延邊地區一株野生羊肚菌的鑒定及其馴化栽培研究

崔林虎 孫闖 張鵬 姜立佳 趙麗

延邊地區一株野生羊肚菌的鑒定及其馴化栽培研究

崔林虎 孫闖 張鵬 姜立佳 趙麗*

（延邊林業科學研究院，吉林 延吉 133001）

以延邊地區一株野生羊肚菌資源為研究對象，母種分離后采用分子生物學鑒定法明確其品種，并設計6個母種培養基配方、14個原種培養料配方、8個外源營養瓶配方、7個栽培基質配方，篩選其母種、原種、外源營養瓶及栽培的適宜基質。鑒定結果顯示，該野生菌株“23-1”為六妹羊肚菌。配方篩選試驗結果表明，“23-1”母種培養適宜PDA培養基，菌絲生長快、長勢強，接種后96 h即出現菌核；原種培養料以13號配方（硬雜木屑38%、麥粒40%、麥麩10%、草炭土10%、生石灰1%、石膏1%）菌絲生長表現好，接種后15天滿袋，菌絲粗壯；外源營養瓶配方中麥粒所含比例高，表現菌絲長勢強、滿瓶時間長，綜合考慮原基形成時間及產量，適宜配方為麥粒50%～60%、硬雜木屑29%～39%、草炭土0～10%、生石灰1%；栽培基質各配方出菇時間接近，平均產量以6號配方（園土88%、珍珠巖10%、生石灰2%）顯著高于其他處理，為107.46 g/筐。

延邊地區；羊肚菌；馴化栽培；外源營養瓶；栽培基質

羊肚菌（spp.）隸屬于子囊菌門（Ascomycota）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌屬（），又名羊肚菜、羊肚蘑等，因其菌蓋呈羊肚狀而得名[1]。羊肚菌子實體肉質脆嫩、味道鮮美，含有豐富的蛋白質、大量人體必需氨基酸和維生素，而高含量的鋅、鐵以及多種礦質元素是其有別于其他藥用菌的重要特征[2-3]。在我國，明代的《本草綱目》中記載羊肚菌“甘寒無毒，益腸胃，化痰利氣”[4]。羊肚菌性平，味甘寒，無毒，具有益腸胃、消化助食、補腦、提神等功能，其有機鍺含量較高，食用后可強身健體、預防感冒、增強人體免疫力，此外還具有抗氧化、降血脂和抗腫瘤等功效[5-7]，在國內外市場上備受歡迎。

目前，已有較多研究報道羊肚菌的種屬問題[8]、營養特性問題[9]、生活史[10]、藥用價值[11]等。其馴化栽培一直以來是國內外學者致力于解決的問題，至今已有130余年的歷史。前期主要以野外播種、模擬自然環境出菇的仿生栽培、菌根化仿生栽培、林下仿生栽培等為主[12]。2000—2010年期間，川渝地區的羊肚菌大田栽培在“外源營養袋”技術和“易出菇品種”的支撐下逐漸成熟[13]，栽培面積逐年增加，2018—2019年栽培季面積達14 萬畝（1畝≈ 667 m2），栽培區域遍布除海南之外的全國各地[14]。然而，由于羊肚菌菌種退化、連作障礙、環境條件等原因，導致每年有70%的種植者無法穩定盈利[15]，嚴重制約了羊肚菌產業的健康發展。

本研究以延邊地區一株野生羊肚菌為研究對象，分離純培養菌種，進行分子生物學鑒定。在此基礎上，篩選其母種、原種、外源營養瓶及栽培基質的適宜配方，進行羊肚菌設施栽培，為延邊地區羊肚菌科學規范栽培提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌株：羊肚菌菌株23-1，為采自吉林省琿春市的野生羊肚菌經組織分離獲得，保存于延邊林業科學研究院中心實驗室。

培養基：PDA、PDB培養基，購于美國BD公司（Becton，Dickinson and Company）。

主要試劑：Ezup真菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工），DNA凝膠回收試劑盒、Dream Taq-TM DNA Polymerase、DNA marker、瓊脂糖等。

