胃癌中lncRNA HOXA-AS2的表達及其對胃癌細胞生物學行為的影響

吳 航 費哲為

胃癌是最常見的消化系統惡性腫瘤之一,世界范圍內其發生率和病死率分別居于所有惡性腫瘤的第5位和第4位[1]。目前胃癌在我國仍是發生率居于首位的消化系統惡性腫瘤,嚴重威脅我國國民健康[2]。盡管近年來胃癌的診療取得了很大的進步,以手術治療、化療、放療和免疫治療為主的綜合治療顯著改善了胃癌患者的生活質量和生存期限[3]。但由于胃癌早期往往沒有典型癥狀,導致部分患者被診斷時已喪失手術機會,晚期胃癌患者的生活質量和預后仍不能令人滿意[4]。因此,迫切需要探究胃癌發生和發展的詳細分子機制,以獲得更有效的治療策略。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的RNA分子,其中一些lncRNA具有編碼功能性微肽的能力[5]。越來越多的研究表明,lncRNA在腫瘤發生和發展的過程中起到重要作用。近年來,多種與胃癌相關的lncRNA分子被發現,例如H19、MALAT1、HOTAIR等可通過調控胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力繼而影響胃癌的惡性生物學行為[6～8]。lncRNA HOXA-AS2是位于HOXA3基因和HOXA4基因之間的長度為1048個堿基的RNA分子,多項研究表明lncRNA HOXA-AS2在乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等多種癌癥中異常表達且發揮癌基因的功能[9～11]。然而,關于lncRNA HOXA-AS2在胃癌中所發揮的作用仍不清楚,因此本研究的主要目的是探究lncRNA HOXA-AS2在胃癌組織中的表達情況及其對胃癌細胞惡性生物學的影響。

資料與方法

1.臨床樣本和資料:回顧性分析2020年2～12月筆者醫院收治的45例胃癌患者的臨床及病理資料。納入標準:①患者在手術前未接受過放療及化療;②術后病理明確診斷為胃癌;③患者未合并其他原發惡性腫瘤。術中取胃癌組織及距離胃癌5cm以上的癌旁組織迅速放入液氮快速冷凍,后期統一于-80℃冰箱保存。所有入組胃癌患者均簽署書面知情同意書,本研究通過筆者醫院醫學倫理學委員會批準(倫理學審批號:CMEC-2021-KT-02)。

2.細胞系和主要試劑:人正常胃黏膜上皮細胞GES和人胃癌細胞系BGC-823、HGC-27、SGC-7901、MGC803及MKN-45購自中國科學院細胞庫(上海);DMEM、RMPI-1640培養基、胰酶和胎牛血清購自美國Gibco公司;LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司;Trizol試劑購自上海碧云天生物技術公司;CCK-8試劑盒購自日本同仁化學科技公司;反轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自南京諾唯贊生物科技公司;Transwell小室購自美國Corning公司;lncRNA HOXA-AS2、GAPDH引物使用primer5軟件設計,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,lncRNA HOXA-AS2 siRNA由上海吉滿生物科技公司設計合成。

3.lncRNA HOXA-AS2相對表達水平的檢測:使用Trizol提取組織和細胞中的總RNA,根據反轉錄和熒光定量PCR試劑盒說明書進行反轉錄和熒光定量PCR反應。lncRNA HOXA-AS2引物序列為:上游引物:5′-CACGCTTTTCCCGTAGGAAG-3′,下游引物:5′-CTGCTCCAAAACTCTTCGCC-3′;內參GAPDH引物序列為:上游引物:5′-CAACAGCCTCAAGATCATCAGC-3′,下游引物:5′-TTCTAGACGGCAGGTCAGGTC-3′。按照制造商的說明進行熒光定量PCR的實驗,所有實驗重復3次,用2-ΔΔCt方法計算相對基因表達水平。

