超重人群中健康者與非酒精性脂肪性肝病患者的臨床特征及血清脂質組學分析

陳小燕， 袁乙富， 杜晟楠， 曹 勤， 蔣元燁

上海中醫藥大學附屬普陀醫院消化內科， 上海 200062

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）目前已成為一種常見的慢性肝病，被認為是一種以脂質儲存和代謝紊亂為特征的疾病。NAFLD與肥胖密切相關，超過60%的肥胖人群患有NAFLD，而在非肥胖人群中，NAFLD 的患病率則較低。研究［1］表明，肥胖是NAFLD 的獨立危險因素，與正常體質量相比，肥胖導致NAFLD 的發生風險增加3.5 倍，體質量指數（BMI）與NAFLD 風險之間存在明顯的劑量依賴關系。此外，肥胖還會加速NAFLD 的發展，使其更容易進展為肝纖維化、肝硬化和肝癌等嚴重肝病。肥胖和NAFLD 之間的關系是相互作用的。肥胖患者往往伴隨胰島素抵抗和炎癥反應，這些因素都可以促進NAFLD 的發展。而NAFLD 患者中，脂肪酸（FA）釋放增加，肝臟中的脂質代謝失調，以上因素也會進一步加重肥胖的發展［2］。但是，對于單純超重的肥胖患者，其血糖、血壓及血脂等代謝功能早期可能并無明顯異常［3］。因此，超重NAFLD 患者的臨床特征及脂質代謝差異需進一步研究與探討。

脂質組學是代謝組學研究的一個新的分支，是指對生物樣本中脂質分子進行系統性和全面性分析的一種技術。脂質不僅是人體中的能量供給和儲存來源，也是構成細胞生物膜的成分，參與許多重要的代謝過程，脂質代謝途徑的改變在許多疾病的機制研究，以及預后、診斷中發揮著越來越重要的作用。近年來，基于高通量質譜技術的脂質組學已經成為研究NAFLD 的一種重要方法，通過定量和定性分析細胞、體液、組織中多種脂質代謝產物，例如FA、甘油三酯（TG）、磷脂、膽固醇等，可以更好地理解超重NAFLD 患者的發病機制，并尋找新的治療方法［4-6］。

1 資料與方法

1.1 研究對象 依據亞太地區的BMI 劃分標準［7］，將BMI＞23 kg/m2定義為超重人群。選取2020 年8 月—2021年4月本院住院部及體檢中心經超聲診斷為NAFLD且BMI＞23 kg/m2的患者作為超重NAFLD 組；另選擇同期健康體檢者中BMI＞23 kg/m2人群作為超重對照組。NAFLD 患者均符合《非酒精性脂肪性肝病防治指南（2018年更新版）》［8］的診斷標準。

納入標準：年齡≥18 歲；臨床信息完整。排除標準：（1）有過量飲酒史或飲酒問卷數據缺失者；先天性肝臟疾病、自身免疫性肝病、藥物性肝損傷和酒精性肝病；（2）合并肝外纖維化疾病，包括系統性紅斑狼瘡、風濕類疾病、腎衰竭、慢性阻塞性肺疾病、糖尿病、高血壓病、冠心病等；（3）合并心腦血管、泌尿系統、腎臟、造血系統等原發性疾病；（4）合并甲狀腺疾病，包括甲狀腺功能亢進、甲狀腺功能減退、亞臨床甲狀腺功能減退、橋本甲狀腺炎；（5）惡性腫瘤、其他嚴重合并癥或精神病；（6）孕婦及哺乳期者。

1.2 臨床資料收集 所有受試者均完成基本資料/病史資料收集、人體參數測量、血液生化指標檢查、肝臟超聲檢查。計算受試者BMI；采集受試者晨間空腹靜脈血樣本，進行血常規、肝腎功能、空腹血糖、血脂等實驗室生化指標檢測，分析儀器為Hitachi 7600d-210 全自動生化分析儀。

1.3 儀器與試劑 UltiMate 3000 超高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher 公司）；Orbitrap Elite 靜電場軌道阱質譜儀（美國Thermo Fisher 公司）；冷凍高速離心機（1730R，德國GENE公司）。甲醇（色譜純，美國Merck公司）；乙腈（色譜純，美國Sigma 公司）；其余試劑均為分析純。

