母豬妊娠早期唾液、尿液和血漿生殖激素變化規(guī)律及唾液結(jié)晶分析

任玉軍 ，張慶澤 ，韓 飛 ，陸 勤 ，趙月麒 ，何 凡 ，黃 濤 ，3

（1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000；2.新疆天康畜牧科技有限公司，新疆 昌吉 831199；3.新疆生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，新疆 昌吉 831100）

傳統(tǒng)的血液樣本采集時易對母豬造成較大的應(yīng)激，對于妊娠期母豬采集易造成胚胎損失，而在采集唾液和尿液時母豬處于主動狀態(tài)，降低了應(yīng)激對檢測結(jié)果的影響。同時口腔分泌的唾液中含有多種礦物質(zhì)和微量元素，有研究發(fā)現(xiàn)在人類孕期不同階段唾液中氯離子的含量與血液中孕激素的含量呈負(fù)相關(guān)。前期有研究對水牛在卵泡破裂后采集唾液中雌二醇含量和雌二醇/孕酮的比率均顯著高于發(fā)情期和休情期。對貴州香豬和版納微型豬妊娠早期外周血孕酮含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)在母豬妊娠第16天與發(fā)情期孕酮含量差異極顯著。另有研究表明，水牛發(fā)情期唾液結(jié)晶會表現(xiàn)出多種植物模式，推測是由于雌激素濃度變化導(dǎo)致唾液中電解質(zhì)含量發(fā)生變化，且發(fā)現(xiàn)唾液結(jié)晶變化與雌激素水平呈強(qiáng)相關(guān)。當(dāng)前，已在多種動物不同生理階段利用唾液結(jié)晶進(jìn)行了判定，并取得理想效果。但目前仍然主要使用血液來源的樣本對豬進(jìn)行相關(guān)檢查，因此，對母豬唾液生殖激素濃度進(jìn)行測定，并對唾液結(jié)晶進(jìn)行分析對研究母豬生殖生理具有重要意義。

本試驗(yàn)通過對母豬早期妊娠階段唾液、尿液和血漿中激素含量變化規(guī)律與唾液結(jié)晶形態(tài)分析，初步評估利用唾液建立一種非侵入性采樣和樣本檢查一體化方法可行性，并利用對唾液、尿液與血漿中生殖激素檢測結(jié)果進(jìn)行比較，評估唾液結(jié)果的準(zhǔn)確性，為實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)和非侵入性的母豬妊娠診斷方法提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物

本研究對象為8頭二元母豬，每個時間點(diǎn)采集相同批次標(biāo)記母豬。試驗(yàn)?zāi)肛i均來自新疆瑪納斯某國家級生豬產(chǎn)能調(diào)控基地，所有母豬胎次為3～5胎，無生殖系統(tǒng)疾病。配種舍內(nèi)溫度保持在18～25℃，濕度保持在50%～55%，生產(chǎn)采用全進(jìn)全出制，飼喂全價配合飼糧，并按規(guī)定進(jìn)行免疫和日常管理工作。

1.2 試驗(yàn)動物處理

母豬斷奶后每天上午10：00和下午16：00利用公豬誘情并進(jìn)行發(fā)情鑒定，根據(jù)母豬靜立反應(yīng)判斷其是否發(fā)情，并在發(fā)情當(dāng)天進(jìn)行人工授精，記為妊娠第0天，連續(xù)人工授精 3次。人工授精后第18天使用公豬誘情查看母豬是否返情。人工授精后第25天和第35天使用獸用B超儀對母豬進(jìn)行妊娠鑒定，兩次均判定為陽性則認(rèn)為妊娠，且在后期追蹤過程中標(biāo)記母豬均正常產(chǎn)仔，一次為陰性或兩次均為陰性母豬未計(jì)入測定群體。

1.3 主要儀器設(shè)備與耗材

高速離心機(jī)、移液槍、全波長微孔板分光光度計(jì)、液氮罐，賽默飛世爾科技（中國）有限公司產(chǎn)品；5 mL凍存管、2 mL凍存管，廣州潔特生物（中國）有限公司產(chǎn)品；無菌脫脂紗布，康民醫(yī)療器械（中國）有限公司產(chǎn)品。

1.4 樣品收集

1.4.1 唾液采集及處理

收集8頭母豬妊娠第0天，第10天，第12天，第15天，第18天，第20天和第40天唾液（如圖1）。采集時間為早上飼喂前，唾液采集時母豬處于站立狀態(tài)，使用脫脂無菌紗布吸引母豬進(jìn)行咀嚼，待對紗布充分咀嚼后，借助自封袋將紗布中的唾液擠入高溫高壓處理后的離心管中（如圖2），3 000 r/min離心10 min，取上清轉(zhuǎn)移至5 mL凍存管并在液氮中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后放于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 唾液采集

