基于生物信息學(xué)的醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)課程案例設(shè)計

王 哲,祁 冉,劉媛媛,高 路△

1.中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,上海 200433;2.中國人民解放軍海軍航空大學(xué)青島校區(qū)航空工程基礎(chǔ)教研室,山東青島 264001

隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展,其在醫(yī)學(xué)臨床上的應(yīng)用日益廣泛,例如,高通量測序和生物信息學(xué)分析可為出生缺陷三級預(yù)防、遺傳病輔助診斷和腫瘤靶向治療等提供依據(jù)[1]。醫(yī)學(xué)院校的學(xué)生不論將來從事臨床工作還是相關(guān)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究工作,都需要掌握一定的生物信息學(xué)知識和數(shù)據(jù)分析技能,以配合臨床檢測報告解讀和研發(fā)新的診斷、治療方法等。這些生物信息學(xué)知識與醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)主干課程具有天然的聯(lián)系,因此,在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)課程教學(xué)中適當(dāng)增加生物信息學(xué)分析示例教學(xué)對學(xué)生深入理解基礎(chǔ)知識、提高綜合素質(zhì)具有重要意義。但是,生物信息學(xué)是宏觀概念,其研究范圍廣、相關(guān)方法繁雜,涉及多種計算機語言編程和數(shù)學(xué)模型算法,與醫(yī)學(xué)知識結(jié)構(gòu)存在較大差異。因此,對醫(yī)學(xué)生進(jìn)行生物信息學(xué)教學(xué)需要從學(xué)生的專業(yè)背景、知識結(jié)構(gòu)和目標(biāo)需求等角度出發(fā),科學(xué)設(shè)立教學(xué)目標(biāo)、規(guī)劃教學(xué)內(nèi)容、探索教學(xué)方法,在促進(jìn)學(xué)生綜合素質(zhì)的同時,不過多增加學(xué)生的課程負(fù)擔(dān)。因此,本研究嘗試將生物信息學(xué)的方法、實際操作與學(xué)生的專業(yè)學(xué)習(xí)相結(jié)合。在理論課程中尋找一個知識點,結(jié)合權(quán)威文獻(xiàn)介紹相關(guān)研究的最新進(jìn)展,對文獻(xiàn)涉及的主要生物信息學(xué)方法進(jìn)行理論講解、分析示范和結(jié)果解讀,讓學(xué)生初步了解分析步驟,掌握分析結(jié)果的解讀方法,有興趣的學(xué)生可以進(jìn)一步進(jìn)行實戰(zhàn)分析練習(xí)和分組討論。以期讓學(xué)生在擴展專業(yè)知識、了解國際前沿進(jìn)展的同時學(xué)習(xí)生物信息學(xué)分析方法。相對于知識灌輸型的傳統(tǒng)課堂,在課程設(shè)計過程中結(jié)合“以學(xué)生為中心”的教學(xué)理念[2-4],最大程度發(fā)掘?qū)W生的自主學(xué)習(xí)能力和自我能動性。本研究結(jié)合《生理學(xué)》內(nèi)分泌章節(jié)的相關(guān)知識點[5],設(shè)計了一次課程的基本教學(xué)內(nèi)容,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1知識點引入 在《生理學(xué)》內(nèi)分泌章節(jié)中,下丘腦-垂體系統(tǒng)是其重點內(nèi)容。首先對該知識點進(jìn)行簡要回顧[5]：(1)下丘腦神經(jīng)細(xì)胞分泌促釋放激素和釋放抑制激素,腺垂體釋放促靶腺激素和直接作用激素,包括生長素、催乳素、促黑激素、促甲狀腺激素、促腎上腺皮質(zhì)激素、促卵泡激素和促黃體激素等[2]。(2)生長素在促進(jìn)生長過程中具有重要作用,幼年時期生長素分泌不足,可導(dǎo)致侏儒癥;幼年時期生長素分泌過多,可導(dǎo)致巨人癥,若成年時期生長素分泌過多,可導(dǎo)致肢端肥大癥,其中垂體瘤是造成生長素分泌過多的重要原因之一。

