基于不同種源的三葉青化學成分及抗氧化能力對比分析
——以浙江省杭州市富陽區(qū)為例

陳喜根，孫晗靖，楊麗君，繆強，朱羅妹，蔡曉郡*

(1.杭州市富陽區(qū)富春街道區(qū)域發(fā)展與治理中心，浙江 杭州 311402；2.杭州市富陽區(qū)農業(yè)農村局，浙江 杭州 311400；3.浙江理工大學，浙江 杭州 310018；4.杭州市富陽區(qū)場口鎮(zhèn)區(qū)域發(fā)展與治理中心，浙江 杭州 311411)

三葉青學名三葉崖爬藤(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)，浙江省杭州市富陽區(qū)在三葉青資源馴化選育和種植過程中，于2020—2022年對區(qū)內發(fā)現(xiàn)的5個三葉青種源集中至春江街道石硃塢基地開展農藝性狀評價(編號為石硃1～5號)，觀察總體長勢旺盛表現(xiàn)為分枝多、密，對比區(qū)內各種源農藝性狀表現(xiàn)出一定差異[1]，塊根以灰棕色—棕色為主(3號棕褐色)；莖大都圓形，近根部莖基本為明顯紫(褐)色(3號為綠色)；塊根多長橢圓形或長條形(2號為短橢圓形或顆粒狀)，直徑或粗壯程度按大小依次為1號(1.667±0.571 cm)>3號(1.388±0.433 cm)>2號(1.172±0.400 cm)>4號(0.750±0.467 cm)>5號(0.786±0.341 cm)；塊根表面大多光滑(2號有皺縮現(xiàn)象)，表現(xiàn)出不等瘤狀突起(5號無瘤狀突起)；1、2、3、5種源還表現(xiàn)出須根發(fā)達現(xiàn)象。為進一步了解區(qū)內各種源的活性成分，以總黃酮、總多酚、多糖含量及UPLC-Q-TOF-MS/MS成分分析、DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力為評價指標[2]對上述5個種源進行檢測，為富陽區(qū)內三葉青種質資源分類、保存、鑒定及評價提供基礎數(shù)據(jù)支撐。

1 試驗與方法

1.1 原材料處理及干燥處理方式

2020—2022年在浙江省杭州市富陽區(qū)內開展農藝性狀評價的5個(編號石硃1～5號)三葉青種源，栽培年份、環(huán)境均一致。取各種源新鮮三葉青塊莖，流水清洗干凈、瀝干后，分為100 g每份，置于室內陰干，每隔3 h翻動一次，陰干150 h左右后切成1～2 mm片狀；進行真空冷凍干燥處理至恒重(含水量12%左右)。干燥后樣品用LG-01高速中藥粉碎機研磨成粉末，過60目篩(孔徑0.25 mm)，裝袋密封，置干燥密閉容器中備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 總多糖含量的測定

標準曲線的繪制：精密稱取無水葡萄糖50.00 mg，置于50 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，吸取2 mL配制濃度為0.100 mg·mL-1的對照品溶液。量取對照品溶液，配置不同濃度，分別置10 mL具塞試管中，各加水補至1 mL，精密加入5%的苯酚溶液1 mL，搖勻，再精密加硫酸5 mL，各加水補至10 mL搖勻，在490 nm處測定吸收度，以濃度C(mg·mL-1)為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為A=0.436 7C+0.066(R2=0.999 3)，結果顯示，無水葡萄糖在0.02～0.12 mg·mL-1內有良好線性關系。

樣品制備和總多糖含量測定：精密稱取0.500 g三葉青粉于50 mL容量瓶中，加40 mL水，沸水水浴2 h，冷卻定容至刻度，離心10 min(6 000 r·min-1)，精密取上清液5 mL，加入無水乙醇20 mL，4 ℃下靜置過夜，離心5 min，棄上清液，沉淀用80%乙醇洗滌后，離心5 min并棄上清液，重復3次，沉淀用水溶解定容至25 mL。精密量取供試品溶液1 mL于10 mL容量瓶中，顯色處理，在490 nm處測定吸收度，計算三葉青多糖的含量。

1.2.2 總黃酮含量的測量

標準曲線的制備：精密稱取蘆丁標準品5.00 mg，加適量70%乙醇溶解，定容至200.0 μg·mL-1的標準溶液，分別吸取蘆丁標準溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加10%AlCl3溶液0.3 mL搖勻，放置6 min，再加4%NaOH溶液4.0 mL，用70%乙醇定容至刻度，搖勻放置15 min，于500 nm處測定吸光度，繪制標準曲線。得回歸方程為A=6.735 2C-0.010 3(R2=0.999 4)，結果顯示，蘆丁在0.01～0.09 mg·mL-1內有良好線性關系。

