突變型α突觸核蛋白對大鼠皮質神經元原代培養存活率的影響

王 鵬 許 潔 安恩訓 于 順 何 欣

(北華大學醫學院基礎醫學院人體解剖學教研室，吉林 吉林 132013)

黑質多巴胺能神經元發生變性壞死，以及路易小體(Lewy body)和路易軸索(Lewy neurite)的形成〔1，2〕是帕金森病(PD)的主要病理特征。α－突觸核蛋白(Syn)的變性聚集是參與形成淀粉樣變性的主要成分，主要分布于突觸前膜和核膜〔3，4〕。Syn與微管蛋白之間存在分子伴侶關系。體外實驗證明，α－Syn能夠促進微管蛋白的聚合，加速微管的形成〔5〕。在PD患者腦中，α－Syn被證明與 α－tubulin、tau蛋白以及 MAP1B共存于 Lewy body中〔6，7〕，但其生理功能仍未完全清楚。一些家族性 PD患者的 α－Syn基因中第88位堿基發生G－C突變，導致氨基酸序列第30位丙氨酸(Ala)變成脯氨酸(Pro)(A30P);另有第209位核苷酸發生了G－A突變，使氨基酸序列中第53位丙氨酸(Ala)變成蘇氨酸(Thr)(A53T)。突變的α－Syn A53T和A30P出現生理功能異常，在PD發病過程中起著重要的作用。本研究旨在觀察A53T和A30P對原代培養神經元存活率的影響，進一步明確突變體α－Syn的生理功能，為揭示二者導致家族性PD發病的機制提供線索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM(F－12)細胞培養基，購自 GIBCO公司;BCA蛋白質定量試劑盒BCA Protein Assay Kit，購自寶生物;α－Syn單克隆抗體3D5，由宣武醫院老年病研究所神經生物研究室制備;FITC標記的羊抗鼠抗體，購自中衫公司;蛋白分子量Marker，購自Pharmacia;胎牛血清(FBS)和馬血清(HS)，購自HyClone。其他均為化學分析純試劑。

1.2 實驗動物 新生24 h的Wistar大鼠40只，雌雄不限，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，許可證號:SCXK－(軍)。

1.3 實驗方法

1.3.1 重組蛋白的克隆與純化 將α－Syn和家族性突變體A53T、A30P的cDNA分別插入pET(3a)，然后轉至BL21(DE3)中，在含氨芐西林的YTA培養基中培養，誘導表達。所表達的基因重組型蛋白采用離子交換層析和反向層析法純化。純化后的蛋白用SDS－PAGE法鑒定，BCA法定量。

1.3.2 原代神經元培養 將新生24 h的大鼠斷頭取腦，置于D－Hank緩沖液中，剝凈血管腦膜。剝離皮質與髓質，剪成若干小塊。胰酶消化45 min后吹散，200目篩網過濾。800 r/min離心2 min。棄上清，細胞沉淀用DMEM培養基混勻，細胞計數。以每皿0.75×105個的密度接種在用多聚賴氨酸包被的培養皿中培養。加入相應蛋白分組，進行觀察。

1.3.3 神經元培養觀察 培養至第1、2、4小時，向培養皿中添加終濃度為1%的戊二醛，固定1 h。隨機挑選30個視野，每視野有5個以上神經元。10×40光鏡下觀察，照片分辨率1 300×1 030，TIF格式。

1.3.4 Western印跡法和免疫熒光法鑒定α－Syn的作用 培養至觀察時間，吸棄培養皿中的培養基，PBS沖洗，刮下細胞。功率200 W，2次30 s超聲破碎。破碎后的溶液加入SDS－PAGE上樣緩沖液，沸水中煮5 min。4℃，12 000 r/min，離心20 min。棄沉淀，取30 μl上清作為樣品，進行SDS－PAGE電泳。電泳結束后轉膜，封閉。沖洗后，以1∶1 000比例稀釋的3D5抗體反應過夜。洗膜，加入1∶5 000稀釋的生物素標記的羊抗鼠抗體溶液反應。沖洗后，ECL法顯示條帶并鑒定結果。

