過硫酸氫鉀對貝類育苗水體中溶藻弧菌的殺滅效果

陳金華 福州市長樂區漳港海蚌場 福州 350209

弧菌是導致海水養殖中細菌類疾病最主要的病原之一，弧菌分布范圍廣，發病率高，影響率大，給養殖產業帶來不可預估的危害， 近些年來對于弧菌的研究成為新一大熱點[1]。 《伯杰氏系統細菌學手冊》第九版中，弧菌屬共收錄了35 種細菌，其中很大一部分被認為是海水養殖中的重要致病菌[2]，例如鰻弧菌（Vibro anguillarum）、創傷弧菌（V.vulnificus）、溶藻弧菌 （V.alginolyticus）、 副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、最小弧菌（V.mimicus）、鯊魚弧菌（V.carchariae）等眾多弧菌引起魚蝦類疾病，其中能夠對蝦引發疾病的弧菌有鰻弧菌、 創傷弧菌、 溶藻弧菌、副溶血弧菌等[3]。

弧菌不僅可以對海水養殖產品造成危害， 誤食后對人體也會造成一定的影響。 如副溶血弧菌可引起急性腸胃炎，河弧菌可引起散發性腹瀉，創傷弧菌可以引起敗血癥。 在沿海地區導致食物中毒和腹瀉的主要病原為溶藻弧菌[4]， 溶藻弧菌是革蘭氏陰性菌，屬于弧菌科弧菌屬，彎桿狀、無莢膜，在TCBS 培養基上呈現黃色菌落。 溶藻弧菌廣泛分布在世界各地海水及河口區，其數量占據海水類弧菌榜首，養殖貝類、蝦類感染溶藻弧菌的概率遠大于養殖魚類，也是西施舌（Coelomactra antiquata）育苗生產中影響浮游幼蟲、稚貝發育存活的重要因素。

在水產養殖過程中廣泛使用消毒劑來控制細菌性疾病， 最常使用的消毒劑有次氯酸鈉、 漂粉精、聚維酮碘、戊二醛、二氯異氰尿酸鈉等[5]，大多數為含酸、堿、鹵類、氧化劑、重金屬等[6]，易對水源、土壤造成影響， 進而對人們的生活與健康帶來不良的影響[7]。

過硫酸氫鉀（KHSO5，PMS），為一種無機過氧化物，易發生吸潮迅速分解成氧氣和硫酸鉀，工業上將PMS 與硫酸氫鉀、硫酸鉀制成過硫酸氫鉀復合鹽進行使用，其穩定性高、易保存。一方面，過硫酸氫鉀可以與水發生氧化反應，生成不穩定的臭氧（O3），臭氧迅速分解形成氧氣和新生態氧， 能夠殺滅呼腸孤病毒（GCRV)、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、無乳鏈球菌（Streptococcaceae agalactiae）等水產養殖病原微生物[8]；另一方面，由于過硫酸氫鉀分解后產生的硫酸根自由基（SO4-·）具有極強的氧化性，能夠迅速破壞微生物細胞膜的通透性， 從而使細胞內容物流出，并且可以與核酸中的金屬離子結合，產生自由基， 作用于磷酸二脂鍵并使其斷裂， 也能達到抑制細菌生長的作用[9]。 過硫酸氫鉀反應生成CO2、H2O、SO42-等產物過程中不生成有害的物質，相較于其他消毒劑而言更加綠色環保[10]。 對于過硫酸氫鉀的研究主要集中在對于水處理應用中， 例如水體中藻毒素的去除、 含氯酚廢水的降解及燃料廢水的降解， 在對飲用水的消毒上也是遠遠高于傳統的氧化劑[12]。 過硫酸氫鉀對海水中溶藻弧菌的殺滅效果尚未見報道。

本研究在實驗室條件下評價過硫酸氫鉀對海水貝類育苗中常見致病菌溶藻弧菌的殺滅效果， 探究過硫酸氫鉀對于溶藻弧菌最優的殺滅條件， 并進一步探討該消毒劑在貝類育苗水體中的使用效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 本試驗使用的菌種為溶藻弧菌，溶藻弧菌從長樂區漳港海蚌場的西施舌育苗池海水中分離，獲得試驗菌種（ZHB201606053）。

1.1.2 試驗材料 過硫酸氫鉀復合鹽 （CAS 號：37222-66-5）， 西隴科學股份有限公司產品；TCBS培養基、無菌海水。

1.1.3 試驗器材 250 mL 燒杯、150 mL 錐形瓶、電子天平、稱量紙、玻璃棒、封口膜、培養皿、紫外線超凈臺、酒精、涂布棒、恒溫箱、200 uL 移液槍、1 mL 移液槍、10 mL 移液槍。