樣品制備和總黃酮含量測定：精密稱取0.500 g三葉青粉，置25 mL具塞三角瓶中按1∶25料液比加入70%乙醇溶液12.5 mL，超聲提取2次，每次超聲溫度為60 ℃，時間為25 min，合并提取液，離心，取上清液測定總黃酮含量。取0.1 mL樣品于10 mL容量瓶中，顯色處理，于500 nm處測定吸光度，計算三葉青總黃酮的含量。

1.2.3 總多酚含量的測定

標準曲線的繪制：準確稱取10 mg沒食子酸，加蒸餾水溶解定容至100 mL，依次吸取該溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于50 mL容量瓶中，加入2.5 mL福林試劑，混勻，加入5 mL飽和Na2CO3溶液定容，混勻，常溫避光放置顯色30 min，于760 nm處測定吸光度，繪制標準曲線。得回歸方程為A=78.419C+0.029 8(R2=0.999 3)，結果顯示，蘆丁在0.01～0.07 mg·mL-1內有良好線性關系。

樣品制備和多酚含量測定：精密稱取0.500 g三葉青粉，置25 mL具塞三角瓶中按1∶25料液比加入70%乙醇溶液12.5 mL，超聲提取2次，每次超聲溫度為60 ℃，時間為25 min，合并提取液，離心，取上清液測定總多酚含量。吸取0.1 mL于10 mL容量瓶中，顯色處理，760 nm處測定吸光度值。

1.2.4 UPLC-Q-TOF-MS/MS成分分析

精密稱定樣品粉末0.1 g，加入5 mL 70%甲醇，精密稱定，超聲破碎45 min，取出，放冷，然后于10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，用0.22 μm疏水PTFE濾頭進行過濾，即得供試品溶液，重復5次。

安捷倫BEHC18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；0.1%甲酸水溶液(A)-100%乙腈溶液(B)，梯度洗脫(0～1 min，5%B；1～3 min，5%～10%B；3～6 min，10%～20%B；6～16 min，20%～70%B；16～20 min，70%～100%B)；設置流量為0.3 mL·min-1，儀器柱溫30 ℃，200～600 nm為檢測波長；供試品溶液進樣量為2 μL。采用電噴霧電離；去溶劑氣體：氮氣；碰撞氣體：氬氣；全掃描：50至1 200 da，源溫度：120 ℃，去溶劑溫度：450 ℃，錐電壓：25 V，鎖定噴霧標準：400 ng·mL-1，檢測供試品，所有數(shù)據(jù)均由MassLynx4.1(Waters.MA.USA)軟件收集。

1.2.5 DPPH自由基清除能力的測定

精密稱取0.300 g三葉青粉，置25 mL具塞三角瓶中按1∶25料液比加入70%乙醇溶液7.5 mL，超聲提取2次，每次超聲溫度為60 ℃，時間為25 min，合并提取液，離心，乙醇定容至30 mL。取樣液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于試管中，加乙醇補齊至1 mL，陽性對照精密稱取VC0.1 g，用乙醇定容至10 mL容量瓶，得到濃度為10 mg·mL-1的VC原溶液，稀釋不同濃度，加入DPPH乙醇溶液1 mL混合均勻，避光反應90 min，517 nm下的吸光度值，記做Ai，對照以無水乙醇代替DPPH溶液，測量吸光度，記做Aj，標準組用1 mL DPPH溶液與1 mL乙醇混合均勻，記做A0，進行3次平行實驗。按如下公式計算供試品的自由基清除率：

DPPH清除率(%)=1-(Ai-Aj)/A0×100%。

1.2.6 ABTS自由基清除能力的測定

精密稱取0.500 g三葉青粉，置25 mL具塞三角瓶中按1∶25料液比加入70%乙醇溶液12.5 mL，超聲提取2次，每次超聲溫度為60 ℃，時間為25 min，合并提取液，離心，乙醇定容至50 mL。取樣液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，加乙醇補齊至1 mL。陽性對照精密稱取VC0.1 g，用乙醇定容至10 mL容量瓶，得到濃度為10 mg·mL-1的VC原溶液，稀釋不同濃度，加入ABTS溶液2 mL混合均勻，避光反應90 min，734 nm下的吸光度值，記做Ai，對照以無水乙醇代替ABTS溶液，測量吸光度，記做Aj，標準組用1 mL ABTS溶液與1 mL乙醇混合均勻，記做A0，進行3次平行實驗。按如下公式計算供試品的自由基清除率：

