郝忠分 杜 娟 杭 蕓 楊涓智 束 進

支氣管哮喘是以反復發作的咳嗽、氣急、胸悶、喘息為主要臨床癥狀的慢性氣道炎癥,是影響全球兒童最常見的慢性呼吸系統疾病,表現為氣道高反應性,可有氣道重塑。隨著對哮喘研究的深入,一系列的哮喘易感基因被發現,包括人血清類黏蛋白1樣蛋白3(human orosomucoid 1-like protein3,ORMDL3)、胸腺基質淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)和β2腎上腺素受體(β2-drenergic receptor,ADRB2)等[1,2]。ADRB2 位于染色體5q31～32,是一個不含內含子、相對分子質量較小、編碼 413 個氨基酸的基因,在身體各組織中廣泛表達,與多種疾病的發生密切相關,如哮喘、心血管疾病、肺癌等[3～5]。ADRB2基因的多態性與兒童哮喘的易感因素、嚴重程度息息相關[6,7]。近年來關于哮喘易感性方面的研究主要集中在表觀遺傳學方面,表觀遺傳學是在不改變DNA序列的情況下影響基因表達的可遺傳特征,DNA甲基化、組蛋白修飾、miRNA的表達是最常見的表觀遺傳機制,目前的研究主要針對DNA甲基化方面,而組蛋白修飾和miRNA表達方面的研究相對較少。

組蛋白乙酰化修飾是重要的表觀遺傳方式之一,組蛋白乙酰轉移酶(histone acetyltransferase,HAT)和組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitors,HDACi)能使機體乙酰化蛋白堆積,從而影響基因的表達,通常組蛋白乙酰化能夠上調基因的表達,但針對部分炎癥和免疫基因則呈下調趨勢,乙酰化在抗炎、抗免疫反應方面的作用越來越受到人們的關注。既往研究發現,HDACi介導的乙酰化在哮喘模型中具有抗炎、抗細胞增殖的作用,然而目前的研究尚未表明組蛋白乙酰化修飾是否參與哮喘易感基因ADRB2的表達[8]。本研究應用丁酸鈉(sodium butyrate,SoB)、曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)兩種HDACi和腺病毒 E1A相關的300kDa 蛋白(p300)一種HAT處理人正常支氣管上皮細胞(BEAS-2B),研究組蛋白乙酰化對ADRB2的影響,為臨床應用HDACi治療哮喘等ADRB2基因相關疾病提供參考依據。

材料與方法

1.主要材料及試劑:BEAS-2B細胞、ADRB2啟動子質粒(pADRB2-1918)、內參照熒光素酶報告基因質粒(pRL-TK)由本實驗室保存。p300表達質粒及p300突變質粒由英國Joan Boyes教授(The Institute of Cancer Research)惠贈。SoB購自碧云天生物科技有限公司,TSA購自美國MCE公司,雙熒光素酶報告基因試劑盒購自美國 Promega 公司,Trizol試劑、LipofectamineTM3000試劑購自美國Invitrogen 公司,反轉錄試劑購自北京天根生化科技有限公司,SYBR Green、ECL化學發光試劑盒購自南京諾唯贊科技有限公司,引物由上海生工生物工程股份有限公司合成,ADRB2抗體購自英國Abcam公司,GAPDH抗體、山羊抗兔二抗、鼠二抗購自中國 Proteintech公司,二甲基亞砜(DMSO)購自上海澤邁生物科技有限公司。胎牛血清、DMEM高糖培養基購自美國Gbico公司。

2.細胞培養及真核細胞轉染:使用含有10% 胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM高糖培養基于溫度為37℃、含有5% CO2和 95% 空氣的細胞培養箱中培養,2～3天進行傳代,選取對數生長期的細胞進行下一步實驗。將BEAS-2B細胞接種在96孔板、24孔板或12孔板,用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基培養,待細胞密度生長至70%～90%按照LipofectamineTM3000轉染試劑說明書進行真核細胞轉染。當轉染pADRB2-1918質粒時需同時轉入pRL-TK質粒作為內參照質粒。

3.雙熒光素酶報告基因分析ADRB2啟動子活性:在96孔板中培養BEAS-2B細胞,將pADRB2-1918質粒、pRL-TK質粒轉染到細胞中培養24h。分別向細胞中加入終濃度為1、2.5、5mmol/L的SoB為SoB處理組,向細胞中加入無菌雙蒸水(ddH2O)為對照組;分別向細胞中加入終濃度為0.2、0.4、0.8μmol/L的TSA為TSA處理組,向細胞中加入0.1%DMSO為對照組;將pADRB2-1918質粒、pRL-TK質粒、p300表達質粒共轉染到細胞為p300處理組,將pADRB2-1918質粒、pRL-TK質粒、p300突變質粒共轉染到細胞為對照組。培養24h后取出,棄去培養液,洗滌,加入細胞裂解液室溫震蕩,顯微鏡下觀看細胞裂解后檢測熒光強度。熒光強度檢測方法:按照雙熒光素酶試劑盒說明書配置試劑在化學發光檢測儀上分別檢測螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性,以pRL-TK為內參,計算螢火蟲熒光素酶活性強度與海腎熒光素酶活性強度的比值即為ADRB2啟動子的相對活性。每次3復孔,每次實驗重復3次。

