黃連等中草藥組方對豬大腸桿菌體外抑菌效果研究

李 楊 ，陳 亮 ，曾璐瑤 ，朱蓓蓓

（1.恩施職業技術學院，湖北 恩施 445000；2.泰興市黃橋鎮畜牧獸醫站，江蘇 泰州 225400）

大腸桿菌是革蘭氏陰性菌，大小0.5×1～3 μm。周生鞭毛，能運動，無芽孢。大量存在于環境中、為人和動物腸道中的常居菌，分為共生菌株和致病性菌株。宿主健康狀態下一般多不致病，當菌群失衡受到致病性菌株感染或者寄主的免疫力下降則有可能會引發腹瀉、膽囊炎、腹膜炎等疾病甚至死亡。由于抗生素的濫用使很多致病菌的耐藥性越來越強，嚴重威脅人和動物的健康，加大防治難度。在解決抗生素類耐藥問題中，中草藥作為抗生素藥物的替代藥已成為研究的熱點。部分中草藥具有抗菌消炎、止痛止吐、補血補氣等功效，并有研究證實多種中草藥對多種家畜、家禽以及水產動物致病菌具有良好的抑菌效果。但對中草藥組方的抗菌藥物研究較少，本試驗選取的黃連、黃柏、白頭翁等中草藥是自然界常見的植物，含有抑菌成分，且具有靶位多、廣譜性、不易產生耐藥性等優點。因此，本試驗通過水煎法獲得的中草藥提取物研究其對大腸桿菌的體外抑菌效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大腸埃希菌標準株[CMC（B）4102]；利川黃連、白頭翁、佩蘭、黃柏、黃苓、藿香、蒼術、銀花、連翹、板藍根、穿心蓮、夏枯草、蒲公英、地丁、青蒿、秦皮、郁金、大黃、梔子、訶子、白芍，巴東一零八藥材種植專業合作社。

1.2 試劑與儀器

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基、LB肉湯培養基、伊紅美藍培養基，北京諾博萊德科技有限公司；95%乙醇、無水乙醇和甲醇，分析純，天津市富宇精細化工有限公司。96孔細菌培養板為美國Corning公司產品。

干燥箱，蘇州巨興烘箱設備有限公司；電子分析天平，德國Sartorius公司；電熱恒溫培養箱，成都瑞派斯科技有限公司；振蕩培養箱，常州金壇精達儀器制造有限公司；壓力蒸汽滅菌器，西安索騰醫療科技有限公司；離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.3 水煎法提取中草藥成分

將配置好的中草藥組方（表1）放進粉碎機打成粉末后稱取100 g，置于燒杯中，加入5～10倍蒸餾水浸泡24～30 h，強火煮沸后改為文火煎煮30 min，用4層紗布過濾，濾液放入4℃冰箱冷藏保存；濾渣加入蒸餾水浸泡30 min，強火煮沸后改為文火煎煮30 min，4層紗布過濾，合并濾液。7 000 r/min離心5 min去除藥液中殘留的藥粉，95℃蒸發濃縮后120℃、15 min高溫高壓滅菌，并用無菌水定容至100 mL，使藥液濃度為1 g/mL，放入4℃冰箱中冷藏備用。

表1 黃連中草藥組方

1.4 菌液的制備

將活化好的大腸桿菌劃線接種于伊紅美藍培養基，置于37℃恒溫培養箱中培養24 h；用接種環挑取有金屬光澤的單個菌落至LB液體肉湯培養基中，37℃、轉速為180 r/min的恒溫搖床培養12 h，以1∶100的比例再接種于LB液體培養基，置于上述恒溫搖床培養至對數期，即用全波長酶標儀檢測菌液OD600約為0.6。用無菌PBS洗滌菌液后調整菌液濃度約為1×106cfu/mL后立刻進行后續試驗。

1.5 藥敏紙片制備

將直徑為6 mm的圓形空白藥敏紙片放進藥物提取液中浸泡40 min，在超凈工作臺中烘干備用。

1.6 抑菌試驗

吸取100 μL的1.4項下所制菌液，涂布于牛肉膏蛋白胨培養基上，室溫干燥5 min。用無菌鑷子夾取藥敏紙片貼在平皿表面，每個平皿貼1片1.5項下制備的藥敏紙片、1片含10 μg粘桿菌素、1片含10 μg多粘菌素的藥敏紙片作為陽性對照、1片用無菌水處理過的紙片作為陰性對照，做3組平行試驗。37℃恒溫培養箱中培養24 h后用游標卡尺以不同方向測量抑菌圈直徑，記錄數據并取平均值。抑菌圈小于10 mm表示有輕度抑菌作用，記錄為“+”；抑菌圈直徑10～15 mm表示有中度抑菌作用，記錄為“++”；15 mm以上表示有高度抑菌作用，記錄為“+++”。