圖2 采集離心后唾液

1.4.2 尿液采集及處理

收集8頭母豬妊娠第0天，第10天，第12天，第15天，第18天，第20天和第40天尿液。早上飼喂前采集尿液，并將采集尿液轉(zhuǎn)移至5 mL凍存管中放入液氮保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后放于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 血漿采集及處理

采集血液對妊娠母豬易造成應(yīng)激導(dǎo)致胚胎損失，因此僅收集6頭母豬在妊娠第12天、第15天、第18天血漿。早上飼喂前，利用保定器固定母豬，使用含EDTA儲血管在母豬前腔靜脈采集血液，上下混勻，1 500 r/min離心15 min，取上清液轉(zhuǎn)移至2 mL凍存管并在液氮中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后放-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 激素測定

試驗(yàn)對母豬唾液、尿液和血漿中生殖激素利用豬雌二醇ELISA檢測試劑盒、豬孕酮ELISA檢查試劑盒測定濃度。試驗(yàn)流程按照試劑盒（購自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司）說明進(jìn)行操作。

1.6 唾液結(jié)晶制作

唾液3 000×g 10 min處理，將上清液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，取20 μL唾液滴在干凈的玻片上進(jìn)行涂片制作，操作時避免氣泡的產(chǎn)生，之后將唾液涂片在室溫放置15～20 min晾干，并在倒置顯微鏡下使用200×物鏡觀察唾液結(jié)晶情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0分析數(shù)據(jù)，對不同周期母豬唾液、尿液和血漿生殖激素濃度變化及唾液結(jié)晶分維值進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)。利用Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析，P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用Fractalyse 2.4（http://fractlvse.org）對母豬早期妊娠各階段的唾液結(jié)晶幾何分維值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 母豬早期妊娠唾液、尿液和血漿中生殖激素濃度變化

2.1.1 雌二醇濃度的變化

由表1可知，唾液雌二醇濃度變化與尿液雌二醇濃度的變化趨勢基本一致。唾液雌二醇濃度值在第10天最高，為250.47±12.30 pmol/L，第20天時最低，為198.71±11.34 pmol/L。尿液雌二醇濃度在妊娠后第18天時達(dá)到最大，為258.21±10.39 pmol/L，第15天時最小，為222.23±14.89 pmol/L。血漿雌二醇在妊娠第12天、第15天和第18天濃度均低于唾液和尿液，變化趨勢與唾液和尿液一致。對母豬唾液和尿液中雌二醇進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)唾液和尿液中雌二醇濃度呈正相關(guān)（R2=0.497，P＜0.05）。

表1 母豬早期妊娠唾液、尿液和血漿中雌二醇濃度（pmol/L）

2.1.2 孕酮濃度的變化

由表2可以看出，母豬早期妊娠唾液和尿液中孕酮濃度的變化趨勢一致，且唾液中孕酮濃度在各個階段始終大于尿液中孕酮濃度。唾液孕酮濃度在第0天時達(dá)到最大值為3 125±154.44 pmol/L，在第20天時濃度最低為2 649.06±173.96 pmol/L，第20天后孕酮濃度開始上升。尿液孕酮濃度在第0天時達(dá)到最大值為2 729.51±99.64 pmol/L，在第20天時濃度最低為1 798.14±148.29 pmol/L，第20天后孕酮濃度開始上升。血漿孕酮在妊娠第12天、第15天和第18天濃度低于唾液濃度，變化趨勢與唾液和尿液相似。對母豬唾液和尿液中孕酮濃度進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)唾液和尿液中孕酮濃度呈正相關(guān)（R2=0.826，P＜0.01）。

表2 母豬早期妊娠唾液、尿液和血漿中孕酮濃度（pmol/L）

2.2 母豬早期妊娠不同階段唾液結(jié)晶形狀的判定

母豬妊娠不同階段唾液會形成不同的結(jié)晶形狀，圖3為母豬妊娠第0天至第40天不同階段的唾液結(jié)晶圖，從唾液結(jié)晶圖形中可以觀察到第0天、第20天樹枝狀結(jié)晶模型、第10天密集松針型結(jié)晶模型，第12天松針型結(jié)晶模型，第15天、第18天為典型蕨根類植物模型，第40天為樹枝狀結(jié)晶模型與蕨根類植物模型混合型。

圖3 母豬早期妊娠不同階段唾液結(jié)晶圖型（200×）

2.3 母豬早期妊娠不同階段唾液結(jié)晶分維值

為進(jìn)一步說明唾液結(jié)晶在母豬妊娠期變化趨勢，對母豬早期妊娠不同階段唾液結(jié)晶進(jìn)行分維幾何值分析，結(jié)果如圖4。P0、P10、P12、P15、P18、P20、P40唾液結(jié)晶分維值分別為1.787、1.56、1.589、1.474、1.908、1.957、1.912，第15天分維值最低。此外分析發(fā)現(xiàn)唾液結(jié)晶分維值與唾液中雌二醇含量呈負(fù)相關(guān)（R2=-0.677，P＜0.05）。