1.4 血清脂質組學樣本的前處理 采集受試者晨間空腹靜脈血樣本，采血后立即放入4 ℃條件下靜置2 h，于1 000×g（離心半徑7 cm）、4 ℃條件下離心15 min，取上清液分裝后保存于-80 ℃冰箱凍存待測。脂質組學分析前，取冷凍血清60 μL，加入1 000 μL 甲基叔丁基醚、300 μL甲醇和290 μL 超純水，振蕩混勻1 min，于1 000×g、4 ℃條件下離心10 min，取上清溶液置于新離心管中冷凍干燥；干燥后的樣本中加入100 μL異丙醇-甲醇（體積比1∶1），待樣本復溶后在10 000×g、4 ℃條件下離心10 min，取上清液80 μL采用超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS/MS）進行分析。

1.5 UPLC-MS/MS 分析 應用超高效液相色譜-靜電場軌道阱質譜儀。液相分離使用ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）液相色譜柱（美國Waters公司）。流動相A 為體積比60∶40的乙腈-水溶液（含有10 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸）；流動相B 為體積比50∶50 的乙腈-異丙醇溶液（含有10 mmol/L 乙酸銨和0.1%甲酸）；流速0.3 mL/min；進樣量2 μL；柱溫45 ℃。梯度洗脫程序如下：0 min，30%流動相B；0～2.0 min，30%～43%流動相B；2.0～2.1 min，43%～55%流動相B；2.1～12.0 min，55%～65%流動相B；12.0～18.0 min，65%～85%流動相B；18.0～20.0 min，85%～100%流動相B；20.0～25.0 min，100%流動相B；25.0～25.1 min，100%～30%流動相B；25.1～30.0 min，30%流動相B。

質譜條件：離子源采用電噴霧離子源（ESI），質量分析器為靜電場軌道阱。分別在ESI正/負離子模式下采集數據，掃描范圍為質荷比50～1 000。正離子模式下，電噴霧電壓為3.0 kV，毛細管溫度為350 ℃，S-Lens RF Level設置為30%，鞘氣壓力為45 psi，輔助氣流速為5 L/min，尾氣流速為0.3 L/min。負離子模式下，電噴霧電壓為3.2 kV，毛細管溫度為350 ℃，S-Lens RF Level 設置為60%，鞘氣壓力為45 psi，輔助氣流速5 L/min，尾氣流速為0.3 L/min。

1.6 統計學方法 采用SPSS 25.0 統計學軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以xˉ±s表示，兩組間比較采用成組t檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（P25～P75）表示，兩組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗。計數資料兩組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

用于脂質組學分析的LC-MS原始數據，通過Xcalibur軟件進行采集并進行預處理，包括峰提取、峰對齊、保留時間校正、峰面積校正，隨后采用LipidSearch 軟件鑒定脂質代謝產物。將鑒定的脂質組學數據導入Simca-P 14.0 軟件進行多元統計分析，包括主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）。通過PCA 可以直觀地表現出兩組之間的差異大小并檢查是否存在異常點。脂質成分的組間比較采用GraphPad Prism 9.0軟件。

2 結果

2.1 超重NAFLD 組與超重對照組臨床資料及生化指標比較 共納入超重NAFLD 患者62 例（超重NAFLD組），超重健康體檢者50 例（超重對照組）。兩組一般資料及血液生化指標比較結果顯示，年齡、身高、體質量、BMI、RBC、Hb、Hct、尿酸、ALP、TP、Glb、GGT、ChE、ALT、AST、LDL、TC、TG、ApoB、Glu 差異均有統計學意義（P值均＜0.05）（表1）。

表1 超重NAFLD組與超重對照組一般資料及血液生化指標比較Table 1 Comparison of general data and blood biochemical indexes between NAFLD group and healthy control group in overweight people

2.2 脂質組學多元統計分析 將超重NAFLD 組和超重對照組的血清脂質數據進行PCA，得到基于正離子模式和負離子模式下的脂質PCA 圖（圖1a、b），結果顯示兩組之間存在良好的分離，說明超重人群中，NAFLD 患者的脂質譜與健康人相比有明顯差異，提示PCA 多元統計擬合模型可靠性良好。

盡管PCA 法可以有效提取主要信息，但兩組間的變量差異仍欠明晰。因此，為了探究超重NAFLD組與超重對照組之間具有差異性的主要代謝物，進一步選用有監督模式的OPLS-DA 模型進行擬合。得出的第一主成分的變量投影重要度（variable importance in the projection，VIP）可量化每個化合物貢獻的大小。選擇VIP 值＞1 的變量，并將所選的變量進行Student’st檢驗（P＜0.05），同時滿足P＜0.05且VIP值＞1的變量即為與NAFLD疾病相關的潛在生物標志物（圖1c、d）。

