基于礦物元素指紋圖譜鑒定陳皮產(chǎn)地的方法研究

賴(lài)曉娜，羅輝泰，張春華，黃錦沛，陳怡珊，李 樂(lè)，周 熙，黃 芳，吳惠勤*

（1.廣東省科學(xué)院測(cè)試分析研究所（中國(guó)廣州分析測(cè)試中心），廣東省化學(xué)測(cè)量與應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省中藥質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510070；2.江門(mén)市新會(huì)區(qū)動(dòng)物防疫監(jiān)督所（江門(mén)市新會(huì)區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心），廣東 江門(mén) 529199）

陳皮（Citrus reticulata blanco），又名橘皮，由蕓香科植物橘成熟后的果皮干燥制得，有開(kāi)氣行痰、止嘔止咳、健脾和胃的功效。主要產(chǎn)地為廣東、四川、湖南等。陳皮分為新會(huì)陳皮及其他陳皮，其中以新會(huì)陳皮質(zhì)量最優(yōu)，價(jià)格最高，是第一批被列入《廣東省嶺南中藥材保護(hù)條例》的嶺南中藥材。目前市場(chǎng)上存在不良商家以其他陳皮冒充新會(huì)陳皮、以假亂真的現(xiàn)象。因此，建立一種快速鑒別陳皮產(chǎn)地的方法十分必要。

陳皮的產(chǎn)地鑒別目前主要使用高效液相色譜指紋圖譜［1］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用［2］、成分含量差異研究［3］、紅外光譜［4］、次生代謝產(chǎn)物研究［5］等方法。這些方法大多僅能篩選得到少數(shù)幾個(gè)有效差異指標(biāo)，無(wú)法全面反映不同產(chǎn)地差異。同時(shí)有機(jī)成分在加工、貯藏中極易變化、損失，造成溯源效果不佳。

植物生長(zhǎng)過(guò)程中通過(guò)根莖吸取土壤中的礦物元素，某一產(chǎn)區(qū)植物中的礦物元素與其產(chǎn)地的土壤礦物元素存在極強(qiáng)的相關(guān)性［6］，因此帶有地域特征的礦物元素含量和種類(lèi)是植物產(chǎn)地溯源的重要指標(biāo)。礦物元素作為常用的溯源指標(biāo)之一，已廣泛應(yīng)用于松江大米［7］、黑龍江黃豆［8］、銀耳［9］、生姜［10］的產(chǎn)地鑒別中。李富榮等［11］利用陳皮礦物元素含量結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析構(gòu)建了陳皮產(chǎn)地的判別模型，彭政等［12］構(gòu)建了基于礦物元素的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行陳皮產(chǎn)地判定。以上兩種方法均采用了數(shù)據(jù)深度分析的化學(xué)計(jì)量法，不利于推廣使用。礦物元素指紋圖譜通過(guò)將數(shù)字轉(zhuǎn)化為圖形，簡(jiǎn)化了分析步驟，實(shí)現(xiàn)了數(shù)據(jù)的可視化，已用于西洋參［13］、茶葉［14］的產(chǎn)地研究。

本研究以新會(huì)、廣西、湖南3個(gè)不同產(chǎn)地的陳皮樣品為對(duì)象，對(duì)陳皮中的51種礦物元素進(jìn)行分析，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）測(cè)定陳皮中的礦物元素含量，并通過(guò)元素分類(lèi)和縮放系數(shù)計(jì)算，建立了不同產(chǎn)地陳皮中礦物元素的指紋圖譜。通過(guò)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜并進(jìn)行相似度分析，建立了陳皮產(chǎn)地的鑒別模型。所建立的模型可對(duì)新會(huì)陳皮和其他陳皮進(jìn)行鑒別，為陳皮產(chǎn)地溯源提供了技術(shù)支撐，并為政府部門(mén)、市場(chǎng)監(jiān)督提供了有效方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

42批陳皮樣品，其中包括新會(huì)陳皮24批（XH-1~XH-18用于訓(xùn)練集，XH-19~XH-24用于驗(yàn)證集），湖南陳皮9 批（HN-1~HN-9），廣西陳皮9 批（GX-1~GX-9）。所有陳皮樣品均于60 ℃烘干2 h，粉碎過(guò)篩后裝入密封袋于干燥塔中保存。