1.2 儀器與設備

水浴鍋、電熱鼓風干燥箱、醫用離心機、電子天平、移液器等。

1.3 試驗方法

（1）分子生物學鑒定。使用 Ezup真菌基因組DNA抽提試劑盒，依據說明書提取標本基因組DNA，對其內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）片段進行PCR擴增。PCR反應程序為95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火復性30 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環，最后72 ℃延伸10 min 4 ℃保溫。將PCR產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結果在NCBI數據庫（http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行BLAST（basic local alignment search tool）比對分析。

（2）母種培養基配方篩選。設6個母種培養基配方（表1），按配方配制培養基制作培養皿，分別取直徑6 mm經鑒定的羊肚菌菌株23-1的菌絲塊接種于不同培養基中，20 ℃暗培養。每處理設3次重復，分別記錄接種后48 h、60 h的菌落直徑，并實時觀察菌落形態、顏色，菌核形成時間、數量及形態等。

（3）原種培養料配方篩選。設14個原種培養料配方（表2），培養料按配方配制，裝入17 cm×33 cm的聚丙烯菌種袋中，每袋裝濕料1 kg，滅菌、冷卻后接入菌株23-1母種，20 ℃暗培養。每處理設3次重復，統計接種后5天和15天的菌絲生長量，計算菌絲生長速度，并實時觀察菌絲長勢、顏色、滿袋時間等。

表1 母種培養基試驗配方

表2 原種培養料試驗配方（%）

注：培養料含水量均為60%。

（4）外源營養瓶配方篩選。設8個外源營養瓶培養料配方（表3），每處理設3次重復。培養料按配方配制，裝入200 mL玻璃瓶（直徑68 mm、高度90 mm、口徑50 mm）中，每瓶裝料130 g，滅菌冷卻后開蓋，扣于已接種并暗培養10天的栽培料面上（栽培基質選擇園土98%，生石灰2%），15～18 ℃暗培養，3天后開始觀察營養瓶內菌絲顏色、長勢、滿瓶時間等，記錄出現原基時間及原基密度，出菇后統計產量。

（5）羊肚菌栽培基質選擇。栽培室為長4 m、寬4 m的密閉栽培室，室內配備空調、加濕器、光譜燈、溫濕度表。將園土、草炭土、河沙、珍珠巖和生石灰按照表4所示配方拌制，混合均勻后裝入邊長42 cm、高9 cm的栽培筐內，裝料厚度8 cm，表面壓實，澆透水后過夜備用。將原種分成1 cm大小的菌種塊，接種于料面下2 cm處，每筐接種9個點、接種60 g。接種后覆土，使筐內料面中間略高于四周，最高處不超過筐高。15 ℃暗培養10天后擺放外源營養瓶，外源營養瓶配方選擇6號外源營養瓶配方（麥粒60%，硬雜木屑39%，生石灰1%），繼續控制溫度15～18 ℃，空氣相對濕度60%～70%暗培養。50天后，日間增光，滴灌催菇，降低溫度至10～12 ℃，提高空氣相對濕度至80%～90%，14天后可見原基產生。此時，注意通風，控制土壤相對濕度，待20天左右，羊肚菌子實體膨大，菌帽褶皺充分展開后適時采收。采收時使用經消毒的非金屬刀片齊土面切斷菌柄，輕放于筐內，統計羊肚菌產量。每處理設置3次重復。

表3 外源營養瓶試驗配方

注：培養料含水量均為60%。

表4 栽培基質試驗配方

1.4 數據測定與處理

菌絲長速使用游標卡尺測量，羊肚菌產量使用電子天平進行稱量，數據均精確到小數點后兩位，原始數據采用Excel軟件處理，所得結果以平均值和標準差表示，利用SPSS 16.0軟件對數據進行單因素方差分析，<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 菌株分子生物學鑒定