2.3 NAFLD 患者的血清脂質變化 基于高分辨質譜的血清脂質檢測與多元統計分析，共鑒定出兩組之間的差異脂質有493個（P＜0.05），可被歸納為12種類別；其中在超重NAFLD 組中顯著上調的脂質有143 個，顯著下調的有350 個。這些差異脂質中，兩組間差異倍數（fold change，FC）＞1.5的脂質有412個，主要包括：PC 49個、TG 111個、SM 19個、LPC 11個、DG 7個（圖2）。圖3展示了所有鑒定到的脂質在兩組之間的差異倍數及P值情況。

圖2 兩組中各類脂質含量的比較Figure 2 Comparison of the contents of lipids between the two groups

圖3 超重NAFLD組與超重對照組差異脂質的火山圖Figure 3 Volcanic diagram of lipids in overweight NAFLD group and overweight control group

為了比較兩組之間血清脂質類別的差異情況，本研究對脂質組學鑒定到的這12 類差異脂質總體含量進行了分析。結果顯示，超重NAFLD 組的總體Cer、PC、PE、PG、PI、PS、LPC、LPE、SM、FA 和DG 類脂質與超重對照組相比，差異均有統計學意義（P值均＜0.01），而總體TG含量在兩組間差異無統計學意義（P＞0.05）（圖4）。此12類脂質中，FA、LPE 和SM 的總量在超重NAFLD 組上調，其中超重NAFLD 組的平均FA 總量是超重對照組的3.6倍。

圖4 超重NAFLD組與超重對照組血清脂質類別的比較Figure 4 Comparison of serum lipids between overweight NAFLD group and overweight control group

TG以飽和鍵數3為界，＞3為多不飽和型。比較兩組間血清中不同不飽和鍵數的TG 含量，結果顯示，與超重對照組相比，超重NAFLD 組不飽和鍵數＞3 的TG 含量降低，而不飽和鍵數≤3的TG含量增多，差異均有統計學意義（P值均＜0.001）（圖5）。

圖5 超重NAFLD組與超重對照組血清TG水平比較Figure 5 Comparison of serum triglycerides between overweight NAFLD group and overweight control group

3 討論

NAFLD 與肥胖密切相關。肥胖是NAFLD 最常見的危險因素之一，脂肪組織作為胰島素的靶組織之一，可直接或間接影響胰島素抵抗的發生發展，肥胖人群的脂肪組織通過分泌多種脂肪因子、促炎因子以及招募促炎免疫細胞的浸潤等多種途徑介導代謝性炎癥的發生，從而引起β細胞損傷及胰島素抵抗，同時，高胰島素血癥也會促進肝臟中FA的新生合成。這些FA和膳食中的游離脂肪酸會被β-氧化或甘油酯化形成TG，然后被儲存在肝細胞中形成脂質滴或被包裝成極低密度脂蛋白輸出。因此，飲食過量和胰島素抵抗被認為是導致NAFLD肝脂肪積累的主要原因。

本研究中，雖然NAFLD患者與健康參與者均屬于超重人群（BMI＞23 kg/m2），但NAFLD 組的BMI 仍高于超重對照組，且差異有統計學意義（P＜0.05）。此外，NAFLD組患者的ALT、AST 水平較超重對照組顯著升高，提示NAFLD 患者有不同程度的肝損傷。原因是當脂肪在肝內堆積過多時，會損害肝細胞功能，導致肝細胞內的ALT、AST 溢出細胞外，使外周血液中ALT、AST 水平升高。此外，超重NAFLD 組的RBC、Hb、Hct 顯著升高，而較高的RBC、Hb、Hct 被認為與胰島素抵抗及代謝綜合征相關，有研究［9-11］顯示RBC、Hb、Hct 水平與NAFLD 呈正相關。

