干血斑中34種苯二氮卓類物質(zhì)的實時直接分析-串聯(lián)質(zhì)譜快速篩查研究

劉富邦，張 瑛，王繼芬*，周沛龍，侯曉龍

（1.中國人民公安大學(xué) 偵查學(xué)院，北京 100038；2.北京市公安司法鑒定中心，法庭毒物分析公安部重點實驗室，北京 100192；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥物研究所，北京 100050）

苯二氮卓類物質(zhì)（Benzodiazepines，BZDs）是一類功能強(qiáng)大的中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制劑［1］，其種類繁多，使用較為普遍，是法醫(yī)毒物檢驗中常見的檢驗?zāi)繕?biāo)。該類藥物的許多衍生物與代謝物依然具有精神活性，且可能有更強(qiáng)的藥效與成癮性［1-2］。因此，BZDs 在服務(wù)于失眠、狂躁等癥狀的患者時，也具有十分重大的濫用風(fēng)險。該類物質(zhì)在自殺、強(qiáng)奸、搶劫等類案件中均有出現(xiàn)，且其中的苯二氮卓類新精神活性物質(zhì)在歐洲、美國等地區(qū)的濫用越來越嚴(yán)重［3-4］。

血液是目前篩查BZDs 攝入的常用檢材基質(zhì)。人體在服用BZDs 后，其原藥及代謝物會經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)身體各處。干血斑（Dried blood spot，DBS）是一種新興的血液樣本采集技術(shù)，需將取得的待測血液滴入特制試紙條上封裝保存［5-6］。該技術(shù)具有采集量少、采集難度低、易于運輸和儲存等優(yōu)勢，在DNA檢驗中得到了廣泛應(yīng)用，在毒物毒品檢驗中也具有強(qiáng)大應(yīng)用潛力［7］。有研究表明BZDs在全血中降解速度快，而在DBS 中十分穩(wěn)定，室溫下放置30 d 仍可保持初始數(shù)值的80%以上［8-9］，因此DBS 是BZDs 的極好檢材。

目前應(yīng)用于干血斑中藥物檢測的方法主要是色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［10-13］，尤其是液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。Guo 等［11］采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法對DBS 進(jìn)行分析，建立了DBS 中425 種藥毒物的篩選方法，方法檢出限（LOD）為0.1~10 ng/mL，并成功應(yīng)用于103名疑似藥物中毒患者DBS樣本的檢測［11］。

實時直接分析（DART）技術(shù)是一種比較成熟的原位電離技術(shù)，通過彭寧電離等作用電離并脫附樣品中的物質(zhì)使其進(jìn)入質(zhì)譜［14］。將DART與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的實時直接分析-串聯(lián)質(zhì)譜（DART-MS/MS）法具有樣品制備簡單、分析快速、環(huán)境友好、操作簡單等優(yōu)勢。Crawford 等［15］使用DART-MS/MS 法直接分析玻片上的血液斑并將該方法用于藥代動力學(xué)研究。Wang等［16］使用優(yōu)化的DART-MS/MS方法定量DBS中的L-苯丙氨酸用以篩查新生兒苯丙酮尿癥，獲得了良好的線性關(guān)系并成功用于醫(yī)學(xué)實踐。

本文將DART-MS/MS 應(yīng)用于DBS 中的毒物分析，開發(fā)了DBS 中34 種BZDs 的DART-MS/MS 篩查方法，并對該方法進(jìn)行了考察和實際應(yīng)用。DBS 易于運輸和存儲的特點使其有潛力成為案件的最佳留存檢材，該研究為DBS中BZDs的快速篩查提供了新選擇，也為后續(xù)的相關(guān)研究提供了參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器、試劑與樣品

QTRAP 4000 質(zhì)譜儀與電噴霧電離源（美國AB SCIEX 公司）；DART-SVP 電離源（美國Ion Sense 公司）；SIGMA 3-30K高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）；旋渦混合器（美國Talboys公司）。

阿地唑侖（Adinazolam）等34 種BZDs 標(biāo)準(zhǔn)品均購自上海原思標(biāo)物科技有限公司，純度≥99%，相關(guān)信息見表1。

表1 34種苯二氮卓類物質(zhì)的CAS號、分子式和質(zhì)譜條件Table 1 CAS number，molecular formula and mass spectrum conditions of 34 benzodiazepines

甲醇、乙腈均為色譜純，購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；丙酮、乙酸乙酯均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為去離子水。

空白血液與檢材血液由北京市公安司法鑒定中心提供。采血卡購自北京達(dá)博創(chuàng)新科技開發(fā)有限公司。

1.2 溶液配制

以甲醇為溶劑使用5 mL 容量瓶分別配制34 種BZDs 的1 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲備液。實驗所需濃度的BZDs標(biāo)準(zhǔn)溶液均由甲醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制。