1.2知識點延伸

1.2.1對垂體神經(jīng)內(nèi)分泌瘤進(jìn)行延伸介紹 (1)垂體神經(jīng)內(nèi)分泌瘤是最常見的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤,發(fā)病率在腦腫瘤中居第2位。(2)臨床表現(xiàn):占位效應(yīng)和激素過度分泌,導(dǎo)致視力下降、停經(jīng)、溢乳、肢端肥大等,累及全身多個重要臟器[6]。(3)分類:根據(jù)激素分泌和免疫組化分為10種亞型[7-8]。在臨床治療上,明確腫瘤起源和分化程度有助于預(yù)測患者預(yù)后情況。然而現(xiàn)有分類方式不能明確不同腫瘤亞型的起源。因此,需要基于腫瘤起源和分化程度進(jìn)行垂體瘤分子分型,從而預(yù)測腫瘤遠(yuǎn)期預(yù)后。

1.2.2介紹相關(guān)生物信息學(xué)技術(shù) (1)傳統(tǒng)技術(shù)的限制:傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組測序?qū)M織直接進(jìn)行RNA提取及建庫測序,這樣獲得的轉(zhuǎn)錄組結(jié)果將各種細(xì)胞類型混合,無法區(qū)分細(xì)胞類型間的差異。如,在分析免疫微環(huán)境時,無法區(qū)分T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等不同類型免疫細(xì)胞;在分析腫瘤細(xì)胞時,無法精確分辨腫瘤細(xì)胞與癌旁細(xì)胞、腫瘤干細(xì)胞與高度分化細(xì)胞等,這不利于腫瘤分子分型,也不利于分析不同特征腫瘤細(xì)胞間的差異。(2)單細(xì)胞測序:單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的出現(xiàn)實現(xiàn)了分別對每個細(xì)胞進(jìn)行建庫測序[9]。通過分析單個細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組特征,確定其細(xì)胞類型或細(xì)胞亞型,然后分析各個細(xì)胞類型或亞型的特征、類型間的基因表達(dá)差異及不同細(xì)胞類型間的相互作用關(guān)系等[10-11]。這有助于檢測并比較正常組織器官與各亞型腫瘤細(xì)胞的特征差異,發(fā)現(xiàn)稀有細(xì)胞類型,揭示腫瘤細(xì)胞來源,進(jìn)行精確分子分型[7]。

1.2.3前沿研究實例講解 這部分內(nèi)容可以由學(xué)生分組進(jìn)行文獻(xiàn)講解。以ZHANG等[7]發(fā)表的論文為例。該團隊通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)檢測了21例垂體瘤組織和3例健康成人垂體前葉組織(對照)中合計64 937個細(xì)胞。解析了正常垂體的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜,發(fā)現(xiàn)在PIT1譜系內(nèi),有一群內(nèi)分泌細(xì)胞(PIT1_I)不表達(dá)經(jīng)典的垂體激素(生長素、催乳素、促甲狀腺激素),這群細(xì)胞最接近胚胎時期PIT1祖細(xì)胞的狀態(tài),命名為成人PIT1祖細(xì)胞。

為了探索垂體瘤的起源和分化程度,研究人員將正常垂體和垂體瘤的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜進(jìn)行整合分析;對垂體瘤各細(xì)胞亞群進(jìn)行打分和重新分組,將各個譜系的垂體瘤劃分為高分化組和低分化組;同時探索了每個分組特征性分子標(biāo)志物、轉(zhuǎn)錄因子活性、富集通路等特征,篩選可能有助于預(yù)測腫瘤遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)的標(biāo)志物。最后研究人員在垂體瘤患者隊列中,驗證了候選標(biāo)志物預(yù)測腫瘤遠(yuǎn)期復(fù)發(fā)的有效性[8]。

1.3講解與演示 首先進(jìn)行示教講解,利用GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中GSE205418單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行基本的生物信息學(xué)分析示范。該數(shù)據(jù)是10X Genomics平臺測序結(jié)果,并通過官方軟件Cell Ranger v3.1.0[12]將原始數(shù)據(jù)處理為表達(dá)譜矩陣(包含 barcodes.tsv.gz,features.tsv.gz和matrix.mtx.gz),采用R語言進(jìn)行下游分析[13-14]。