1.2 方法

1.2.1 單因素試驗 在實驗室條件下探討藥物濃度、溫度、菌液濃度和作用時間4 個單因子對過硫酸氫鉀殺滅溶藻弧菌效果的影響。 設計試驗條件分別為過硫酸氫鉀藥物濃度（10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L），溫度（10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃）， 溶藻弧菌菌液濃度 （1×104CFU/mL、1×105CFU/mL、1×106CFU/mL、1×107CFU/mL、1×108CFU/mL），作用時間（0.5 h、1 h、6 h、12 h、24 h）。 試驗組設6 個平行組，另設對照組，均在相應條件下搖床培養， 取樣涂布TCBS 固體平板檢測各組弧菌生長情況，計算殺菌率。 殺菌率=[1-（試驗組弧菌菌落數/對照弧菌菌落數）]×100%。

1.2.2 正交試驗設計 在過硫酸氫鉀對溶藻弧菌單因素試驗的基礎上，通過正交試驗探討溫度、菌液濃度、 藥物濃度對過硫酸氫鉀殺滅溶藻弧菌影響的最優條件。 將上述3 個因素按L9（34）正交表安排試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 三因素三水平正交試驗設計

1.2.3 過硫酸氫鉀對西施舌育苗池水中弧菌的殺滅效果 按最終藥物濃度為1 mg/L、3 mg/L、5 mg/L、7 mg/L、9 mg/L、11 mg/L、13 mg/L、15 mg/L 的要求，將藥液與過濾后的西施舌育苗池海水均勻混合后作為試驗組，每組3 個平行，分別放入25 ℃、120 r/min搖床中分別培養1 h、6 h、12 h、24 h；另設對照組同時培養。

1.2.4 菌液制備 選取西施舌育苗池養殖池水分離出的溶藻弧菌單菌落接種于TCBS 固體培養基中，于37 ℃培養24 h，挑取正常的溶藻弧菌單菌落，用滅菌海水稀釋刮取下的菌落， 經計數稀釋制成不同菌液濃度的菌懸液供試驗使用。

1.2.5 消毒劑溶液的配制 稱取6 g 過硫酸氫鉀復合鹽溶于50 mL 無菌海水中， 配制出初始濃度為120 g/L 的過硫酸氫鉀復合鹽水溶液。根據正交試驗方案所需的藥物濃度， 再進一步使用無菌海水將濃度稀釋至試驗濃度。

1.2.6 殺菌率測定 37 ℃培養24 h 后的培養皿，計數平板的菌落數， 每個試驗組的3 個平行培養皿取平均值。 采用SPSS19 軟件處理數據，計算最終殺菌率。

2 結 果

2.1 不同濃度過硫酸氫鉀對溶藻弧菌殺滅效果從表2、圖1 可知，隨著過硫酸氫鉀藥物濃度提升，對溶藻弧菌的殺菌率大幅度上升， 且各個梯度之間差異性顯著。 在藥物濃度為10 mg/L～30 mg/L 時，殺菌率均＜50%，而藥物濃度達40 mg/L 時，殺菌率達到90%，過硫酸氫鉀藥物濃度與溶藻弧菌殺滅率之間存在明顯的劑量效應。

圖1 藥物濃度對殺菌率的影響

表2 不同濃度過硫酸氫鉀殺滅溶藻弧菌試驗結果

2.2 溫度對過硫酸氫鉀殺滅溶藻弧菌效果的影響溫度是影響消毒劑效果的重要因素之一，從表3、圖2 可知，當溫度小于20 ℃時，殺菌率隨著溫度的上升而逐步提高，15 ℃與20 ℃的殺菌率有顯著差異；20～30 ℃殺菌率最高，但無顯著差異。因此，20～25 ℃是過硫酸氫鉀對溶藻弧菌殺滅效果最適的溫度范圍。

圖2 溫度對殺菌率的影響

表3 不同溫度下過硫酸氫鉀殺滅溶藻弧菌試驗結果

2.3 過硫酸氫鉀對不同菌液濃度溶藻弧菌的殺滅效果 從表4、圖3 可知，隨著溶藻弧菌菌液濃度升高， 過硫酸氫鉀的殺菌作用逐漸減弱， 但104CFU/mL～106CFU/mL 殺菌率差異并不顯著； 菌液濃度106CFU/mL 與108CFU/mL 的殺菌率隨著菌液濃度升高而大幅降低，且差異顯著。