培養細胞固定，沖洗培養皿。以含10%羊血清的PBST封閉1 h。棄封閉液，加入1∶5 000稀釋的3D5抗體1.5 ml，4℃過夜。PBST沖洗，加入1∶500稀釋的 FITC標記羊抗鼠抗體，37℃，2 h;吸棄反應液，PBST沖洗。熒光顯微鏡下觀察并鑒定結果。

1.3.5 培養分組方案 向原代神經元培養基中添加終濃度為20 μmol/L 的 α－Syn、突變型 A53T、A30P 和 BSA，培養至第1、2、4小時觀察。分別添加終濃度為20、40、60 μmol/L的相應蛋白，培養至4 h，觀察突起長度變化。

1.4 統計學方法 采用SPSS12.0軟件，所有數據均進行正態性檢驗。數據以±s表示，多組樣本均數比較采用方差分析，兩組比較采用t檢驗。兩變量的相關分析采用Bivariate過程的Pearson直線相關法。

2 結果

2.1 重組蛋白純化鑒定結果 SDS－PAGE鑒定，經純化得到純度較高的 α－Syn 和 A53T、A30P，見圖1。

圖1 蛋白純化后SDS-PAGE電泳圖

圖2 α-Syn和其突變體A53T、A30P對神經元存活率的影響

2.2 α－Syn、A53T和A30P對原代培養神經元存活率的影響見圖2。培養至1、2 h，添加α－Syn組的神經元數目大于對照組(P＜0.05)，A53T組和A30P組與對照組無差異(P＞0.05)。培養至4 h，α－Syn組存活神經元數目明顯大于對照組(P＜0.01)，A53T組和A30P組與對照組之間無差異(P＞0.05)。添加不同濃度的蛋白，α－Syn組神經元存活率隨濃度增加而增加，而A53T組和A30P組無變化。α－Syn從培養基進入神經元細胞內，A53T和A30P不能進入神經元。Western印跡結果顯示α－Syn組神經細胞裂解液呈清晰條帶，為陽性;A30P、A53T和對照組均為陰性(圖3A)。免疫熒光實驗結果顯示α－Syn神經元顯色為陽性，對照組、A53T和A30P組不顯色，為陰性(見圖3B)。

圖3 外源α-Syn、A53T和A30P在神經元內的表達

3 討論

Sung等發現α－Syn抑制H19－7大鼠海馬神經祖細胞的增殖〔8〕。本實驗結果顯示，在原代神經元培養初期(4 h內)，α－Syn提高原代培養神經元的存活率，而A53T和A30P對神經元生長無影響。原代培養的神經元在培養皿以貼壁方式生長。生長初期，微管在神經細胞的軸突和樹突中起支撐作用，幫助突起生長。突起復發出對神經元貼壁起關鍵作用。有研究證明，α－Syn有與tau蛋白相似，可以促進微管蛋白合成微管〔9〕。通過促進微管的合成，α－Syn可幫助神經元突起的生長，提示α－Syn很可能參與神經系統早期發育階段神經元突起的形成以及中樞神經系統損傷后的修復。α－Syn提高原代培養神經元的存活率與這一作用也密切相關。而A53T和A30P對神經元生長無影響，可能與其發生家族性突變有關。正常α－Syn蛋白分子含有穿梭序列，該序列能夠介導 α－Syn穿過細胞膜〔10，11〕。而30和53位氨基酸的突變導致α－Syn的構象改變不能進入神經元，失去提高神經元存活率的能力。家族PD患者由于發生α－Syn的突變，可能影響微管的合成和有序排列，致使神經元軸漿轉運紊亂或修復和重建障礙，導致細胞間或細胞內無定形物形成聚集，發生多巴胺能神經元死亡。此研究結果為揭示α－Syn突變型A53T和A30P的生理功能及其與微管蛋白的關系提供了新證據，對揭示α－Syn突變導致神經元退行性死亡的機制具有重要意義。

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