4.細胞總RNA提取及實時熒光定量PCR(quantitative real time PCR,qRT-PCR)檢測ADRB2mRNA的相對表達:在24孔板中培養BEAS-2B細胞,分別向細胞中加入終濃度為1、2.5、5mmol/L的SoB為SoB處理組,向細胞中加入ddH2O為對照組;分別向細胞中加入終濃度為0.2、0.4、0.8μmol/L的TSA為TSA處理組,向細胞中加入0.1%DMSO為對照組;將p300表達質粒轉染到細胞為p300處理組,將p300突變質粒共轉染到B細胞為對照組。24h后利用Trizol裂解法提取細胞總RNA,用光密度法測定提取的總RNA的濃度,按照天根反轉錄試劑盒說明書將提取的2μg RNA按照20μl的總體系反轉錄為cDNA進行qRT-PCR,qRT-PCR總體系為20μl,包含2μl cDNA、10μmol/L上游引物、10μmol/L下游引物和ddH2O。qRT-PCR反應程序:95℃10s預變性,95℃10s,53℃退火溫度,共40個循環,以GAPDH基因為內參,分析數據,計算ADRB2mRNA相對表達量。ADRB2上游引物:5′-GTGATCATGGTCTTCGTCTACT-3′,下游引物: 5′-CATGATGATGCCTAACGTCTTG-3′;GAPDH上游引物:5′GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′,GAPDH下游引物:5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。每次實驗重復3次。

5.細胞總蛋白提取及Western blot法檢測ADRB2 蛋白的相對表達:在6孔板中培養BEAS-2B細胞,分別向細胞中加入終濃度為1、2.5、5mmol/L的SoB為SoB處理組,向細胞中加入ddH2O為對照組;分別向細胞中加入終濃度為0.2、0.4、0.8μmol/L的TSA為TSA處理組,向細胞中加入0.1%DMSO為對照組;將p300表達質粒轉染到細胞為p300處理組,將p300突變質粒共轉染到B細胞為對照組。48h 后將細胞裂解、離心提取細胞總蛋白并測定總蛋白濃度,通過SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳分離等量蛋白,將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜上,用TBST buffer稀釋的5%的脫脂牛奶在室溫下慢搖封閉2h,TBST buffer洗滌3次,用稀釋后的GAPDH抗體、ADRB2抗體在4℃下孵育過夜,TBST buffer洗滌3次,用二抗室溫下孵育90min,TBST buffer洗滌3次,利用ECL化學發光試劑盒顯影,并用Image J 軟件進行各條帶灰度分析,分析ADRB2蛋白的相對表達。每次實驗重復3次。

結 果

1.SoB和TSA對ADRB2基因啟動子活性和mRNA的相對表達水平的影響:利用雙熒光素酶報告基因分析發現SoB處理組ADRB2啟動子活性與對照組比較均顯著下降(P<0.01),TSA處理組ADRB2啟動子活性與對照組比較均下降(P<0.05);利用qRT-PCR方法發現SoB處理組ADRB2mRNA的相對表達與對照組比較下降(P<0.05),發現TSA處理組ADRB2mRNA的相對表達與對照組比較明顯下降(P<0.01),提示SoB和TSA在基因轉錄水平下調ADRB2,詳見圖1。

圖1 SoB和TSA對ADRB2的啟動子活性和mRNA的相對表達的影響

2.SoB和TSA對ADRB2蛋白表達的影響:使用Western blot法檢測ADRB2蛋白的表達,發現SoB處理組ADRB2蛋白的相對表達較對照組均下降(P<0.05),TSA處理組ADRB2蛋白的相對表達較對照組下降(P<0.05),提示SoB和TSA在蛋白翻譯水平下調ADRB2,詳見圖2。

圖2 SoB和TSA對ADRB2蛋白的相對表達的影響

3.p300對ADRB2基因啟動子活性和mRNA表達水平的影響:利用雙熒光素報告基因分析ADRB2啟動子活性,p300處理組較對照組顯著下降(P<0.01);利用qRT-PCR方法發現p300處理組ADRB2mRNA的相對表達水平較對照組明顯下降(P<0.01),提示p300在基因轉錄水平下調ADRB2基因,詳見圖3。

