過(guò)硫酸氫鉀對(duì)貝類(lèi)育苗水體中溶藻弧菌的殺滅效果

陳金華 福州市長(zhǎng)樂(lè)區(qū)漳港海蚌場(chǎng) 福州 350209

弧菌是導(dǎo)致海水養(yǎng)殖中細(xì)菌類(lèi)疾病最主要的病原之一，弧菌分布范圍廣，發(fā)病率高，影響率大，給養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來(lái)不可預(yù)估的危害， 近些年來(lái)對(duì)于弧菌的研究成為新一大熱點(diǎn)[1]。 《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》第九版中，弧菌屬共收錄了35 種細(xì)菌，其中很大一部分被認(rèn)為是海水養(yǎng)殖中的重要致病菌[2]，例如鰻弧菌（Vibro anguillarum）、創(chuàng)傷弧菌（V.vulnificus）、溶藻弧菌 （V.alginolyticus）、 副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、最小弧菌（V.mimicus）、鯊魚(yú)弧菌（V.carchariae）等眾多弧菌引起魚(yú)蝦類(lèi)疾病，其中能夠?qū)ξr引發(fā)疾病的弧菌有鰻弧菌、 創(chuàng)傷弧菌、 溶藻弧菌、副溶血弧菌等[3]。

弧菌不僅可以對(duì)海水養(yǎng)殖產(chǎn)品造成危害， 誤食后對(duì)人體也會(huì)造成一定的影響。 如副溶血弧菌可引起急性腸胃炎，河弧菌可引起散發(fā)性腹瀉，創(chuàng)傷弧菌可以引起敗血癥。 在沿海地區(qū)導(dǎo)致食物中毒和腹瀉的主要病原為溶藻弧菌[4]， 溶藻弧菌是革蘭氏陰性菌，屬于弧菌科弧菌屬，彎桿狀、無(wú)莢膜，在TCBS 培養(yǎng)基上呈現(xiàn)黃色菌落。 溶藻弧菌廣泛分布在世界各地海水及河口區(qū)，其數(shù)量占據(jù)海水類(lèi)弧菌榜首，養(yǎng)殖貝類(lèi)、蝦類(lèi)感染溶藻弧菌的概率遠(yuǎn)大于養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)，也是西施舌（Coelomactra antiquata）育苗生產(chǎn)中影響浮游幼蟲(chóng)、稚貝發(fā)育存活的重要因素。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中廣泛使用消毒劑來(lái)控制細(xì)菌性疾病， 最常使用的消毒劑有次氯酸鈉、 漂粉精、聚維酮碘、戊二醛、二氯異氰尿酸鈉等[5]，大多數(shù)為含酸、堿、鹵類(lèi)、氧化劑、重金屬等[6]，易對(duì)水源、土壤造成影響， 進(jìn)而對(duì)人們的生活與健康帶來(lái)不良的影響[7]。

過(guò)硫酸氫鉀（KHSO5，PMS），為一種無(wú)機(jī)過(guò)氧化物，易發(fā)生吸潮迅速分解成氧氣和硫酸鉀，工業(yè)上將PMS 與硫酸氫鉀、硫酸鉀制成過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合鹽進(jìn)行使用，其穩(wěn)定性高、易保存。一方面，過(guò)硫酸氫鉀可以與水發(fā)生氧化反應(yīng)，生成不穩(wěn)定的臭氧（O3），臭氧迅速分解形成氧氣和新生態(tài)氧， 能夠殺滅呼腸孤病毒（GCRV)、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、無(wú)乳鏈球菌（Streptococcaceae agalactiae）等水產(chǎn)養(yǎng)殖病原微生物[8]；另一方面，由于過(guò)硫酸氫鉀分解后產(chǎn)生的硫酸根自由基（SO4-·）具有極強(qiáng)的氧化性，能夠迅速破壞微生物細(xì)胞膜的通透性， 從而使細(xì)胞內(nèi)容物流出，并且可以與核酸中的金屬離子結(jié)合，產(chǎn)生自由基， 作用于磷酸二脂鍵并使其斷裂， 也能達(dá)到抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用[9]。 過(guò)硫酸氫鉀反應(yīng)生成CO2、H2O、SO42-等產(chǎn)物過(guò)程中不生成有害的物質(zhì)，相較于其他消毒劑而言更加綠色環(huán)保[10]。 對(duì)于過(guò)硫酸氫鉀的研究主要集中在對(duì)于水處理應(yīng)用中， 例如水體中藻毒素的去除、 含氯酚廢水的降解及燃料廢水的降解， 在對(duì)飲用水的消毒上也是遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的氧化劑[12]。 過(guò)硫酸氫鉀對(duì)海水中溶藻弧菌的殺滅效果尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究在實(shí)驗(yàn)室條件下評(píng)價(jià)過(guò)硫酸氫鉀對(duì)海水貝類(lèi)育苗中常見(jiàn)致病菌溶藻弧菌的殺滅效果， 探究過(guò)硫酸氫鉀對(duì)于溶藻弧菌最優(yōu)的殺滅條件， 并進(jìn)一步探討該消毒劑在貝類(lèi)育苗水體中的使用效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 本試驗(yàn)使用的菌種為溶藻弧菌，溶藻弧菌從長(zhǎng)樂(lè)區(qū)漳港海蚌場(chǎng)的西施舌育苗池海水中分離，獲得試驗(yàn)菌種（ZHB201606053）。

