甲狀腺全切+L-T4皮下注射建立孕期亞臨床甲減大鼠模型及穩定性研究*

李曉鈺,付 強,黃楊玲,謝良卓,陳 巍,2△

(1.遼寧中醫藥大學研究生學院,遼寧 沈陽 110847;2.遼寧中醫藥大學附屬第二醫院干診科,遼寧 沈陽 110034)

亞臨床甲狀腺功能減退癥(SCH)簡稱亞臨床甲減,其主要特點是血清促甲狀腺激素(TSH)升高,而血清游離甲狀腺素(FT4)水平正常[1-2]。SCH在我國的患病率為16.7%[3],其中妊娠期SCH的發病率占2.0%～5.0%[4],因其可影響后代腦發育及增加母體流產的發生率而被重視,但關于該病的發病機制尚未明確,是內分泌領域研究的熱點問題。因此,更好地建立妊娠期SCH大鼠模型對該病的研究具有重要意義。本研究應用甲狀腺全切術+L-T4皮下注射的方法進行孕期SCH大鼠造模,并對其進行模型評價。

1 材料與方法

1.1研究對象 實驗對象為26只體重在180～200 g的雌性SD大鼠(購自北京華阜康生物科技股份有限公司),實驗動物許可證號為:SCXK(京)2019-0008。SD大鼠飼養于遼寧中醫藥大學動物實驗中心(SPF級實驗室),給予普通飼料適應性喂養1周。

1.2方法

1.2.1實驗用藥 T4(美國Sigma公司,XW00514 891);乳酸鈣(批號:C190420P)。

1.2.2分組與造模 將26只SD大鼠在SPF級實驗室經適應性喂養1周后,并進行分組,隨機分為2組(對照組10只,模型組16只)。術前禁飲24 h,用10%、0.35 mL/100 g劑量的水合氯醛注射液進行腹腔注射麻醉,術中局部切口給予23單位注射用青霉素鈉鹽3～4滴以防感染,術后對照組給予高鈣水。具體操作:模型組將大鼠呈仰臥姿勢固定在實驗室手術板上,頸部進行備皮,然后用75%濃度的乙醇局部消毒,鋪巾,沿胸骨向前行1.5～2.0 cm的頸部正中切口,鈍性分離皮下組織,逐一鈍性分離結締組織、肌肉層,可見一呈蝴蝶型粉色附著于氣管上的甲狀腺組織,將氣管與兩側肌肉分離,取甲狀腺底部,剝離,并將小塊棉球塞于術側進行止血,再用上述方式處理對側。注意要將氣管上的甲狀腺峽部剝離,術中避免損傷頸部動脈與靜脈血管,避免長時間夾持氣管。切口用生理鹽水進行沖洗,再用無菌紗布擦干術野,在切口處滴注23單位的注射用青霉素鈉鹽3～4滴以防止感染,后將肌肉、皮膚切口分層縫合。術后予以普通飼料和0.1%乳酸鈣飲用水飼養,以防術后缺鈣。對照組僅充分暴露甲狀腺后,立即縫合。術后1個月,2組大鼠進行眶后靜脈叢取血,離心后取上清液,存放于EP管中待檢測。

當模型組血清TSH值高于對照組最大值,且TT4值小于對照組最小值時,則提示甲狀腺全部切除干凈,模型組予以L-T41.0 μg/(100 g·d)皮下注射,對照組給予等劑量生理鹽水皮下注射,每天檢測體重,根據體重調整L-T4給藥劑量,10 d后再次檢測血清TSH、TT4。當模型組血清TSH值高于對照組最大值,且TT4值與對照組數值無明顯差異時,則提示非孕期SCH模型建立成功。非孕期SCH模型建立成功后,以雌鼠:雄鼠=2:1的比例進行合籠交配,每天進行陰道涂片,當雌鼠的陰道涂片在鏡下發現精子時,記為妊娠0 d即E0,妊娠13 d記為E13,并在此期間皮下注射L-T4。

1.2.3指標監測 監測2組大鼠術后1個月、甲狀腺全切+L-T410 d后、E13這3個時間點的血清TSH、TT4水平和體重,以及各組大鼠平均產子數量及生產率。采用ELISA方法檢測血清TSH水平(術后TSH檢測試劑盒:武漢優爾生;CEA463Ra-48T/術后+L-T4TSH檢測試劑盒:德國LDN;ARE-8600-48T/E13TSH檢測試劑盒:CEA463Ra)。采用放免法檢測TT4水平(中國醫科大學放射免疫科檢測)。

2 結 果

2.12組大鼠不同時期血清TSH水平變化比較 模型組大鼠術后1個月血清TSH水平高于對照組,差異有統計學意義(P<0.01)。甲狀腺全切+L-T410 d后,模型組大鼠血清TSH水平高于對照組,差異有統計學意義(P<0.01)。妊娠13 d時,模型組大鼠血清TSH水平明顯高于對照組,差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 2組大鼠不同時期血清TSH水平變化比較