4.生物信息分析:利用生物信息分析在線網站Kaplan-Meier Plotter分析lncRNA HOXA-AS2對胃癌患者預后的影響。

5.細胞分組和轉染:人胃癌細胞系HGC-27和MKN-45在補充有10%胎牛血清和抗生素的培養基中培養。在細胞處于對數生長期時將其接種在6孔板中并分為對照(NC)組,Si1組和Si2組進行轉染。所有操作嚴格按照LipofectamineTM2000說明書進行,轉染24h后,提取細胞總RNA,按照諾唯贊反轉錄試劑盒說明書反轉錄為cDNA,以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR(RT-qPCR)反應,以2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達水平,驗證siRNA的敲減效果。

6.細胞增殖能力檢測:采用CCK-8法。將轉染后的SiNC、Si1和Si2 3組細胞分別制成單細胞懸液,在96孔板中分別接種轉染后的HGC-27和MKN-45細胞,每孔3000個細胞,每組設置6個復孔,分別在培養后0、24、48和72h 4個時間點避光加入含10μl CCK-8的培養基(100μl)檢測HGC-27和MKN-45細胞的增殖情況,并在37℃下避光孵育2h,然后使用酶標儀記錄每個孔在450nm處的吸光度(A)值。

7.克隆形成實驗:將轉染后的胃癌細胞以每孔500個細胞的密度接種至6孔板中,每3天換液1次,連續培養2周。在預定的時間點加入4%多聚甲醛固定15min。并在常溫下加入濃度為0.5%的結晶紫溶液染色15min,洗凈培養板,進行拍照和統計分析。

8.劃痕實驗:將轉染后的細胞接種到6孔板中,每孔約5×105個細胞,確保過夜后細胞長滿,第2天利用槍頭進行劃痕,每孔等間隔劃4條直線,加入PBS洗去未貼壁細胞,加入不含血清的培養基,在37℃恒溫培養箱中培養24h,使用倒置相差顯微鏡進行拍照并進行統計分析。

9.Transwell侵襲實驗:取處于對數生長期的轉染后的細胞,使用0.25%的胰蛋白酶消化,用培養基制備成單細胞懸液,接種到含Matrigel基質膠的Transwell小室的上室(100μl),下室添加600μl含10%胎牛血清的完全培養基,培養24h后,使用4%多聚甲醛固定10min后使用0.5%的結晶紫染色10min。顯微鏡下拍照并統計遷移細胞數量。

結 果

1.lncRNA HOXA-AS2在胃癌組織和細胞中的表達:熒光定量PCR結果表明,與癌旁組織比較,lncRNA HOXA-AS2在胃癌組織中的表達水平顯著上升,差異有統計學意義(P<0.01,圖1A);lncRNA HOXA-AS2 在所有檢測胃癌細胞系中的表達水平均高于人正常胃黏膜細胞系GES,差異有統計學意義(P<0.01,圖1B),其中以HGC-27和MKN-45細胞的表達水平最高(P<0.001,圖1B),因此選取這兩株細胞系進行后續細胞功能實驗。

圖1 lncRNA HOXA-AS2的表達與生存分析

2.lncRNA HOXA-AS2與胃癌患者生存分析:通過生物信息分析在線網站Kaplan-Meier Plotter分析lncRNA HOXA-AS2對胃癌患者預后的影響,公共數據庫結果表明,lncRNA HOXA-AS2高表達組的總生存期為30.2個月低于lncRNA HOXA-AS2低表達組的123.8個月,差異有統計學意義(P<0.05,圖1C)。

3.lncRNA HOXA-AS2 與胃癌患者臨床病理特征的關系:為探討胃癌組織中lncRNA HOXA-AS2表達水平的臨床意義,根據胃癌組織中lncRNA HOXA-AS2的表達情況,將患者分為高表達組(n=25)和低表達組(n=20)。統計分析結果表明,lncRNA HOXA-AS2的高表達水平與與胃癌分期,淋巴結轉移和分化程度相關(P<0.05),但lncRNA HOXA-AS2的表達水平與患者的年齡、性別、腫瘤直徑無關(P>0.05,表1)。