組織分離獲得的菌株經rDNA-ITS區PCR擴增后，獲得大小為642 bp的片段，通過在NCBI數據庫進行BLAST搜索，發現所獲片段的rDNA-ITS 區序列與GenBank中登錄號為MK955410.1:56-697、MK937624.1:58-699、MK955444.1:54-695等的sp. 菌株序列的相似性均高達100%，選取相似菌株繪制進化樹，可以看出它們為同一物種（圖1），即菌株23-1屬六妹羊肚菌。

圖1 菌株23-1 PCR結果（左）和基于rDNA-ITS構建的系統發育樹（右）

2.2 不同配方母種培養基的菌絲生長表現

菌株23-1在6種母種供試培養基的菌絲生長和菌核形成情況見表5，各培養基菌絲均可生長，但生長速度差異較大，其中以配方1（PDA培養基）和配方6（麥麩汁黃豆粉培養基）顯著快于其他培養基，生長速度分別為1.384 mm·h-1和1.358 mm·h-1；配方2（YPD培養基）的菌絲生長速度最慢，為0.834 mm·h-1。配方1和配方5（馬鈴薯酵母粉培養基）菌絲濃密，長勢較強。

表5 不同配方母種培養基的菌絲長速及菌核特征

注：菌核形成時間為3次重復的平均值；菌核數量“+”越多，表示菌核越多；菌絲長勢“+”越多，表示菌絲長勢越好；同列數據后無相同小寫字母表示差異顯著（＜0.05），下同。

研究認為，菌核是羊肚菌子實體形成過程的重要階段，羊肚菌生活史以菌核為中心，菌絲形成菌核，菌核萌發再由菌絲扭結成原基，菌核形成有無與子實體是否形成存在密不可分的關系[16-17]。試驗顯示，配方1、配方3（PDA加富培養基）和配方5接種后96 h出現菌核，前兩者顏色較深，呈棕色，后者色稍淺，呈深黃色（圖2）。配方2和配方4（CYM培養基）在接種后120 h形成淺黃色菌核，且在接種點附近呈聚集狀態。配方6（麥麩汁黃豆粉培養基）在接種后144 h才出現菌核，菌核密度較小，集中在培養基邊緣處。

圖2 不同母種培養基菌株23-1的菌絲生長及菌核形成情況

2.3 不同配方原種培養料的菌絲生長表現

羊肚菌菌株23-1在不同配方原種培養料中均能正常生長（表6、圖3），菌絲生長速度以配方1為快，但菌絲細弱，發菌前期菌絲幾乎觀察不到，隨著配方中硬雜木屑比例降低，麥粒比例提高，菌絲長速減慢，顏色漸深，趨于粗壯。菌絲生長后期，硬雜木屑比例較高的處理菌絲趨于粗壯，生長速度明顯減弱，導致滿袋時間有所延緩。配方13最先長滿，且菌絲粗壯，接種后第5天時菌絲生長已過半，推測是因為培養料中添加了草炭土，有助于菌絲生長。

2.4 不同配方外源營養瓶原基形成與產量表現

不同配方外源營養瓶擺放后羊肚菌菌絲均正常生長（表7），滿瓶時間在11～17天不等，菌絲長勢存在明顯差異，以1號配方100%麥粒的菌絲長勢強，滿瓶時間為17天；6號、8號配方菌絲滿瓶快而細弱，很難觀察到菌絲生長情況。不同配方在接種后68～79天可觀察到原基，1號、4號、5號和6號配方可觀察到的原基數量相對較多，最多超50個，但不同處理及同一處理的不同重復之間均存在較大差異。統計分析顯示，6號、7號、8號3個處理之間產量無顯著差異，但顯著優于其他5個處理，因而認為，外源營養瓶麥粒含量宜在50%～60%范圍內。

表6 供試原種培養料配方對羊肚菌菌絲生長的影響

圖3 不同原種培養料配方菌絲生長情況

表7 供試外源營養瓶配方對羊肚菌原基形成及產量的影響

2.5 不同配方栽培基質原基形成與產量表現

不同配方栽培基質均能形成子實體（表8），出現原基時間較接近，但原基數量及產量差異較大，原基數量以4號、5號、6號和7號配方較多；平均產量則以6號配方顯著優于其他處理，為107.46 g/筐，其次是5號和7號配方，1號配方最低，僅為53.00 g/筐。