(1)首先,打開R軟件后,加載分析需要的R包:library(Seurat)library(harmony)library(dplyr)。

(2)以其中1個樣本為例,讀入數(shù)據(jù):pr_name="Shili" #項目名稱,可以自己定義。input_dir ="～/Desktop/Shili_1" #barcodes.tsv.gz,features.tsv.gz和matrix.mtx.gz 3個文件的位置,這里文件名不能修改。Data1<- Read10X(data.dir = input_dir) #讀入Shili_1文件夾中的文件,導(dǎo)入數(shù)據(jù)。Or_ident= factor(c(rep("Sample1",ncol(Data1)))) #定義樣本名"Sample1"。Data1= CreateSeuratObject(counts = Data1,project = pr_name) #創(chuàng)建Seurat對象,用于后續(xù)分析。Data1@meta.data$orig.ident< -as.factor(Or_ident) #見過定義的樣本名加入Seurat對象。Data1["percent.mt"] <- PercentageFeatureSet(object = Data1,pattern = "^mt-") #計算每個細(xì)胞表達(dá)線粒體基因的比例,一般認(rèn)為表達(dá)線粒體基因比例過大的細(xì)胞,其細(xì)胞狀態(tài)不好,可去掉。但是其具體標(biāo)準(zhǔn)無統(tǒng)一要求,可結(jié)合前人相似樣本的過濾標(biāo)準(zhǔn)。P1=VlnPlot(Data1,features=c("nFeature_RNA","nCount_RNA","percent.mt"),group.by="orig.ident") #對細(xì)胞表達(dá)線粒體基因比例、細(xì)胞表達(dá)基因數(shù)和捕獲UMI數(shù)進(jìn)行可視化,結(jié)果見圖1。

注:A為樣本1中每個細(xì)胞檢測到的RNA數(shù)目;B為樣本1中每個細(xì)胞檢測到的RNA表達(dá)總量;C為樣本1中每個細(xì)胞表達(dá)的線粒體基因百分比。

Data1=subset(Data1,percent.mt <20 &nFeature_RNA >800 &nCount_RNA >1 000) #過濾低質(zhì)量細(xì)胞,這里僅保留表達(dá)線粒體基因比例小于20%、表達(dá)基因數(shù)大于800且UMI數(shù)大于1 000的細(xì)胞,可以根據(jù)實際情況調(diào)整。P2=VlnPlot(Data1,features=c("nFeature_RNA","nCount_RNA","percent.mt"),group.by="orig.ident") #對過濾后細(xì)胞質(zhì)量進(jìn)行可視化,見圖2。

注:A為樣本1中每個細(xì)胞檢測到的RNA數(shù)目;B為樣本1中每個細(xì)胞檢測到的RNA表達(dá)總量;C為樣本1中每個細(xì)胞表達(dá)的線粒體基因百分比。

對于第2個樣本,讀入數(shù)據(jù),方法同上。

(3)多個樣本時,對樣本1(Data1)和樣本2(Data2)進(jìn)行數(shù)據(jù)整合:All=merge(Data1,Data2) #合并數(shù)據(jù);All=NormalizeData(All) #數(shù)據(jù)歸一化處理,減少文庫測序深度的影響;All=FindVariableFeatures(All,selection.method = "vst",nfeatures = 2000) #鑒定細(xì)胞間表達(dá)量相差大的前2 000個基因,用于后續(xù)鑒定細(xì)胞類型;All=ScaleData(All) #數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化;All=RunPCA(All,pc.genes=All@var.genes,npcs =50,verbose = FALSE) #PCA降維并提取主成分,用于后續(xù)細(xì)胞降維;All=RunHarmony(All,group.by.vars="orig.ident",plot_convergence = TRUE) #按照"orig.ident"(樣本名稱)去除批次效應(yīng)。

(4)對細(xì)胞進(jìn)行降維、分群,見圖3:All=All %>% RunUMAP(reduction = "harmony",dims= 1:50) %>% #降維算法UMAP;RunTSNE(reduction = "harmony",dims = 1:50) %>% #降維算法tSNE,UMAP和TSNE二選一即可;FindNeighbors(reduction = "harmony",dims = 1:50) %>% FindClusters(resolution = 1) %>% #resolution 參數(shù)相當(dāng)于放大鏡,數(shù)值越大,分群越細(xì)致。 identity(P3)=DimPlot(All,reduction = "umap",group.by= "seurat_clusters") #按照無監(jiān)督聚類的細(xì)胞群進(jìn)行可視化。P4=DimPlot(All,reduction = "umap",group.by = "orig.ident") #按照樣本進(jìn)行可視化。save(All,file="All.Rdata") #保存Seurat對象。