P 單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL），Ca、K、Mg、Na 元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL）（北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）；Al、As、B、Ba、Be、Bi、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Ga、Li、Mn、Ni、Pb、Sb、Sn、Sr、Ti、Tl、V、Zn 元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL），La、Ce、Pr、Nd、Sm、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Y 元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）（國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心）；Ag、Al、As、Ba、Be、Ca、Cd、Co、Cr、Cs、Cu、Fe、Ga、K、Li、Mg、Mn、Na、Ni、Pb、Se、Sr、Tl、U、V、Zn 元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL，安捷倫科技有限公司）；Sc、Mo、Hg、Rh、Re 元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 μg/mL，國(guó)家鋼鐵材料測(cè)試中心）；UP級(jí)HNO3（68%，蘇州晶瑞化學(xué)股份有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7700x ICP-MS 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國(guó)安捷倫公司），G-160微波消解儀，WX-8000趕酸器（上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司），TP-214丹佛電子天平（美國(guó)丹佛儀器公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品消解陳皮樣品經(jīng)粉碎后精密稱(chēng)量約0.5 g于聚四氟乙烯消解管中，準(zhǔn)確加入濃硝酸5 mL并靜置30 min，隨后于200 ℃微波消解儀中消解25 min，冷卻后取出消解管，于120 ℃趕酸約20 min，定量轉(zhuǎn)移消解液至25 mL具塞比色管中，超純水定容。取消解液5 mL至100 mL具塞比色管中，用超純水定容，用于常量元素的含量測(cè)定。按上述步驟制作試劑空白。

1.3.2 ICP-MS 工作條件射頻功率：1 550 W；采樣深度：8 mm；霧化器：MicroMist；霧化室溫度：2 ℃；等離子體氣（氬氣）：15.0 L/min，輔助氣（氬氣）：0.8 L/min，載氣（氬氣）：1.03 L/min，碰撞氣（氦氣）：4.3 mL/min（碰撞模式）。內(nèi)標(biāo)元素Rh和Re通過(guò)T型三通管在線(xiàn)引入等離子體，蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速為0.1 r/s。

1.3.3 元素指紋圖譜建立采用ICP-MS 測(cè)定陳皮元素含量，并使用SIMCA 進(jìn)行偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA），以SPSS20.0 進(jìn)行方差分析，篩選有明顯差異的元素作為溯源指標(biāo)，同時(shí)對(duì)不同數(shù)量級(jí)含量進(jìn)行系數(shù)縮放。使用origin 2019b軟件作圖，將元素按VIP值（Variable important for the projection）由大到小排序，以測(cè)定元素為橫坐標(biāo)，相對(duì)含量為縱坐標(biāo)，構(gòu)建各樣品的礦物元素-含量關(guān)系圖，并以各元素含量的均值建立各地陳皮的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

1.3.4 相似度評(píng)價(jià)利用SPSS 22.0軟件分析指紋圖譜的相似度，選擇夾角余弦距離進(jìn)行分析。計(jì)算原理如下：

式中，x為法向量，|x| 為向量的模，cosθ表示向量x與向量y之間的夾角，其值越接近1 說(shuō)明兩個(gè)向量越相似。

1.3.5 產(chǎn)地鑒別相似度閾值設(shè)定為某地指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜相似度的最小值，鑒別未知產(chǎn)地陳皮時(shí)，計(jì)算其與礦物元素標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度，相似度高于閾值，則判定屬于某地。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同產(chǎn)地陳皮的礦物元素含量差異分析

土壤中礦物元素的種類(lèi)和含量具有特征性，植物中的礦物元素需要通過(guò)外界吸收并在生長(zhǎng)過(guò)程中不斷積累［15］。土壤是植物吸收、積累、轉(zhuǎn)移元素的最直接來(lái)源，“基巖-土壤-植物系統(tǒng)”為特色農(nóng)產(chǎn)品的元素遷聚規(guī)律提供了科學(xué)支撐，元素在系統(tǒng)內(nèi)的遷移特征也揭示了特色農(nóng)產(chǎn)品與地球化學(xué)特征的內(nèi)在聯(lián)系，探尋植物內(nèi)元素的地域特征以溯源道地藥材或農(nóng)產(chǎn)品的方法被證明具有廣泛應(yīng)用價(jià)值［16］。新會(huì)地處沖積平原帶，匯聚西江、潭江，處于咸淡水交界，有研究指出，新會(huì)匯聚了大量隨沉積物遷徙的重金屬元素和營(yíng)養(yǎng)元素，有大量元素高背景的特征［17］。

新會(huì)、湖南和廣西3個(gè)產(chǎn)地陳皮中礦物元素的平均含量及標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）結(jié)果見(jiàn)表1。除少數(shù)微量元素如Sn、Hg、Bi在新會(huì)樣品中未檢出外，其余元素在3 地陳皮中均被檢測(cè)到，實(shí)際納入統(tǒng)計(jì)的礦物元素共48種。

表1 不同產(chǎn)地陳皮樣品中礦物元素的含量Table 1 Mineral element content in citrus reticulata blanco samples from different regions

生命必需元素有29種，按體內(nèi)含量的高低又分為常量元素和微量元素。常量元素有C、H、O、N、P、S、Cl、K、Ca、Na、Mg 11種由表1可知，實(shí)驗(yàn)測(cè)定的5種常量元素（P、K、Ca、Na、Mg）中，K含量最高，為9.5~13.7 g/kg。其中，新會(huì)陳皮中K 含量最高，廣西和湖南次之，且三地陳皮中的K 含量差異顯著。