1.1.2 試驗(yàn)材料 過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合鹽 （CAS 號(hào)：37222-66-5）， 西隴科學(xué)股份有限公司產(chǎn)品；TCBS培養(yǎng)基、無(wú)菌海水。

1.1.3 試驗(yàn)器材 250 mL 燒杯、150 mL 錐形瓶、電子天平、稱(chēng)量紙、玻璃棒、封口膜、培養(yǎng)皿、紫外線(xiàn)超凈臺(tái)、酒精、涂布棒、恒溫箱、200 uL 移液槍、1 mL 移液槍、10 mL 移液槍。

1.2 方法

1.2.1 單因素試驗(yàn) 在實(shí)驗(yàn)室條件下探討藥物濃度、溫度、菌液濃度和作用時(shí)間4 個(gè)單因子對(duì)過(guò)硫酸氫鉀殺滅溶藻弧菌效果的影響。 設(shè)計(jì)試驗(yàn)條件分別為過(guò)硫酸氫鉀藥物濃度（10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L），溫度（10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃）， 溶藻弧菌菌液濃度 （1×104CFU/mL、1×105CFU/mL、1×106CFU/mL、1×107CFU/mL、1×108CFU/mL），作用時(shí)間（0.5 h、1 h、6 h、12 h、24 h）。 試驗(yàn)組設(shè)6 個(gè)平行組，另設(shè)對(duì)照組，均在相應(yīng)條件下?lián)u床培養(yǎng)， 取樣涂布TCBS 固體平板檢測(cè)各組弧菌生長(zhǎng)情況，計(jì)算殺菌率。 殺菌率=[1-（試驗(yàn)組弧菌菌落數(shù)/對(duì)照弧菌菌落數(shù)）]×100%。

1.2.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在過(guò)硫酸氫鉀對(duì)溶藻弧菌單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)探討溫度、菌液濃度、 藥物濃度對(duì)過(guò)硫酸氫鉀殺滅溶藻弧菌影響的最優(yōu)條件。 將上述3 個(gè)因素按L9（34）正交表安排試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 三因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3 過(guò)硫酸氫鉀對(duì)西施舌育苗池水中弧菌的殺滅效果 按最終藥物濃度為1 mg/L、3 mg/L、5 mg/L、7 mg/L、9 mg/L、11 mg/L、13 mg/L、15 mg/L 的要求，將藥液與過(guò)濾后的西施舌育苗池海水均勻混合后作為試驗(yàn)組，每組3 個(gè)平行，分別放入25 ℃、120 r/min搖床中分別培養(yǎng)1 h、6 h、12 h、24 h；另設(shè)對(duì)照組同時(shí)培養(yǎng)。

1.2.4 菌液制備 選取西施舌育苗池養(yǎng)殖池水分離出的溶藻弧菌單菌落接種于TCBS 固體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取正常的溶藻弧菌單菌落，用滅菌海水稀釋刮取下的菌落， 經(jīng)計(jì)數(shù)稀釋制成不同菌液濃度的菌懸液供試驗(yàn)使用。