表1 45例胃癌組織中lncRNA HOXA-AS2表達與臨床病理特征關系(n)

4.siRNA轉染效果:細胞轉染24h后,通過熒光定量PCR檢測lncRNA HOXA-AS2的表達水平探究siRNA的轉染效果,結果表明,Si1和Si2均能成功干擾HGC-27和MKN-45細胞系中lncRNA HOXA-AS2的表達水平(P<0.05,圖2)。

圖2 siRNA轉染后HGC-27和MKN-45細胞中lncRNA HOXA-AS2的表達

5.敲減lncRNA HOXA-AS2對HGC-27和MKN-45細胞增殖能力的影響:敲低lncRNA HOXA-AS2后利用CCK-8法檢測HGC-27和MKN-45細胞的增殖能力,與SiNC組比較,Si1組和Si2組HGC-27、MKN-45的細胞增殖能力顯著下降(P<0.05,圖3)。

圖3 敲減lncRNA HOXA-AS2后對HGC-27(A)和MKN-45(B)細胞增殖能力的影響

6.敲減lncRNA HOXA-AS2對HGC-27和MKN-45細胞克隆形成能力的影響:NC組、Si1組和Si2組HGC-27細胞的克隆數目分別為321.00±32.15、70.00±3.30、135.00±9.26;NC組、Si1組和Si2組MKN-45細胞的克隆數目分別為395.00±23.90、106.50±11.52、190.00±18.38。與NC組比較,敲減lncRNA HOXA-AS2可顯著減少HGC-27和MKN-45細胞的克隆集落數目(P<0.05,圖4)。

圖4 沉默lncRNA HOXA-AS2對HGC-27和MKN-45細胞克隆能力的影響

7.敲減lncRNA HOXA-AS2對HGC-27和MKN-45細胞遷移能力的影響:如劃痕實驗結果所示(圖5),NC組HGC-27和MKN-45細胞的遷移愈合率分別為69.12%±6.23%和57.38%±4.34%;HGC-27細胞Si1組和Si2組的細胞遷移愈合率分別為17.37%±2.18%和29.72%±3.36%;MKN-45細胞Si 1組和Si 2組的細胞遷移愈合率分別為13.55%±1.20%和24.89%±2.06%。與NC組比較,敲減lncRNA HOXA-AS2可顯著降低HGC-27和MKN-45細胞的遷移(P<0.05)。

圖5 沉默 lncRNA HOXA-AS2后對HGC-27和MKN-45細胞遷移能力的影響

8.敲減lncRNA HOXA-AS2對HGC-27和MKN-45細胞侵襲能力的影響:NC組HGC-27和MKN-45細胞侵襲數分別為424.00±32.89和381.00±35.03;Si1組HGC-27和MKN-45細胞侵襲數分別為68.00±5.70和97.00±8.58;Si2組HGC-27和MKN-45細胞侵襲數分別為122.00±7.82和198.00±10.70。與NC組比較,敲減lncRNA HOXA-AS2可顯著降低HGC-27和MKN-45細胞的侵襲能力(P<0.05,圖6)。

圖6 沉默lncRNA HOXA-AS2對HGC-27和MKN-45細胞侵襲能力的影響

討 論

近年來,胃癌的診療取得了很大的進步,特別是以手術治療、化療、放療和新輔助化療為主的綜合治療的實施,早期胃癌患者的5年生存率已達到95%[12]。但由于胃癌早期缺乏典型的癥狀,大部分患者被診斷時已錯過手術治療的最佳時期,伴有局部和遠處轉移的晚期胃癌患者的5年生存率還不足20%[13]。當前,針對晚期胃癌患者的治療主要以化療和靶向療法為主,然而藥物的毒性不良反應以及耐藥性的產生往往導致晚期胃癌患者較差的預后和生活質量的降低[14]。因此,闡明胃癌發生和轉移的分子機制,為胃癌患者尋求新的治療策略是極其必要的。