微量元素指占生物體總質(zhì)量小于0.01%的元素共有18種。但由于實(shí)驗(yàn)購(gòu)置的標(biāo)準(zhǔn)溶液不全，僅測(cè)定15 種微量元素，微量元素（Fe、Cu、Zn、Co、Mn、Cr、Se、Ni、Mo、V、Sn、Sr、B、Rb、As）的含量測(cè)定結(jié)果顯示，F(xiàn)e 元素含量占第一位，為52.1~90.3 mg/kg，Mn、Cu、Zn 元素的含量也達(dá)到 mg/kg級(jí)，且新會(huì)陳皮中Cu的含量遠(yuǎn)高于其他兩地，但新會(huì)陳皮中Se、Mo的含量?jī)H為30 μg/kg。

稀土元素（Ce、La、Nd、Y、Pr、Gd、Sc、Sm、Dy、Er、Eu、Yb、Tb、Ho、Tm、Lu）的含量測(cè)定結(jié)果顯示，各地陳皮中稀土元素的含量均低于mg/kg 級(jí)別，其中，Ce、La、Nd 元素的含量依次降低。雖然新會(huì)陳皮中這3種元素的含量均高于其他兩地，但其間不具有顯著差異。

重金屬及有害元素（Cu、Pb、As、Cd、Hg）的含量測(cè)定結(jié)果顯示，新會(huì)陳皮中Cd 元素含量高達(dá)20.71 μg/kg，與廣西及湖南陳皮（含量＜10 μg/kg）間呈顯著差異，其余重金屬元素含量則差別不大。

對(duì)于其他元素，3 地陳皮中Ba、Ga 的含量均較高，達(dá)到 mg/kg 級(jí)別，且具有顯著性差異。新會(huì)陳皮中的Ba、Ga元素含量遠(yuǎn)低于廣西和湖南陳皮。

上述結(jié)果表明，新會(huì)陳皮的礦物元素分布特征與新會(huì)土壤部分重金屬及有益元素呈強(qiáng)度富集的土壤元素分布特征基本協(xié)同［17］。

各產(chǎn)地陳皮對(duì)土壤中礦物元素的吸收富集程度不同，其礦物元素含量及組成具有區(qū)域性特征。為進(jìn)一步分析各產(chǎn)地特征在陳皮產(chǎn)地判別中的意義與價(jià)值，通過(guò)SIMCA軟件建立了不同產(chǎn)地陳皮的PLSDA 分類(lèi)模型，對(duì)產(chǎn)地差異進(jìn)行可視化趨勢(shì)分析。如圖1 所示，該模型將陳皮明顯分為3 類(lèi)，不同產(chǎn)地表現(xiàn)出各自的分布趨勢(shì)，且擬合程度良好（R2Y=0.88，Q2=0.756），說(shuō)明各產(chǎn)地陳皮樣品間差異明顯，可進(jìn)行區(qū)分。通常使用VIP 值來(lái)說(shuō)明變量與分類(lèi)的重要性，VIP 值越大，該元素在產(chǎn)地間的差異越顯著，各變量的VIP 值如表2所示。為篩選導(dǎo)致地區(qū)差異的重要影響因素，以VIP 值大于1為指標(biāo)，得到可區(qū)分產(chǎn)地的重要礦物元素為：Na、Mg、Al、K、Ca、Sc、Ti、V、Mn、Fe、Co、Cu、Ga、Sr、Y、Cd、Sb、Ba、Tb、Dy、U。

圖1 不同產(chǎn)地陳皮的PLS-DA散點(diǎn)圖Fig.1 Scatter plot of citrus reticulata blanco in different origins

表2 PLS-DA模型中不同礦物元素的VIP值Table 2 VIP values of mineral elements in PLS-DA model

2.2 礦物元素指紋圖譜的建立

礦物元素含量是一組獨(dú)立的離散數(shù)據(jù)，無(wú)法直接得到指紋圖譜。將礦物元素按VIP 值大小進(jìn)行排序，以礦物元素為橫坐標(biāo)，礦物元素含量為縱坐標(biāo)，構(gòu)建得到礦物元素-含量關(guān)系圖。從圖2可知，新會(huì)陳皮中礦物元素的含量差別大，其中鉀元素含量高達(dá)107μg/kg，在含量關(guān)系圖中占主導(dǎo)地位。但單一的峰形導(dǎo)致礦物元素指紋圖譜無(wú)法反映陳皮不同產(chǎn)地間的差別。鑒于此，本文對(duì)不同礦物元素含量進(jìn)行系數(shù)縮放。