表8 供試栽培基質配方對羊肚菌原基形成及產量的影響

3 結論與討論

本文以延邊地區野生羊肚菌菌株23-1為研究對象，母種分離后經分子生物學鑒定，確定為六妹羊肚菌，在此基礎上對其母種、原種、外源營養瓶及栽培基質進行配方篩選。結果表明，菌株23-1母種在6種供試培養基中均可生長，但最適PDA培養基，菌絲生長快，長勢強，接種后96 h即出現菌核。原種在不同配方培養基則表現隨著硬雜木屑比例降低，麥粒比例提高，菌絲長速減慢，但顏色變深，更趨粗壯。其中13號配方（硬雜木屑38%、麥粒40%、麥麩10%、草炭土10%、生石灰1%、石膏1%）培養料在接種15天后菌絲滿袋且粗壯，以其作為栽培試驗的原種培養基進行下一步試驗。

不同外源營養瓶擺放后均可觀察到菌絲正常生長，麥粒所含比例高，菌絲長勢強，但滿瓶時間相對較長，綜合原基形成數量及產量情況，認為麥粒含量在50%～60%較適合，即外源營養瓶適宜配方為麥粒50%～60%、硬雜木屑29%～39%、草炭土0%～10%、生石灰1%。使用不同培養基質栽培羊肚菌，各處理出現原基時間比較接近，平均產量以6號配方（園土88%、珍珠巖10%、生石灰2%）最高，為107.46 g/筐，顯著優于其他處理。

研究表明，羊肚菌正常的原基形成、子實體分化及生長均需要相對較低的溫度，低于15 ℃環境生長的子囊果品質較好，高于20 ℃則品質較差[4]。所以，羊肚菌栽培除菌種和技術外，最大的博弈是自然氣候，尤其是溫度（即冷資源）。延邊地區地處吉林省東部，森林覆蓋率高達80.8%，安圖、敦化、琿春、汪清等多個縣市均分布有野生羊肚菌資源，且近年來延邊地區黑木耳、靈芝、桑黃等食藥用菌產業發展迅速，2021年延邊州食用菌總產量達73萬噸[18]，具備發展羊肚菌產業的環境條件和技術基礎。以延邊地區野生羊肚菌為研究對象，探明其菌絲生長及子實體形成特性，可為延邊地區發展羊肚菌產業提供技術支持。

[1] 向剛, 馬淵浩, 劉萍等. 羊肚菌產量與種袋營養變化關系[J]. 食用菌學報, 2022, 29(2): 39-47.

[2] 徐錦堂. 中國藥用真菌學[M]. 北京: 北京醫科大學, 中國協和醫科大學聯合出版社, 1997: 676-678.

[3] 蘭進, 曹文芩, 徐錦堂. 中國羊肚菌屬真菌資源[J]. 資源科學,1999, 21(2): 56-61.

[4] 杜習慧, 趙琪, 楊祝良. 羊肚菌的多樣性、演化歷史及栽培研究進展[J]. 菌物學報, 2014, 33(2): 183-197.

[5] SU C A, XU X Y, LIU D Y, et al. Isolation and characterization of exopolysaccharide with immunomodu-latory activity from fermentation broth of[J]. DARU Journal of Faculty and Pharmacy, 2013, 21(1): 5.

[6] XIONG C, LI Q, CHEN C, et al. Neuroprotective effect of crude polysaccharide isolated from the fruiting bodies ofagainst H2O2‐induced PC12 cell cytotoxicity by reducing oxidative stress[J]. Biomedicine Pharmacotherapy, 2016(83): 569‐576.

[7] WU F, ZHOU L W, YANG Z L, et al. Resource diversity of Chinese macrofungi: edible, medicinal and poisonous species[J]. Fungal Diversity, 2019. Doi: 10.1007/s13225‐019‐00432‐7.