1.2.5 消毒劑溶液的配制 稱(chēng)取6 g 過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合鹽溶于50 mL 無(wú)菌海水中， 配制出初始濃度為120 g/L 的過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合鹽水溶液。根據(jù)正交試驗(yàn)方案所需的藥物濃度， 再進(jìn)一步使用無(wú)菌海水將濃度稀釋至試驗(yàn)濃度。

1.2.6 殺菌率測(cè)定 37 ℃培養(yǎng)24 h 后的培養(yǎng)皿，計(jì)數(shù)平板的菌落數(shù)， 每個(gè)試驗(yàn)組的3 個(gè)平行培養(yǎng)皿取平均值。 采用SPSS19 軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)算最終殺菌率。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度過(guò)硫酸氫鉀對(duì)溶藻弧菌殺滅效果從表2、圖1 可知，隨著過(guò)硫酸氫鉀藥物濃度提升，對(duì)溶藻弧菌的殺菌率大幅度上升， 且各個(gè)梯度之間差異性顯著。 在藥物濃度為10 mg/L～30 mg/L 時(shí)，殺菌率均＜50%，而藥物濃度達(dá)40 mg/L 時(shí)，殺菌率達(dá)到90%，過(guò)硫酸氫鉀藥物濃度與溶藻弧菌殺滅率之間存在明顯的劑量效應(yīng)。

圖1 藥物濃度對(duì)殺菌率的影響

表2 不同濃度過(guò)硫酸氫鉀殺滅溶藻弧菌試驗(yàn)結(jié)果

2.2 溫度對(duì)過(guò)硫酸氫鉀殺滅溶藻弧菌效果的影響溫度是影響消毒劑效果的重要因素之一，從表3、圖2 可知，當(dāng)溫度小于20 ℃時(shí)，殺菌率隨著溫度的上升而逐步提高，15 ℃與20 ℃的殺菌率有顯著差異；20～30 ℃殺菌率最高，但無(wú)顯著差異。因此，20～25 ℃是過(guò)硫酸氫鉀對(duì)溶藻弧菌殺滅效果最適的溫度范圍。

圖2 溫度對(duì)殺菌率的影響

表3 不同溫度下過(guò)硫酸氫鉀殺滅溶藻弧菌試驗(yàn)結(jié)果

2.3 過(guò)硫酸氫鉀對(duì)不同菌液濃度溶藻弧菌的殺滅效果 從表4、圖3 可知，隨著溶藻弧菌菌液濃度升高， 過(guò)硫酸氫鉀的殺菌作用逐漸減弱， 但104CFU/mL～106CFU/mL 殺菌率差異并不顯著； 菌液濃度106CFU/mL 與108CFU/mL 的殺菌率隨著菌液濃度升高而大幅降低，且差異顯著。

圖3 菌液濃度對(duì)殺菌率的影響

表4 不同菌液濃度下過(guò)硫酸氫鉀殺滅溶藻弧菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 過(guò)硫酸氫鉀作用時(shí)間對(duì)溶藻弧菌殺滅效果的影響 從表5、 圖4 可知， 過(guò)硫酸氫鉀的作用時(shí)間0.5 h 至6 h 的殺菌率差異不顯著，而與12 h 殺菌率差異顯著。表明過(guò)硫酸氫鉀殺菌反應(yīng)迅速，能在較短時(shí)間內(nèi)殺滅溶藻弧菌，在生產(chǎn)應(yīng)用中潛力巨大。

圖4 作用時(shí)間對(duì)殺菌率的影響

表5 不同作用時(shí)間對(duì)過(guò)硫酸氫鉀殺滅溶藻弧菌的影響

2.5 溫度、菌液濃度和藥物濃度對(duì)溶藻弧菌殺滅率的聯(lián)合影響 正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6、圖5，其中試驗(yàn)5 組與試驗(yàn)7 組的殺菌率均為100%。