注:A為細(xì)胞降維聚類后的類群分布;B為細(xì)胞降維聚類后的樣本分布;UMAP為均勻流形近似和投影,是一種非線性降維和可視化算法。

(5)計算各個細(xì)胞群的特征基因,見圖4:DEG=FindAllMarkers(All,only.pos=T)Head(DEG)avg_log2FC表示該基因在組合間的差異倍數(shù);cluster表示該基因在對應(yīng)的細(xì)胞群中高表達(dá);pct.1表示在當(dāng)前細(xì)胞群中檢測到的表達(dá)該基因的細(xì)胞比例;pct.2表示在其他細(xì)胞群中檢測到的表達(dá)該基因的細(xì)胞比例;p_val_adj表示該基因的矯正P值;gene表示基因名稱。

圖4 特征基因計算結(jié)果示例

(6)細(xì)胞類型鑒定:根據(jù)每個細(xì)胞群的特征基因鑒定該細(xì)胞群對應(yīng)的細(xì)胞類型,見表1。除了這些常見類型,其余細(xì)胞類型需要根據(jù)自己分析的樣本來查閱文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫,如CellMarker數(shù)據(jù)庫(http://xteam.xbio.top/CellMarker/)等[15]。

表1 常見細(xì)胞類型和分子標(biāo)記

(7)其他分析:后續(xù)分析可以對比不同樣本類型中各個細(xì)胞類型數(shù)目的差異,尋找特有或稀有細(xì)胞類型;鑒定同一細(xì)胞類型不同樣本之間的基因表達(dá)差異,如腫瘤組織和正常組織之間的差異特征基因、細(xì)胞類型之間的相關(guān)關(guān)系、同一細(xì)胞類型不同亞型之間的發(fā)育軌跡及發(fā)育過程中的重要基因等。

1.4學(xué)生分組討論與現(xiàn)場實操 后續(xù)分析可讓學(xué)生分組學(xué)習(xí)、探索與現(xiàn)場實操,將遇到的問題反饋給教師,增強教學(xué)互動,發(fā)揮學(xué)習(xí)者的能動性,利用學(xué)生多元化的學(xué)習(xí)需求推動優(yōu)化教學(xué)設(shè)計。這有利于后續(xù)教學(xué)中細(xì)化需要達(dá)成的教學(xué)目標(biāo),分步驟實現(xiàn),不斷提升課程內(nèi)容和質(zhì)量,加強學(xué)生的綜合能力培養(yǎng)。

2 結(jié) 果

在本次授課中,學(xué)生回顧了生理學(xué)課程中重要的知識點,即下丘腦-垂體系統(tǒng)。通過文獻(xiàn)擴展了解了垂體瘤的現(xiàn)行分類標(biāo)準(zhǔn)、現(xiàn)行分類標(biāo)準(zhǔn)的不足之處,以及國內(nèi)外相關(guān)研究前沿提出的對這些不足的解決方案。在教學(xué)內(nèi)容中引入學(xué)科領(lǐng)域的最新成果,更新和完善講解內(nèi)容。以國內(nèi)外最新研究成果為牽引,讓學(xué)生具備基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)專業(yè)知識的同時培養(yǎng)其國際視野,將人才培養(yǎng)與社會需求相結(jié)合。通過這一系列學(xué)習(xí)不僅擴展了學(xué)生在相關(guān)問題上的知識儲備,而且培養(yǎng)了學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題、分析問題和解決問題的科研能力。

此外,對文獻(xiàn)中所用的主要生物信息學(xué)方法進(jìn)行講解和分析示范,對分析結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)解讀。一方面告訴學(xué)生什么是生物信息學(xué),生物信息學(xué)有什么用處;另一方面也鼓勵學(xué)生在課堂示范的基礎(chǔ)上自主探索和學(xué)習(xí),為學(xué)生未來從事臨床或基礎(chǔ)研究工作奠定一定基礎(chǔ)。同時,通過課程學(xué)習(xí),激發(fā)了學(xué)生對臨床和科研工作的興趣,讓學(xué)生在未來工作中從實際出發(fā),敬業(yè)奉獻(xiàn)。