圖4 母豬早期妊娠不同階段唾液結(jié)晶分維值

3 討論

在醫(yī)學(xué)臨床中生殖激素水平檢測通常在血清和血漿中進(jìn)行，從而實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確反映人體生理變化的目的。而在母豬管理過程中同樣沿用外周血測定相關(guān)激素濃度，目前主流采血方法為前腔靜脈采血，容易對母豬造成較大應(yīng)激導(dǎo)致測定結(jié)果不準(zhǔn)確。尿液采集相對血液避免了豬產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。目前多項(xiàng)研究表明可利用豬尿液檢測藥物殘留和開發(fā)生物標(biāo)志物。而利用尿液檢測未普及主要是因?yàn)槟蛞翰杉苣肛i生理節(jié)律、飲水量等的影響，無法實(shí)現(xiàn)即時收集。El-Farhan N等研究認(rèn)為唾液中游離激素是由血液中類固醇激素超濾轉(zhuǎn)運(yùn)而來，可用唾液代替血液進(jìn)行激素測定。母豬在胚胎附植期需要安靜飼養(yǎng)來保證受胎率和產(chǎn)仔數(shù)，不適宜被動采血造成應(yīng)激導(dǎo)致胚胎損失。因此從母豬養(yǎng)殖福利和保證生產(chǎn)水平考慮，使用唾液對母豬生殖激素監(jiān)測是可行并且更加適用的。

王月鶯對大白豬早期妊娠階段的外周血清的雌二醇和孕酮濃度進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)雌二醇和孕酮在母豬胚胎附植期生殖激素濃度出現(xiàn)下降趨勢，在第15天時濃度最低。侯斌對妊娠不同天數(shù)大白母豬和梅山母豬血清中的雌二醇和孕酮含量測定，檢測出雌二醇濃度和孕酮濃度在第15天時最低，之后濃度逐漸上升，這與本研究結(jié)果一致，同時在本研究中利用唾液和尿液對相同時期雌二醇和孕酮濃度測定結(jié)果高于利用血漿的測定值，唾液中孕酮濃度范圍在2 600～3 100 pmol/L之間，雌二醇濃度在190～250 pmol/L之間。國外也有報道，唾液中的雌二醇水平高于血液中的雌二醇水平。與此同時，對母豬唾液和尿液中雌二醇與孕酮進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)唾液和尿液中的生殖激素濃度呈正相關(guān)。在本研究中，期望通過對妊娠母豬的探究，尋找利用唾液和尿液進(jìn)行生理狀態(tài)監(jiān)測的可行性。

目前利用唾液結(jié)晶進(jìn)行發(fā)情鑒定已在犬和水牛等多種動物上進(jìn)行了應(yīng)用，此外還有研究表明可以通過唾液電解質(zhì)檢測女性排卵情況。這些研究對實(shí)現(xiàn)母豬利用唾液進(jìn)行非侵入性診斷具有重要參考意義。與此同時，Ravinder R研究發(fā)現(xiàn)唾液結(jié)晶變化與雌激素的變化趨勢相似，這與本試驗(yàn)結(jié)果體現(xiàn)一致。但由于受采集方法和動物習(xí)性等方面的影響，目前利用唾液結(jié)晶判定動物生理狀態(tài)仍需進(jìn)一步探究和驗(yàn)證。除對家養(yǎng)動物和已馴化動物進(jìn)行運(yùn)用外，這種非侵入性方法對于瀕危野生動物的保護(hù)也具有重要指導(dǎo)意義。當(dāng)前利用唾液對家畜繁育的研究主要集中在水牛上，此外Li C等利用唾液蛋白組實(shí)現(xiàn)了對豬進(jìn)行發(fā)情鑒定。Fletcher L等篩選唾液中代謝生物標(biāo)志物，用于后備母豬產(chǎn)仔潛力的預(yù)測。Madsen P A等研究發(fā)現(xiàn)豬唾液代謝物中的脂氧化物可作為診斷胃潰瘍的生物標(biāo)志物。基于此，開展豬唾液組學(xué)對于提高養(yǎng)殖戶管理水平和母豬繁育水平具有重要指導(dǎo)意義。本試驗(yàn)對母豬胚胎附植期唾液樣本生理特性進(jìn)行了分析，為母豬早期妊娠診斷提供了另一種思路，證明了其可行性，為開發(fā)一種便捷、安全、實(shí)惠的妊娠診斷方法奠定了研究基礎(chǔ)。