圖5 正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 三因素三水平正交試驗(yàn)結(jié)果

為了探究試驗(yàn)最優(yōu)條件， 將試驗(yàn)結(jié)果輸入至SPSS19，得出各個(gè)單因素的影響情況以及方差結(jié)果分析（見(jiàn)表7）。 方差分析中，當(dāng)P＞0.05 時(shí)，該因素效果不顯著；當(dāng)0.01＜P＜0.05 時(shí)，該因素效果顯著；當(dāng)P＜0.01 時(shí)，效果極顯著。 從表8 可知，溫度的方差為0.040，處于0.01～0.05，效果顯著；菌液濃度的方差為0.060，大于0.05，則菌液濃度對(duì)溶藻弧菌的影響不顯著；藥物濃度的方差為0.003，小于0.01，可見(jiàn)過(guò)硫酸氫鉀藥物濃度對(duì)于溶藻弧菌的殺滅效果極其顯著。因此，能夠抑制溶藻弧菌的主次因素分別為藥物濃度、溫度、菌液濃度。從表8 的均值可知，過(guò)硫酸氫鉀對(duì)溶藻弧菌殺滅作用的最優(yōu)水平組合為藥物濃度40 mg/L、溫度25 ℃、菌液濃度105CFU/mL。

表7 影響殺菌率因素的方差分析結(jié)果

表8 殺菌率單因素統(tǒng)計(jì)

2.6 過(guò)硫酸氫鉀對(duì)西施舌育苗池水中弧菌的殺滅效果 從表9 殺菌率結(jié)果來(lái)看， 過(guò)硫酸氫鉀濃度為5 mg/L 以下時(shí)，不能抑制弧菌的生長(zhǎng)，弧菌數(shù)量反而有一定程度增加，之后隨著濃度增加，弧菌得到一定程度的抑制。當(dāng)藥物濃度達(dá)11 mg/L 時(shí)，滅菌率達(dá)99%；藥物濃度大于13 mg/L 時(shí)，弧菌完全被殺滅；藥物濃度大于9 mg/L 時(shí)， 藥物作用時(shí)間1～24 h 的殺菌率差異均不顯著， 表明過(guò)硫酸氫鉀藥效可以維持24 h。

表9 不同濃度過(guò)硫酸氫鉀對(duì)西施舌育苗池水弧菌的抑制效果

3 討 論

水產(chǎn)養(yǎng)殖育苗生產(chǎn)中水源的殺菌消毒是預(yù)防細(xì)菌病害的重要措施， 不同消毒劑和過(guò)高的藥物濃度可能導(dǎo)致水體中的殘留， 影響?zhàn)B殖苗種的生存和發(fā)育，過(guò)硫酸氫鉀殺菌反應(yīng)過(guò)程中不生成有害的物質(zhì)，反應(yīng)后的產(chǎn)物相較于其他消毒劑而言更加綠色安全，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中有良好的應(yīng)用前景。研究結(jié)果顯示， 過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合鹽對(duì)溶藻弧菌具有顯著的殺滅效果， 對(duì)于殺菌率影響最大的則為過(guò)硫酸氫鉀藥物濃度和溫度， 有效消毒需綜合考慮適宜的藥物濃度和溫度條件，過(guò)硫酸氫鉀在20 ℃即表現(xiàn)出很好的殺菌效果， 在海水中殺菌時(shí)間短至0.5 h均有明顯殺菌作用， 是常用的次氯酸鈉等含氯消毒劑無(wú)法匹敵的[11]。

過(guò)硫酸氫鉀的氧化能力超過(guò)了氯化物、 高錳酸鉀、過(guò)氧化氫等，而且相較于其他消毒劑來(lái)講更加衛(wèi)生與環(huán)保，且其對(duì)皮膚以及粘膜的刺激較為溫和，殺菌作用的效果更加持久， 分解后的產(chǎn)物硫酸鹽可以通過(guò)人體、 動(dòng)物體的肝臟以及泌尿系統(tǒng)很好地排出體外[12]，不僅不會(huì)對(duì)身體造成危害，排出的廢物也不會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生有害的殘留，因此被譽(yù)為“氧化性和安全性完美結(jié)合的過(guò)氧化物”[13]。 因此，將過(guò)硫酸氫鉀應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖用水的消毒是非常安全、綠色、環(huán)保的。以過(guò)硫酸氫鉀復(fù)合鹽為主，輔以有機(jī)酸、無(wú)機(jī)酸、表面活性劑等組合而成的新型過(guò)氧化物類(lèi)消毒劑，可大大降低使用濃度，適合水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)景，將為水產(chǎn)養(yǎng)殖提供一種新的綠色環(huán)保的消毒方式。