圖3 菌液濃度對殺菌率的影響

表4 不同菌液濃度下過硫酸氫鉀殺滅溶藻弧菌實驗結果

2.4 過硫酸氫鉀作用時間對溶藻弧菌殺滅效果的影響 從表5、 圖4 可知， 過硫酸氫鉀的作用時間0.5 h 至6 h 的殺菌率差異不顯著，而與12 h 殺菌率差異顯著。表明過硫酸氫鉀殺菌反應迅速，能在較短時間內殺滅溶藻弧菌，在生產應用中潛力巨大。

圖4 作用時間對殺菌率的影響

表5 不同作用時間對過硫酸氫鉀殺滅溶藻弧菌的影響

2.5 溫度、菌液濃度和藥物濃度對溶藻弧菌殺滅率的聯合影響 正交試驗結果見表6、圖5，其中試驗5 組與試驗7 組的殺菌率均為100%。

圖5 正交試驗結果

表6 三因素三水平正交試驗結果

為了探究試驗最優條件， 將試驗結果輸入至SPSS19，得出各個單因素的影響情況以及方差結果分析（見表7）。 方差分析中，當P＞0.05 時，該因素效果不顯著；當0.01＜P＜0.05 時，該因素效果顯著；當P＜0.01 時，效果極顯著。 從表8 可知，溫度的方差為0.040，處于0.01～0.05，效果顯著；菌液濃度的方差為0.060，大于0.05，則菌液濃度對溶藻弧菌的影響不顯著；藥物濃度的方差為0.003，小于0.01，可見過硫酸氫鉀藥物濃度對于溶藻弧菌的殺滅效果極其顯著。因此，能夠抑制溶藻弧菌的主次因素分別為藥物濃度、溫度、菌液濃度。從表8 的均值可知，過硫酸氫鉀對溶藻弧菌殺滅作用的最優水平組合為藥物濃度40 mg/L、溫度25 ℃、菌液濃度105CFU/mL。

表7 影響殺菌率因素的方差分析結果

表8 殺菌率單因素統計

2.6 過硫酸氫鉀對西施舌育苗池水中弧菌的殺滅效果 從表9 殺菌率結果來看， 過硫酸氫鉀濃度為5 mg/L 以下時，不能抑制弧菌的生長，弧菌數量反而有一定程度增加，之后隨著濃度增加，弧菌得到一定程度的抑制。當藥物濃度達11 mg/L 時，滅菌率達99%；藥物濃度大于13 mg/L 時，弧菌完全被殺滅；藥物濃度大于9 mg/L 時， 藥物作用時間1～24 h 的殺菌率差異均不顯著， 表明過硫酸氫鉀藥效可以維持24 h。

表9 不同濃度過硫酸氫鉀對西施舌育苗池水弧菌的抑制效果

3 討 論

水產養殖育苗生產中水源的殺菌消毒是預防細菌病害的重要措施， 不同消毒劑和過高的藥物濃度可能導致水體中的殘留， 影響養殖苗種的生存和發育，過硫酸氫鉀殺菌反應過程中不生成有害的物質，反應后的產物相較于其他消毒劑而言更加綠色安全，在水產養殖業中有良好的應用前景。研究結果顯示， 過硫酸氫鉀復合鹽對溶藻弧菌具有顯著的殺滅效果， 對于殺菌率影響最大的則為過硫酸氫鉀藥物濃度和溫度， 有效消毒需綜合考慮適宜的藥物濃度和溫度條件，過硫酸氫鉀在20 ℃即表現出很好的殺菌效果， 在海水中殺菌時間短至0.5 h均有明顯殺菌作用， 是常用的次氯酸鈉等含氯消毒劑無法匹敵的[11]。

過硫酸氫鉀的氧化能力超過了氯化物、 高錳酸鉀、過氧化氫等，而且相較于其他消毒劑來講更加衛生與環保，且其對皮膚以及粘膜的刺激較為溫和，殺菌作用的效果更加持久， 分解后的產物硫酸鹽可以通過人體、 動物體的肝臟以及泌尿系統很好地排出體外[12]，不僅不會對身體造成危害，排出的廢物也不會對環境產生有害的殘留，因此被譽為“氧化性和安全性完美結合的過氧化物”[13]。 因此，將過硫酸氫鉀應用于水產養殖用水的消毒是非常安全、綠色、環保的。以過硫酸氫鉀復合鹽為主，輔以有機酸、無機酸、表面活性劑等組合而成的新型過氧化物類消毒劑，可大大降低使用濃度，適合水產養殖場景，將為水產養殖提供一種新的綠色環保的消毒方式。