圖3 p300對ADRB2的啟動子活性和mRNA的相對表達的影響

4.p300對ADRB2蛋白表達的影響:利用Western blot法檢測ADRB2蛋白的表達,顯示p300處理組ADRB2蛋白的相對表達較對照組顯著下降(P<0.01),提示p300在蛋白翻譯水平下調ADRB2,詳見圖4。

圖4 p300對ADRB2蛋白的相對表達的影響

討 論

以往研究證實HDAC的高表達是造成炎癥發生的重要原因,抑制HDAC能有效的下調炎癥的發生,抑制HDAC6和HDAC8的活性可能會減輕氣道重塑,HDACi抑制HDAC的活性,和HAT共同參與調控組蛋白乙酰化修飾,能使染色質乙酰化,從而調控基因的表達,目前在臨床治療腫瘤方面已廣泛應用,HDACi不僅對腫瘤有治療作,如通過抑制MCM-2-7下調神經膠質瘤細胞的增殖,HDACi抑制乳腺癌的增殖和遷移等,還具有抗炎作用,HDACi抗炎作用已在包括哮喘在內的多種疾病中證實,如HDACi-PCI-34051能通過抑制VEGF/ERK信號通路緩解哮喘氣道炎癥和氣道高反應性,HDACi-ACY1215能減輕急性肝衰竭小鼠模型中炎性反應,HDACi-VPA能減輕IgA腎病細胞模型中的炎性反應,上述研究均提示HDACi能減輕炎性反應[9～15]。

哮喘是由多種因素導致的復雜的遺傳性疾病,免疫失調在哮喘的發生、發展中起重要作用,表現IgE水平升高、肥大細胞過度釋放過敏介質、嗜酸性粒細胞滲入肺部、Th1/Th2紊亂和呼吸道炎癥,肥大細胞、嗜酸性粒細胞和產生IgE的B細胞和細胞因子IL-4、IL-5、IL-13共同參與產生炎性反應,釋放組胺、類胰蛋白酶的顆粒,并產生促炎性細胞因子,如前列腺素D2、半胱氨酰白三烯和腺苷,而嗜酸性粒細胞是通過釋放蛋白酶引起大多數組織損傷的關鍵效應細胞,說明炎癥增加哮喘的易感性,減弱中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和T細胞募集和活化所需的炎性細胞因子的持續表達對控制哮喘極為重要[16,17]。上述研究提到HDACi能減輕炎性反應,緩解哮喘的發生、發展。HDACi按結構可分為4類,分別是羥肟酸類、環肽類、脂肪酸類和笨酰胺類,TSA是異羥肟酸類 HDACi,能有效抑制Ⅰ類、Ⅱa類HDAC,能抑制細胞增殖、降低細胞內炎性因子,從而達到相應的抗炎作用,用TSA處理小鼠哮喘模型發現氣道內黏蛋白5AC明顯降低,提示TSA在降低氣道黏液分泌中起重要作用,TSA也能使中性粒細胞失活從而減輕炎性反應[18]。

丁酸鈉是短鏈脂肪酸鹽類HDACi,能參與調控機體組蛋白乙酰化修飾,使細胞生長周期停滯,發生細胞凋亡,從而發揮相應的抗炎作用,研究發現SoB可通過G蛋白介導的信號通路增強腸道先天免疫功能,同時通過抑制組蛋白去乙酰化酶來減輕炎性反應[19]。HAT按其結構特點可分為6種類型,p300屬于p300/CBP家族中的一種HAT,與CBP結構相似,p300是關鍵的轉錄共激活因子和組蛋白乙酰轉移酶,在許多細胞過程中是不可或缺的,在機體乙酰化中起重要作用,p300表達的改變與多種疾病有關,p300能使轉錄因子KLF2乙酰化,抑制NF-κB依賴性基因的轉錄,KLF2介導的NF-κB信號轉導抑制使細胞對促炎性細胞因子反應減弱,從而減弱炎性反應[20]。上述研究說明了組蛋白乙酰化修飾在哮喘的發生、發展中起重要作用,本研究用SoB、TSA及p300處理BEAS-2B細胞,抑制了BEAS-2B細胞中ADRB2基因的啟動子活性、mRNA及蛋白的表達,更進一步證實在體外研究中,組蛋白乙酰化抑制哮喘易感基因ADRB2的表達。

綜上所述,組蛋白乙酰化抑制哮喘易感基因ADRB2的表達,為臨床哮喘的防治提供了新思路。本研究使用人正常支氣管上皮細胞進行實驗,證實了SoB、TSA及p300參與的組蛋白乙酰化修飾抑制ADRB2的啟動子活性、mRNA及蛋白的表達,但其通過何種分子通路機制進行抑制尚不明確,未來需進一步開展相關實驗研究組蛋白乙酰化抑制哮喘易感基因ADRB2的分子機制。