各濃度血液加標(biāo)樣品由空白血液與標(biāo)準(zhǔn)溶液以9∶1的體積比混勻制備而成。

1.3 DART-MS/MS條件

DART 條件：裝載DART 12Dip-ItTM進(jìn)樣模塊，離子源出口與質(zhì)譜接口距離為1.6 cm，每個玻璃棒進(jìn)樣量為5 μL，移動速度為0.6 mm/s。在正離子模式下電離，柵極電壓為200 V，使用氦氣作為載氣，載氣加熱器溫度為400 ℃。

質(zhì)譜條件：正離子掃描模式，電噴霧電壓為5 500 V，使用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式下的Scheduled MRM 功能設(shè)置68 個離子對的監(jiān)測時間，使34 種苯二氮卓類物質(zhì)分成3 組，每組監(jiān)測兩個玻璃進(jìn)樣棒的進(jìn)樣結(jié)果，每組藥物的掃描窗口寬度為60 s，每次掃描總時間為1.2 s，在DART 開始進(jìn)樣的同時開啟質(zhì)譜掃描。優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)及保留時間（即掃描中心時間）如表1所示。

1.4 樣品前處理方法

采血卡上的DBS 由50 μL 血液滴入試紙條上并陰干3~4 h 制成，每張采血卡上可同時采集兩個血斑。將制備好的DBS封袋冷凍保存。采血卡上制備好的DBS如圖1所示。

圖1 采血卡上制備的DBS照片F(xiàn)ig.1 Photograph of DBS prepared on blood collection card

將采血卡上的一個DBS 裁下并剪碎，置于1.5 mL 離心管中，并加入0.25 mL 水和0.75 mL 乙酸乙酯，渦旋振蕩1 min，超聲處理5 min，以14 000 r/min在4 ℃下冷凍離心5 min，取上層乙酸乙酯溶液進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 DART-MS/MS條件優(yōu)化

裝載電噴霧離子源后使用100 ng/mL 的各BZDs 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化。以全掃描模式定位藥物母離子并記錄質(zhì)荷比，然后使用二級質(zhì)譜掃描模式掃描藥物碎片離子并記錄質(zhì)荷比，選取響應(yīng)最高的兩種離子對作為定性離子對。最后在MRM 模式下優(yōu)化兩種離子對的去簇電壓（DP）和碰撞能量（CE），并計算其豐度比。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)如表1 所示。在DART 自動進(jìn)樣程序開始的同時開啟質(zhì)譜掃描，為了在同一進(jìn)樣程序內(nèi)篩查34 種苯二氮卓類物質(zhì)，使用Schedule MRM 功能，設(shè)置單次掃描總時間為1.2 s，每個峰掃描5次以上以確保準(zhǔn)確性，在保留時間0.3 ~1.3 min 范圍內(nèi)檢測第1組；保留時間1.4 ~2.4 min 范圍內(nèi)檢測第2 組；保留時間2.5 ~3.5 min 范圍內(nèi)檢測第3 組。由血液制備的DBS 樣品（1 μg/mL）的提取溶液中依替唑侖（第1 組）、氟西泮（第2組）、氟硝西泮（第3組）的譜圖如圖2所示。

圖2 DBS樣品提取溶液中依替唑侖（A）、氟西泮（B）、氟硝西泮（C）的譜圖Fig.2 Spectra of etizolam（A），flurazepam（B） and flunitrazepam（C） in DBS（1 μg/mL） sample extraction solution

DART 離子源出口與質(zhì)譜接口的距離以及柵極電壓、載氣流速等參數(shù)使用默認(rèn)值。DBS 樣品在溶液提取后濃度較低，載氣須選擇電離能力強(qiáng)的氦氣。選用相對穩(wěn)定的DART 12Dip-ItTM液體進(jìn)樣模塊，由于玻璃棒進(jìn)樣量越大響應(yīng)越高，為保持液滴穩(wěn)定，將進(jìn)樣量維持在5 μL。在不同溫度下測定100 ng/mL BZDs 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液6 次并取平均值，結(jié)果顯示多數(shù)物質(zhì)在350 ℃、400 ℃及450 ℃響應(yīng)達(dá)到最大。綜合考慮，選用400 ℃作為載氣加熱器溫度。

2.2 前處理方法優(yōu)化

干血斑試紙上的纖維在與血液結(jié)合后經(jīng)高溫載氣電離吹掃時易有雜物脫落堵塞進(jìn)樣口，目前尚未開發(fā)出有效的應(yīng)對手段。研究制備的DBS的直徑約1.5 cm，其碎片的提取需使用1 mL溶劑。目前提取干血斑中的苯二氮卓類藥物多使用甲醇、乙腈及其混合溶劑［10-13，17］，此外乙酸乙酯是最常用于血液中苯二氮卓類物質(zhì)液液萃取的溶劑［18-19］。考察了甲醇、乙腈、甲醇-乙腈（體積比1∶1）混合溶劑、乙酸乙酯-水（體積比3∶1）混合溶劑作為提取溶劑對DBS（1 μg/mL）樣品和空白DBS樣品的提取效果。