測序技術的進步使得人們能夠更深入的進行基因組學和轉錄組學分析。研究發現,人類基因組只有不到2%的轉錄本可以翻譯成蛋白質,其余98%的轉錄本被稱為非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)[15]。ncRNA雖然不編碼蛋白質,但其在細胞生物學活動中發揮著重要作用,長度超過200個核苷酸的ncRNA被稱為lncRNA[16]。越來越多的研究表明,lncRNA直接或者間接參與腫瘤的發生和發展的分子機制,調節不同的細胞信號通路,并表現出致癌或抑癌作用[15]。Hu等[17]研究發現膽囊癌中lncRNA HGBC的表達水平顯著上調,高表達的lncRNA HGBC與患者的不良預后相關,進一步探究相關機制發現,lncRNA HGBC可通過海綿化miR-502-3p繼而激活Akt信號轉導通路促進膽囊癌的進展。Dong等[18]利用微陣列對曲妥珠單抗耐藥細胞及親代細胞進行測序分析,結果表明lncRNA TINCR的表達水平在曲妥珠耐藥細胞系中顯著上調,進一步研究發現lncRNA TINCR不僅可以通過上調HER-2的表達來誘導乳腺癌細胞曲妥珠單抗耐藥性的產生,其還可以靶向Snail-1誘導上皮間充質轉化進一步加強乳腺癌細胞對曲妥珠單抗的耐藥性。諸多報道證實,lncRNA HOXA-AS2在多種癌癥中失調,其失調可促進多種癌癥的發生、發展,但lncRNA HOXA-AS2在胃癌中的表達水平及所發揮的作用目前仍不清楚。

本研究表明,與癌旁組織比較, lncRNA HOXA-AS2在胃癌組織中的表達水平顯著升高,提示其在胃癌中可能發揮致癌基因的作用,進一步驗證lncRNA HOXA-AS2在人正常胃黏膜細胞和人胃癌細胞系中的表達水平發現,lncRNA HOXA-AS2在人胃癌細胞系中的表達顯著上調。通過在線生信網站分析了lncRNA HOXA-AS2的表達水平與胃癌患者預后之間的關系,結果表明lncRNA HOXA-AS2低表達組的胃癌患者的總生存期要遠長于lncRNA HOXA-AS2高表達組胃癌患者的生存期,提示lncRNA HOXA-AS2的表達水平還與胃癌患者的預后密切相關。接下來分析了lncRNA HOXA-AS2的表達水平與患者臨床病理特征之間的關系,統計分析結果表明,lncRNA HOXA-AS2的表達水平與與腫瘤分期,淋巴結轉移和分化程度相關,而與患者的年齡、性別、腫瘤大小無關。進一步探究了lncRNA HOXA-AS2的表達水平對胃癌細胞惡性生物學的影響,并成功利用siRNA下調了胃癌細胞株中lncRNA HOXA-AS2的表達。體外實驗結果表明,敲減lncRNA HOXA-AS2的表達水平后,胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力均被抑制,表明lncRNA HOXA-AS2在胃癌細胞中充當促癌基因。

綜上所述,本研究初步證實lncRNA HOXA-AS2在胃癌中發揮促癌分子作用。lncRNA HOXA-AS2在胃癌組織和細胞中的表達顯著上調。lncRNA HOXA-AS2的高表達與胃癌分期、淋巴結轉移、組織分化程度、預后呈正相關。敲低lncRNA HOXA-AS2的表達后顯著抑制了胃癌細胞增殖、遷移和侵襲能力,結果提示 lncRNA HOXA-AS2可能在胃癌中發揮促癌基因的作用,但lncRNA HOXA2促進胃癌發生、發展的相關機制還需開展進一步研究予以證實。