1.7 中草藥的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度測定

采用改良微量二倍稀釋平板法測定中草藥水煎劑對大腸桿菌的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）測定。

將96孔細菌培養板在超凈臺酒精燈附近無菌區打開，用移液器向第2～11孔加入100 μL高壓后的蒸餾水，繼續在第2孔加入100 μL制備的中草藥水煎劑，混勻，取100 μL依次倍比稀釋至第9孔后棄液，向第2～11孔內加入100 μL LB液體培養基，向第2～10孔加入10 μL菌液。第10孔為陽性對照孔（未加入中草藥水煎劑），第11孔為陰性對照孔（未加入菌液）。將細菌培養板置于培養箱培養24 h。

培養后向每孔加入5 μL體積分數2%的四唑紅（TTC），輕輕混勻，繼續培養2 h后觀察，以不顯紅色的孔內中草藥水煎劑最高稀釋倍數的濃度為MIC。

取50 μL細菌培養板中的培養物涂布于LB固體培養基，置于培養箱培養24 h，以無菌落生長的培養液中草藥水煎劑最小濃度為MBC。

試驗成立標準為陰性對照孔不變紅且無菌落長出，陽性孔變紅且有菌落長出。重復試驗3次。

2 結果與分析

2.1 中藥提取物對大腸桿菌的抑制效果

表2展示了中草藥的水煎劑對大腸桿菌的抑制效果3種組方中，黃連組方2水煎劑對大腸桿菌的抑菌圈直徑最大，表現為極敏，且黃連組方2的抑菌效果與抗生素多粘菌素差異不大，比粘桿菌素的抑菌作用強；黃連組方3表現為高敏；黃連組方1為中敏。

表2 3種黃連組方對大腸桿菌的體外抑菌效果

2.2 中草藥的MIC和MBC

MIC和MBC測定試驗結果見表2。由表2可見，黃連組方2水煎劑MIC數值最低，為18.65 mg/mL，黃連組方1和組方3水煎劑MIC 62.5 mg/mL和33.52 mg/mL，3種組方草藥對大腸桿菌均表現出抑菌效果。黃連組方2的MBC數值最低，為18.65 mg/mL，黃連組方3水煎劑MBC為62.18 mg/mL，黃連組方1中草藥組方對試驗菌株的抑菌效果最不明顯，MBC為125 mg/mL。

3 結論與討論

為研究黃連、白頭翁、黃柏等中草藥組方水煎劑作為臨床治療腸外致病性大腸桿菌病可行性，以黃連為主，對21種中草藥組成的組方的體外抑菌效果進行了檢測。結果顯示，大腸桿菌對3種黃連組方表現出不同程度的敏感性，中草藥水煎劑抑菌效果從高到低依次為黃連組方2、黃連組方3、黃連組方1，其中黃連組方2的抑菌效果最強，與多粘菌素相差不大，高于粘桿菌素。

本研究結果顯示，復方中草藥的整體抑菌效果較單方更好。黃連組方2和黃連組方3的抑菌圈直徑均大于1 500 mm，抑菌等級為高度抑菌；部分組方抑菌圈較黃連、訶子單一作用時小，這可能與多種中草藥聯用時發生物理、化學反應或作用位點競爭導致的抑菌活性成分損失或擴散速率下降有關，也可能與單方中草藥的單位體積有效成分多于在組方中的含量，混合后抑菌成分含量減少存在聯系。復方中草藥MIC/MBC試驗結果提示，合理的配伍可提高中草藥對大腸桿菌的體外抑菌作用，這對降低藥物成本、減少藥物使用及殘留具有重要作用。綜合整體抑菌結果，黃連組方2（利川黃連、白頭翁、黃柏、秦皮）可作為豬大腸桿菌抑菌藥物的首選配伍組合，但抑菌作用機制及組分協作方式亟待進一步研究。

本研究以簡便的煎煮法制備21種中草藥水提取液并配制復方，初步研究它們對豬大腸桿菌的抑菌性質。然而，生產中中草藥常以飼料添加劑、浸泡后播撒或成品獸藥等形式使用，提取與使用方式的不同是否會對其抑菌能力產生顯著影響尚不清楚，故中草藥開發為臨床獸藥還需結合中草藥的特性及適宜制備工藝多加驗證。