ABTS清除率(%)=1-(Ai-Aj)/A0×100%。

2 結果與分析

2.1 區(qū)內各種源主要成分含量分析

富陽區(qū)內各三葉青種源均含有較豐富的多糖、黃酮和總酚含量，但不同種源間成分含量差異較大(表1)，發(fā)現(xiàn)石硃1、4、5號總多糖、總黃酮、總酚類含量明顯高于石硃2、3號，由于試驗在相同環(huán)境栽培下種植取樣，可能各種源在各自生長環(huán)境溫度、光照、土壤、水質等因素影響下，不僅外觀農藝性狀出現(xiàn)差異，在內含成分生成機制上亦出現(xiàn)差異，因此，在相同栽培環(huán)境條件下將對各種源具體成分差異開展進一步試驗研究。

表1 富陽區(qū)不同種源三葉青內含主要成分含量測定Table 1 Determination of the content of main components in Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg from different provenances in Fuyang District 單位：μg·g-1

通過甲醇提取開展細胞水平初步抗癌實驗得知，富陽石硃各品種1～5號IC50值為543.3、415.2、824.5、264.1、1 679 μg·mL-1，得到的石硃1～4號回歸曲線趨勢較好(石硃5號數(shù)值明顯超出其余各種源有待試驗校正)，說明區(qū)內各三葉青種源對癌癥細胞均有一定抑制作用，但本文結果僅根據(jù)實驗數(shù)據(jù)初步分析，有待再次開展試驗以校正研究結果。

2.2 UPLC-Q-TOF-MS/MS成分分析

從圖1中可以看出石硃1～5號的化學輪廓大體一致，石硃5號的成分種類表現(xiàn)更為豐富，石硃2、3號成分種類略偏少。

圖1 石硃1～5號UPLC-Q-TOF-MS/MS的總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of UPLC-Q-TOF-MS/MS for Shizhu 1-5

經(jīng)過鑒定，可知只有石硃1號在保留時間為3.402時鑒定得到的化合物為vanillic acid-1-O-apiofuranosyl glucose ester，為黃酮類化合物。石硃1、4、5號保留時間為6.417時鑒定到的化合物為kaempferol-3-O-furanose-7-O-rhamnosylglucoside，為黃酮類化合物。只有石硃5號中在保留時間為7.078時鑒定得到的化合物，為isoorientin-2″-O-rhamnoside，黃酮類化合物(表2)?？芍p1～5號富含黃酮類化合物，以石硃5號中所含的黃酮類化合物最為豐富。

表2 UPLC-Q-TOF-MS/MS成分鑒定結果Table 2 UPLC-Q-TOF-MS/MS component identification results

2.3 DPPH及ABTS自由基清除能力對比

結果見表3，在同一濃度(1.5 mg·mL-1)下，區(qū)內不同種源三葉青對 DPPH、ABTS自由基的清除能力大小為石硃4號>石硃5號>石硃1、2號>石硃3號。石硃4號抗氧化能力遠遠高于其余4個種源，DPPH自由基清除能力是石硃3號的3.05倍，ABTS自由基清除能力是石硃3號的4.63倍。

表3 富陽區(qū)不同種源三葉青自由基清除能力的測定結果Table 3 Measurement results of free radical scavenging ability of different provenances of Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg in Fuyang District 單位：%

3 結論

黎穎菁等[2-8]對三葉青種質多樣性與栽培管理研究均表明，不同產地、種質三葉青塊根總黃酮含量等存在顯著差異，本試驗通過不同種源間三葉青中活性成分總黃酮、多糖、總多酚含量及DPPH、ABTS自由基清除能力對比，發(fā)現(xiàn)石硃1、4、5號總多糖、總黃酮、總酚含量明顯高于石硃2、3號；但DPPH、ABTS自由基清除能力以石硃4、5號為好。試驗基本證明了抗氧化性能與活性成分含量試驗結果相似，可能因為抗氧化性能與樣品中活性物質含量、組成和濃度有關[9]，同時不同三葉青種源內含成分存在差異亦表明遺傳育種上有較大的潛力。三葉青種質遺傳多樣性解釋了其藥效成分的巨大差異[10]，作為浙江省三葉青道地產區(qū)的富陽要加強種質多樣性保護，對新發(fā)現(xiàn)的小葉紫藤、易成型結塊、塊根葫蘆型三葉青種源開展種質資源評價及株系選育馴化，進一步篩選出總黃酮等活性成分高、塊根產量優(yōu)、抗病性好的富陽特色種質資源，為三葉青種質資源分類、保存及生產品質提升提供科技支撐。