[8] 尚千涵, 楊婷, 高其媛, 等. 羊肚菌屬物種分類、系統進化和藥用價值研究進展[J]. 中草藥, 2021, 52(7): 2154-2162.

[9] 劉奇正, 屈珊, 譚方河. 梯棱羊肚菌外源營養作用的影響因素[J]. 菌物學報, 2021, 40(12): 3157-3168.

[10] 熊川, 李小林, 李強. 羊肚菌生活史周期、人工栽培及功效研究進展[J]. 中國食用菌, 2015, 34(1): 7-12.

[11] 胡彥營. 羊肚菌多糖發酵、提取及抗疲勞作用研究[D]. 濟南: 山東大學, 2010.

[12] 劉偉, 張亞, 蔡英麗. 我國羊肚菌產業發展的現狀及趨勢[J]. 食藥用菌. 2017, 25(2): 77-83.

[13] 劉偉, 蔡英麗, 張亞, 等. 我國羊肚菌人工栽培快速發展的關鍵技術解析[J]. 食藥用菌, 2018, 26(3): 142-147.

[14] 劉偉, 蔡英麗, 何培新, 等. 羊肚菌栽培的病蟲害發生規律及防控措施[J]. 食用菌學報, 2019, 26(2): 128-134.

[15] 趙永昌, 柴紅梅, 陳衛民. 理性認識羊肚菌產業發展諸多問題[J]. 食藥用菌, 2018, 26(3): 121-127.

[16] OWER R. Notes on the development of the morel ascocarp：[J]. Mycologia, 1982, 74(1): 142-144.

[17] VOLK T J, LEONARD T J. Cytology of the life-cycle of[J]. Mycological Research, 1990, 94(3): 399- 406.

[18] 丁曉云. 延邊州深耕“三農”沃土奏響振興強音[EB/OL]. http://www.jl.gov.cn/szfzt/jlssxsxnyxdh/gddt/2 02209/ t20220916_8576639.html,2022-09-16.

Identification and domestic cultivation of a wild morel () strain in Yanbian area

CUI Linhu SUN Chuang ZHANG Peng JIANG Lijia ZHAO Li*

（Yanbian Academy of Forestry, Yanji 133001, China）

In this study, A wildmorel () strain in Yanbian area as the research object, was isolated and identified by molecular biology. Six stock culture medium formulations, 14 mother spawn medium formulations, 8 exogenous nutrient bottle formulations and 7 cultivation substrate formulations were designed to screen the suitable cultivation substrate for the stock culture, mother spawn, exogenous nutrient bottle and cultivation. The identification results showed that the wild strain "23-1" was. The results of formula screening test showed that "23-1"stock culture was suitable for PDA medium, then mycelium growth is fast and strong, sclerotium appeared at 96 h after inoculation. The mycelium growth of the mother spawn medium was good in formula 13 (mixed sawdust 38%, wheat 40%, wheat bran 10%, turf soil 10%, quick lime 1%, gypsum 1%), the culture bag was full at 15 days after inoculation, and the mycelium was robust. Enhanced the proportion of wheat in the exogenous nutrient bottle formula, indicating strong mycelial growth and long filling time. Considering the formation time and yield of the primordium, the appropriate formula was wheat 50% ～ 60%, mixed wood chips 29% ～ 39%, turf soil 0 ～ 10% and quicklime 1%. The time of mushroom production is close to that of different cultivation substrate formulations, the average yield of formula 6 (garden soil 88%, perlite 10%, quicklime 2%) was significantly higher than other treatments, it is 107.46 g/ basket.

Yanbian;;domestication and cultivation；exogenous nutrient bottle; cultivation substrate

S646

A

2095-0934（2024）01-065-07

延邊州科技攻關計劃項目（2022NS19）；延邊州科技創新中心項目（2020ZH01）

崔林虎（1983—），男，工程師，主要從事食藥用菌栽培研究。E-mail：86257149@qq.com。

趙麗（1986—），女，碩士，高級工程師，主要從事食藥用菌栽培育種研究。E-mail：zhaoli_19861213@163.com。