為消除微量元素與高含量元素的含量差異引起的誤差，將礦物元素根據(jù)平均含量大小分為6 類(lèi)，不同類(lèi)別的縮放系數(shù)不同，具體分類(lèi)及縮放系數(shù)見(jiàn)表3。同時(shí)，為了使地區(qū)差異更為明顯，選取VIP值大于1（表2），方差分析p值小于0.05（表1）的元素進(jìn)行分析（共9 種，分別為Sr、Mg、Cu、K、Ga、Mn、Ba、Na、Cd），構(gòu)建指紋圖譜，基于18 批新會(huì)陳皮繪制的礦物元素指紋圖譜見(jiàn)圖3。整體而言，各樣本之間存在含量差異，但指紋圖譜曲線(xiàn)趨勢(shì)大致相同，礦物元素分布特征相似，因此可基于該趨勢(shì)特征進(jìn)行產(chǎn)地溯源。

圖3 新會(huì)陳皮指紋圖譜Fig.3 Element fingerprint of Xinhui citrus reticulata blanco

表3 礦物元素分類(lèi)和縮放系數(shù)Table 3 Mineral element classification and scale factors

為消除個(gè)例樣品的影響，以18批新會(huì)產(chǎn)陳皮中礦物元素的平均含量作為該地陳皮中礦物元素的標(biāo)準(zhǔn)含量，構(gòu)建新會(huì)陳皮的礦物元素標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，見(jiàn)圖4。

圖4 不同產(chǎn)地陳皮中礦物元素的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜Fig.4 The standard fingerprint of mineral elements from different producing areas

2.3 陳皮產(chǎn)地鑒別模型的建立

將指紋圖譜向量化，通過(guò)計(jì)算余弦相似性對(duì)陳皮礦物元素指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)?；谛聲?huì)陳皮礦物元素標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，采用向量相似法計(jì)算18批新會(huì)陳皮礦物元素指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的余弦相似度，結(jié)果見(jiàn)表4，相似度為0.941~0.998。定義相似度閾值為某樣品指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)圖譜相似度的最小值，得到新會(huì)陳皮礦物元素指紋圖譜的相似度閾值為0.941。通過(guò)構(gòu)建不同產(chǎn)地礦物元素指紋圖譜并計(jì)算其與新會(huì)陳皮標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度進(jìn)行產(chǎn)地判別，相似度高于閾值0.941，可判定屬于新會(huì)陳皮，反之不屬于。

表4 18批新會(huì)陳皮礦物元素指紋圖譜與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度Table 4 Similarity between 18 batches of Xinhui samples with the Xinhui standard fingerprints

2.4 以元素指紋圖譜鑒定陳皮產(chǎn)地

為了驗(yàn)證所建鑒別模型的準(zhǔn)確性，選取新會(huì)陳皮6 批、廣西陳皮9 批、湖南陳皮9 批作為驗(yàn)證樣品，建立各驗(yàn)證樣品的礦物元素指紋圖譜，并計(jì)算其與新會(huì)陳皮標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度，結(jié)果見(jiàn)表5。其中，22批樣品判斷正確，編號(hào)XH-22的樣品誤判為非新會(huì)陳皮，編號(hào)GX-6的樣品誤判為新會(huì)陳皮，產(chǎn)地判別正確率為91.6%。

表5 實(shí)際樣品驗(yàn)證結(jié)果Table 5 Validation results of actual samples

雖然新會(huì)陳皮納入模型組的批次較少，導(dǎo)致相似度閾值存在偏差，但在相同的測(cè)量條件下，建立的礦物元素指紋圖譜仍能有效判別陳皮產(chǎn)地。采用相同方法建立了廣西和湖南產(chǎn)地陳皮的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，結(jié)果顯示，廣西陳皮與新會(huì)陳皮標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度較高。3地陳皮的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜見(jiàn)圖4。

3 結(jié) 論

通過(guò)分析新會(huì)、廣西、湖南3 地陳皮中的51 種礦物元素含量及其組成特征，選用不同產(chǎn)地陳皮中存在顯著性差異的9 種元素建立了各產(chǎn)地陳皮礦物元素指紋圖譜和新會(huì)陳皮標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。通過(guò)計(jì)算各產(chǎn)地陳皮礦物元素指紋圖譜與新會(huì)陳皮標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜之間的相似度，進(jìn)行樣品產(chǎn)地溯源。對(duì)24批未知產(chǎn)地陳皮進(jìn)行產(chǎn)地判別，正確率為91.6%，方法可用于陳皮的產(chǎn)地溯源。但該研究建立的新會(huì)陳皮標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜僅能用于判斷未知產(chǎn)地陳皮樣品是否來(lái)自新會(huì)，具體產(chǎn)地判別及陳皮生長(zhǎng)儲(chǔ)存年限對(duì)元素含量及標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的影響有待進(jìn)一步研究。