2.22組大鼠不同時期血清TT4水平變化比較 模型組大鼠術后1個月血清TT4水平小于對照組,差異有統計學意義(P<0.01)。2組大鼠甲狀腺全切+L-T410 d后血清TT4水平比較,差異無統計學意義(P>0.05)。妊娠13 d時,2組大鼠TT4水平比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 2組大鼠不同時期血清TT4水平變化比較

2.32組大鼠不同時期體重變化比較 2組大鼠術前體重比較,差異無統計學意義(P>0.05)。術后1個月、甲狀腺全切+L-T410 d,模型組大鼠體重明顯低于對照組,差異有統計學意義(P<0.01)。妊娠13 d時,模型組大鼠體重明顯低于對照組,差異有統計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 2組大鼠不同時期體重比較

2.42組大鼠平均產子數及生產情況比較 2組大鼠平均產子數均為12只,差異無統計學意義(P>0.05)。對照組大鼠生產率[90.00%(9/10)]高于模型組[43.75%(7/16)],但差異無統計學意義(P>0.05)。

3 討 論

妊娠期SCH是一種內分泌疾病,其對妊娠結局有著顯著的不良影響,如流產、妊娠期高血壓、胎盤早剝、先兆子癇、妊娠糖尿病、宮內生長受限、早產和低出生體重[5-8]。此外母體甲狀腺激素水平對維持正常的妊娠和胎兒生長發育起著關鍵作用,與后代的神經智力發育障礙密切相關[9]。妊娠期母體甲狀腺激素需求持續增長,若孕婦無法適應甲狀腺激素應激反應,易導致內分泌紊亂,增加妊娠期甲狀腺功能減退風險[10]。相關研究指出,妊娠期SCH同樣可增加不良妊娠結局風險[11]。甲狀腺激素在胎兒腦發育過程中占據著重要地位,在妊娠12周以前,胎兒甲狀腺功能尚未完全建立,胎兒腦發育所需的甲狀腺激素幾乎全部依賴于母體供給[12];如果在妊娠期間,母體發生甲狀腺激素缺乏,將會對胎兒神經系統的發育造成明顯且不可逆轉的損傷[13],可引起記憶力減退及情感行為障礙,其發病機制與腦組織處于輕微甲狀腺激素缺乏有關[14]。由于SCH具有隱匿性、無明顯癥狀反應,僅有TSH水平呈輕度或中度升高,易被臨床篩查忽略或漏診,因此妊娠期SCH患病率并未得到控制[15]。

妊娠中的SCH具有越來越重要的臨床意義,因此建立可靠的模型是進行各項研究的基礎與關鍵。目前,SCH的造模方式分為2種:第1種是應用抗甲狀腺藥物,例如甲巰咪唑飲水喂養構建SCH模型[3];第2種是應用甲狀腺全切術再植入L-T4微滲泵,并根據體重的變化調整L-T4給藥劑量來構建SCH模型[16]。由于抗甲狀腺藥物致使母鼠SCH的同時還會影響胚胎的發育,所以一般采用甲狀腺全切術再植入L-T4微滲泵作為比較理想的造模方式。在母鼠品種的選擇上,SD大鼠和Wistar大鼠是目前使用最多、應用最廣泛的2個品系,主要應用于生理學、營養學、藥理學、毒理學、腫瘤學及環境污染與人類健康等研究[17]。與Wistar大鼠相比,SD大鼠產仔多、生長發育快、適應性和抗病能力更強[18]。有研究表明,保持在室溫下的SD大鼠具有更高的生長率和食物轉化率[19],且SD大鼠的胎兒畸形率和變異率較低[20]。如果進行發育型研究,則選用SD大鼠造模更為合適。迄今為止,已經明確人類和大鼠孕期與甲狀腺激素相關主要事件發生的對應時間:母鼠E13(T3受體在胚胎大腦表達)相當于人類妊娠12周[21]。因此,本實驗選用SD大鼠建立理想的動物實驗模型。本實驗采用甲狀腺全切術,再行L-T4皮下注射法建立非孕期SCH大鼠模型,并在人類與大鼠孕期甲狀腺激素水平相對應的時間點進行血清TSH、TT4的測定,以確定孕期SCH大鼠模型建立是否成功。與對照組比較,模型組大鼠血清TSH明顯升高、TT4無明顯差異,則提示孕期SCH大鼠模型建立成功。本研究結果表明,采用甲狀腺全切術、1.0 μg/(100 g·d)L-T4皮下注射可以成功建立非孕期SCH大鼠模型,并在大鼠E13時測定血清TSH、TT4水平,與對照組比較,血清TSH水平明顯升高、TT4水平無明顯差異,則證明大鼠仍處于SCH狀態,說明大鼠妊娠E0～E13給藥劑量可不做改變。

綜上所述,采用SD大鼠行甲狀腺全切術,再行L-T4皮下注射法可以成功建立穩定的孕期SCH動物模型,為今后尋求治療該疾病更有效的方法及更好地控制妊娠期SCH的發展提供基礎。