此外，與超重對照組相比，NAFLD 患者的尿酸水平顯著升高。研究［12］表明，NAFLD 患者的尿酸水平通常較高，尤其是在肥胖、高血壓、糖尿病等代謝綜合征患者中更為明顯。這可能是由于NAFLD 導致肝功能異常，使得尿酸代謝能力下降，從而造成尿酸水平升高。還有研究［13］指出，在肥胖的NAFLD 患者中，合并高尿酸血癥者發生嚴重肝脂肪變性的概率較高，而在非肥胖人群中卻沒有相似現象。高尿酸也可導致胰島素抵抗，激活腎素-血管緊張素系統，加劇線粒體氧化應激，從而導致NAFLD 的發生。Glu 升高與胰島素抵抗直接相關，TC、TG、LDL 增高與肝脂肪沉積有關，也增加了肝臟的胰島素抵抗［14］。本研究中，超重NAFLD 組Glu、TC、TG、LDL顯著高于超重對照組，同樣提示了胰島素抵抗可能是超重NAFLD患者與超重健康人群之間的重要差異。

脂質組學結果顯示，與超重對照組相比，大多數鑒定出的脂質在超重NAFLD 患者中下調，但是FA 在NAFLD組顯著增高。有研究［15］表明，NAFLD 與胰島素抵抗有關，在胰島素抵抗的情況下，脂肪組織對胰島素的抗脂解作用產生抵抗力，FA 的釋放增加。胰島素抵抗伴隨著胰島素水平升高，在脂肪分解增加和/或脂肪攝入增加的情況下，均會促進肝臟TG 合成。亦有研究［16-17］發現，FA水平與BMI呈正相關，這可能是因為BMI反映了體內脂肪組織的含量，而脂肪組織是FA 的主要來源。同時，FA 水平的升高可能加重肝脂肪沉積、氧化應激和纖維化，從而促進NAFLD的進展［18］。

TG 是一種脂類物質，在基本的細胞生命活動中發揮重要作用。高水平的血清TG 與代謝紊亂和心血管疾病有關。有研究［19］指出，NAFLD 在TG 酰基鏈組成上的差異遵循一種模式，即NAFLD 中短鏈和飽和脂肪酰基含量較高，而含多不飽和脂肪酸的TG 含量較低。另有部分脂質組學研究［20-22］表明，脂肪變性受試者血漿中的TG 和DG 增加。這可能與FA 從脂肪變性的肝臟中自噬釋放增多，或上調的新生脂肪合成增多有關，進而導致極低密度脂蛋白分泌增多。

盡管本研究中觀察到超重NAFLD的TG種類有增加的趨勢，但與超重對照組相比并沒有顯著差異，這可能是因為測試了大量的TG種類，導致數據冗余而沒有進一步分組劃分研究所致。故本研究進一步將TG 按照不飽和鍵數＞3 和≤3 劃分，結果顯示兩組之間有顯著差異，即NAFLD 患者的TG 中飽和脂肪酰基含量較高，而含多不飽和脂肪酸的TG 較低。這可能是由于高胰島素水平驅動從頭脂肪生成，導致產生飽和脂肪酸。細胞將飽和脂肪酸儲存為TG 的能力達到極限，造成了這種血液中TG組成的變化。此外，單不飽和脂肪酸的產生由甾酰輔酶A（CoA）去飽和酶的活性驅動，該酶依賴于SREBP-1 蛋白。以往有研究［23］表明，由于高胰島素血癥，NAFLD 中的甾醇CoA去飽和酶和SREBP-1激活增加。

綜上所述，本研究納入的超重NAFLD 組患者雖多項臨床生化指標處于正常區間，但是與超重健康人群相比，NAFLD 患者中許多與代謝綜合征、胰島素抵抗及肝功能損傷相關的生化指標仍顯著升高，提示NAFLD 患者除脂肪肝這一病理性表現之外，還有潛在的其他代謝綜合征的風險。脂質組學結果顯示超重NAFLD 患者與超重對照組相比較，血液內FA 明顯升高；TG 中的含飽和脂肪鏈的種類顯著升高，而含多不飽和脂肪酸的種類則較低。本研究提示，與健康的超重人群相比，NAFLD患者存在胰島素抵抗的情況。以上結果不僅有助于進一步認識超重人群中NAFLD 的發病機制，也為超重人群特異性的預防、監測以及治療NAFLD提供了見解。

倫理學聲明：本研究方案于2020 年7 月16 日經由上海中醫藥大學附屬普陀醫院倫理委員會審批，批號：PTECA-2020-29-1。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：陳小燕負責撰寫論文；袁乙富、杜晟楠負責數據收集及處理；曹勤、蔣元燁負責擬定寫作思路并最后定稿。