結(jié)果顯示，甲醇作為提取溶劑時對DBS 樣品各離子對的響應(yīng)強(qiáng)度高，但在空白樣品中檢出了阿地唑侖、二氯西泮、氟阿普唑侖、α-羥基咪達(dá)唑侖離子對的信號，表明使用甲醇提取DBS 樣品時基質(zhì)干擾嚴(yán)重；乙腈作為提取溶劑時，空白樣品中未檢測到明顯的BZDs 信號，但DBS 樣品的信號響應(yīng)較低，靈敏度差；甲醇-乙腈（體積比1∶1）混合溶劑的響應(yīng)強(qiáng)度中等，但空白樣品中仍有阿地唑侖和二氯西泮被檢出；乙酸乙酯-水（體積比3∶1）混合溶劑提取液可以將更易溶于水的雜質(zhì)留在下層水溶液中，乙酸乙酯提取層更加純凈，進(jìn)樣后的信號響應(yīng)強(qiáng)度相對較高，且空白樣品中無明顯BZDs信號檢出。因此，選用乙酸乙酯-水（體積比3∶1）混合溶劑作為DBS中BZDs的提取溶劑。

2.3 定性方法驗證

在分析高濃度（1 μg/mL）樣品后緊接著分析空白樣品2次以驗證方法的選擇性與延遲效應(yīng)。在空白樣品中未發(fā)現(xiàn)34種BZDs的信號，因此該方法選擇性良好，無延遲效應(yīng)影響。

分別使用3 份不同來源的空白血液稀釋制備1 000、500、200、100、50、20、10、5、2、1 ng/mL的DBS 加標(biāo)樣品，采用所建立的方法進(jìn)行分析。選取出峰位置前后的基線為參照計算各分析物的信噪比（S/N），將滿足3 份樣品出峰位置譜峰的S/N≥3 且離子豐度比誤差在允許范圍（表2）內(nèi)的最低濃度認(rèn)定為檢出限（LOD）。結(jié)果表明，氟西泮、奧沙西泮、阿地唑侖、α-羥基三唑侖的檢出限分別為5、100、200、500 ng/mL，氯溴唑侖、氟阿普唑侖、替馬西泮、阿普唑侖、咪達(dá)唑侖、三唑侖、氟硝西泮、α-羥基咪達(dá)唑侖檢出限為10 ng/mL，氟溴西泮、氟溴唑侖、芬納西泮、去甲西泮、硝西泮、氯硝西泮、7-氨基氯硝西泮的檢出限為50 ng/mL，其他BZDs 的檢出限為20 ng/mL。可見所建方法可作為案件留存DBS中大多數(shù)BZDs物質(zhì)的有效快速篩查方法。

表2 特征離子豐度比的最大允許相對偏差范圍Table 2 Maximum allowable relative deviation range of relative abundance of characteristic ions

2.4 實際應(yīng)用

使用所建立的方法對35 個DBS 樣本（包括31 個陽性血液檢材和4 個空白血液檢材）進(jìn)行快速篩查，并將篩查結(jié)果與LC-MS/MS 檢驗結(jié)果進(jìn)行比較。其中，有3個陽性檢材樣本因濃度太小未檢出；5個陽性檢材樣本只能認(rèn)定其中1 種原藥或代謝物；其他23 個陽性檢材樣本和4 個空白血液檢材樣本均獲得與LC-MS/MS一致的結(jié)論。陽性檢材的檢驗結(jié)果比較如表3所示。

在實際樣品檢驗中，2、7、12、14、29號檢材雖然檢測出的BZDs種類比LC-MS/MS法少，但能夠成功推斷出案件中所服用的物質(zhì)，可在篩查后再使用LC-MS/MS 準(zhǔn)確定性和定量。案件檢材DBS 的篩查失敗率僅為9.7%，均為檢材中藥物濃度低所致，因此推薦在自殺等服用藥物較多的案件中使用DART-MS/MS 法進(jìn)行快速篩查。為方便保存，可將BZDs 濃度在LOD 以上的血液檢材存為DBS 樣品以便進(jìn)行重復(fù)檢驗。

3 結(jié) 論

本文建立了一種快速篩查DBS中34種BZDs的DART-MS/MS方法，該方法操作簡單快捷、成本低，滿足絕大多數(shù)BZDs 的篩查需求。研究中使用的DBS 采血卡是DNA 保存與檢驗的標(biāo)準(zhǔn)載體，能夠?qū)崿F(xiàn)一卡久存多用。該方法在案件檢材中的應(yīng)用效果良好，符合實戰(zhàn)需求。

雖然直接吹掃干血斑表面可能會導(dǎo)致出現(xiàn)雜質(zhì)堵塞進(jìn)樣口等問題，但通過改進(jìn)干血斑試紙或DART 離子源，本文所建方法仍有潛力在快速分析DBS 的應(yīng)用中發(fā)揮重大作用。但由于靈敏度相對較低、現(xiàn)場取血操作難以保證重復(fù)性、血液血細(xì)胞比容不同等因素的影響，本方法在定量分析方面尚有一定的挑戰(zhàn)性。