3 討 論

隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展,其與醫(yī)學(xué)臨床檢驗和基礎(chǔ)研究的聯(lián)系越來越緊密。因此,在醫(yī)學(xué)生本科學(xué)習(xí)階段開展生物信息學(xué)授課對提高學(xué)生綜合能力具有重要幫助。但是,在教學(xué)設(shè)計和實施過程中應(yīng)注意以下問題:(1) 在授課教師的培訓(xùn)方面,該課程要求教師掌握計算機語言應(yīng)用和生物信息學(xué)分析方法;同時,授課教師應(yīng)具有良好的醫(yī)學(xué)理論基礎(chǔ),關(guān)注醫(yī)學(xué)國際前沿研究發(fā)展,能夠結(jié)合學(xué)生的醫(yī)學(xué)專業(yè)背景和專業(yè)知識進(jìn)行教學(xué)實踐,同時緊跟國際前沿研究進(jìn)展、與時俱進(jìn)。(2) 在教學(xué)過程中應(yīng)注意各個環(huán)節(jié)的時間分配,同時可設(shè)計翻轉(zhuǎn)課堂,案例分析,小組討論、現(xiàn)場實操等環(huán)節(jié),例如,①在介紹基礎(chǔ)課程知識點時以回顧為主,內(nèi)容不宜過多;②講解相關(guān)文獻(xiàn)時,可由學(xué)生分組對教師指定文獻(xiàn)進(jìn)行解讀。學(xué)生講解之后,進(jìn)行互動提問和教師總結(jié);③數(shù)據(jù)分析講解與示例部分主要由教師進(jìn)行講解和示范,與學(xué)生互動提問、現(xiàn)場實操和分組討論,該部分是主要環(huán)節(jié),可分配較長時長。(3) 在課程設(shè)置上應(yīng)充分考慮臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)研究的需要,設(shè)置實用的生物信息學(xué)課程內(nèi)容。例如,概括介紹高通量測序的概念、常見技術(shù)、應(yīng)用領(lǐng)域等。在后續(xù)具體教學(xué)實例中可結(jié)合文獻(xiàn)進(jìn)行常用的高通量方法的應(yīng)用示范,例如,一代測序、全外顯子測序、全基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序、甲基化測序等。(4) 采用“以學(xué)生為中心”的教學(xué)模式[2-4],應(yīng)關(guān)注學(xué)生在大量互動和自主學(xué)習(xí)模式下的學(xué)習(xí)效果。考查學(xué)生對知識的理解和熟悉情況,以及對教學(xué)模式的適應(yīng)情況。與之配套的考核方式應(yīng)將相當(dāng)?shù)谋戎胤胖迷谶^程性考核上,關(guān)注學(xué)生在分組中的表現(xiàn),注重檢驗學(xué)生能力提升情況。量化教學(xué)評價,培養(yǎng)德才兼?zhèn)涞母咚刭|(zhì)創(chuàng)新型人才。(5) 在課程設(shè)置時應(yīng)注重挖掘課程的思想政治元素,結(jié)合醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)課程的特點,利用學(xué)習(xí)思維方法引領(lǐng)價值觀,增強職業(yè)認(rèn)同感,使學(xué)生更好地肩負(fù)起維護和促進(jìn)人民群眾身體健康的重要使命。

通過本文中這一系列課程設(shè)置,讓學(xué)生回顧本專業(yè)知識點的同時進(jìn)一步擴大知識面,了解國際前沿的新發(fā)現(xiàn)、新理論。同時培養(yǎng)學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題、分析問題和解決問題的能力。再通過相關(guān)生物信息學(xué)方法的講解、分析示范和結(jié)果解讀,讓學(xué)生在學(xué)習(xí)過程中了解生物信息學(xué)分析的一般方法、掌握對分析結(jié)果的解讀,將臨床與科研相結(jié)合,提高學(xué)生綜合能力。