀粉的更加緊密有序,緊實有序的結(jié)構(gòu)可能會不容易發(fā)生回生。散射峰形狀與半結(jié)晶結(jié)構(gòu)有關(guān),峰形越尖銳,半結(jié)晶結(jié)構(gòu)越明顯;散射峰強度與雙螺旋結(jié)構(gòu)排列有關(guān),強度越大,雙螺旋排列的一致性越好[25]。根據(jù)圖2來看,4種米淀粉的峰尖銳程度相似,說明半結(jié)晶結(jié)構(gòu)的完整性相似;糯米和粳米淀粉的峰強度更大,表示二者的雙螺旋結(jié)構(gòu)一致性更好,雙螺旋一致性好的淀粉抗回生性能較好。

表8 不同米淀粉的SAXS參數(shù)

圖2 不同米淀粉的SAXS曲線
淀粉顆粒是由結(jié)晶區(qū)和無定型區(qū)交替排列組成的半結(jié)晶聚合物,SAXS技術(shù)便可用來分析其半結(jié)晶結(jié)構(gòu)特征。根據(jù)Woolf-Bragg公式:d=2π/q,可以得到淀粉顆粒的半結(jié)晶層厚度d。根據(jù)表8可知,小米淀粉半結(jié)晶層厚度d最大,達到6.978 4 nm,黑米淀粉其次,糯米淀粉和粳米淀粉的差距不明顯。薛薇[26]表明直鏈淀粉含量對半結(jié)晶層厚度有一定影響,隨著直鏈淀粉含量的增加,半結(jié)晶層厚度也呈增加的趨勢,表1和表8的結(jié)果顯示出,本實驗選取的4種米淀粉符合該規(guī)律??梢酝茰y,淀粉的半結(jié)晶層厚度增加,淀粉易發(fā)生回生現(xiàn)象。

圖3 各指標(biāo)間相關(guān)性分析熱圖
對淀粉回生及結(jié)構(gòu)指標(biāo)進行了相關(guān)性分析和聚類分析,結(jié)果如圖3所示,米淀粉的各個指標(biāo)之間存在著不同程度的相關(guān)性,紅色表示指標(biāo)之間呈正相關(guān),藍色表示呈負(fù)相關(guān),色塊越小顏色越淡表示相關(guān)性越小。本實驗將回生值、終值黏度和熱焓值作為回生性質(zhì)的評定指標(biāo),根據(jù)圖3可以看出,回生值、終值黏度和熱焓值與直鏈淀粉含量、支鏈淀粉峰Mw、B1鏈含量、相對結(jié)晶度、d值呈正相關(guān),與A鏈含量、q值、α值呈負(fù)相關(guān)。這表明當(dāng)?shù)矸壑兄辨湹矸酆扛摺⒅ф湹矸鄯錗w數(shù)值大、B1鏈含量高、相對結(jié)晶度大、d值較大時,淀粉會更加容易發(fā)生回生現(xiàn)象,且熱焓值與直鏈淀粉含量的相關(guān)性系數(shù)為0.995,直鏈淀粉含量對淀粉回生的影響較大。聚類結(jié)果顯示,不同精細(xì)結(jié)構(gòu)的指標(biāo)參數(shù)被聚為3類,第一類為相對結(jié)晶度、B1鏈含量、短程有序性、B3鏈含量、B2鏈含量、直鏈淀粉含量、熱焓值和d值;第二類為支鏈淀粉峰Mw、回生值和終值黏度;第三類為α值、q值、A鏈含量和直鏈淀粉峰Mw。依據(jù)本實驗分析的相關(guān)性和聚類分析,后續(xù)可以根據(jù)淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)的特征來推測淀粉回生程度的大小。
通過回生性質(zhì)測定的現(xiàn)象,研究淀粉精細(xì)結(jié)構(gòu)如何影響米淀粉回生特性。實驗結(jié)果表明:回生性質(zhì)顯示黑米、小米淀粉表現(xiàn)出較強的回生能力,糯米、粳米淀粉較弱?;厣F(xiàn)象的不同證明精細(xì)結(jié)構(gòu)與回生性質(zhì)聯(lián)系緊密。小米和黑米淀粉的直鏈含量高,支鏈淀粉峰Mw較大、半結(jié)晶層狀結(jié)構(gòu)松散且厚度較厚,進而導(dǎo)致分子間容易聚集重排發(fā)生回生現(xiàn)象;中長鏈含量占比高保證形成的雙螺旋較為穩(wěn)定的同時也提高了表面有序性和相對結(jié)晶度,回生后形成的分子更穩(wěn)定,具體表現(xiàn)為二者的回生值、硬度和熱焓值偏大。而粳米淀粉和糯米淀粉直鏈淀粉含量低,短鏈占比高,相對不容易回生且糯米淀粉回生值、硬度和熱焓值都較低,具有良好的抗回生性能。相關(guān)性分析結(jié)果顯示出淀粉回生程度與直鏈淀粉含量、支鏈淀粉峰Mw、B1鏈含量、相對結(jié)晶度和d值呈正相關(guān),淀粉的回生是一個受到多種因素影響的過程,未來可以探索更多精細(xì)結(jié)構(gòu)如何影響回生及回生機理,為淀粉回生的研究提供更多的參考。