高寒草甸退化程度對優勢物種根際土壤真菌群落和生態網絡的影響

馬源，王曉麗，馬玉壽，張德罡

（1.青海大學畜牧獸醫科學院，三江源區高寒草地生態教育部重點實驗室，青海省高寒草地適應性管理重點實驗室，青海 西寧 810016；2.甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730070）

高寒草甸作為全球范圍內分布最廣、面積最大的高寒生態系統之一，在維持地球生態系統穩定方面具有重要意義。我國高寒草甸主要分布在青藏高原，并占其總面積的2/3 左右，約為0.7×108hm2，在維持該區域生物多樣性、調節氣候、防止土壤侵蝕、固碳增匯和涵養水源等生態功能方面具有重要作用［1］。由于其特殊的下墊面構造和環境氣候，高寒草甸本身的生態環境十分脆弱［2］。而近些年，由于全球性的氣候變化和人為活動等因素的共同影響，致使高寒草甸生態系統出現了大規模、持續性和不可逆的退化現象［3］，從而嚴重影響了草地的系統生產力、穩定性和可持續性，使青藏高原東緣的生態環境和生物多樣性受到一定程度的威脅，嚴重制約了當地畜牧業的可持續、高質量發展。

作為土壤生態系統中重要的組成部分，土壤微生物在協同植物參與養分轉化和循環方面發揮著主導作用［4］。土壤微生物具有對外界環境極為敏感的特點，其結構和功能可迅速響應草地植被種類和數量的改變，被認為是評價土壤健康的關鍵指標［5］。而真菌作為土壤微生物區系中重要的成員之一，在參與土壤養分循環、維持植物正常生長和營養平衡等方面具有重要作用，是草地生態系統中的核心驅動力［6］。當草地發生退化時地上植被群落、數量和優勢物種將會發生根本性改變，影響植物的根系分泌物，使根系周圍的微生物群落結構和功能發生改變，從而在“植物—土壤—微生物”的共同作用下形成復雜的微生境，產生了“根際效應”［7］。而根際作為植物、土壤和微生物三者的交互界面，其中根際微生物最為活躍，存在豐富的微生物多樣性，是植物根系和土壤之間的營養調控樞紐［8］。因此，植物群落可以通過宿主-微生物的直接相互作用和根際效應來影響微生物群落。綜上所述，草地發生退化時根際真菌群落結構、功能和多樣性可被作為衡量草地生態系統穩定和健康的重要指標。

同樣，了解草地退化過程中根際微生物群落聚集的生態過程對于預測生態系統對環境變化的反應至關重要。前期研究發現，土壤微生物群落能夠通過競爭、共生和互惠形成復雜的共生網絡，并且通過搭建分子生態網絡模型能夠更好地理解和揭示植物-微生物相互作用。因此，植物-土壤-微生物的交互作用能夠增加其網絡的復雜性和連通性，從而具備更大的生態位和相互作用潛力［9］。當草地發生退化時，土壤中微生物共生網絡的緊密性和復雜性必然會受到土壤性質、植物群落和優勢物種的影響?，F階段，高寒草甸退化對草地物種組成［10］、土壤理化性質［3］、土壤微生物群落和功能等的影響已被廣泛研究［11］。然而，有關草地退化對根際真菌群落組成和功能的影響，以及草地退化過程是如何影響根際真菌群落搭配和組裝的相關研究鮮有報道。因此，本研究以青藏高原東緣退化高寒草甸為研究對象，利用高通量測序技術對不同退化程度高寒草甸根際真菌群落和功能進行研究，同時結合分子生態網絡分析方法，揭示關鍵根際真菌類群間的作用方式和組裝機制，以期為高寒草甸區草地退化修復治理和生態適應策略提供一定的理論依據和參考價值。

1 材料與方法

1.1 研究區域概況

研究區域位于青藏高原東緣甘肅省武威市天祝藏族自治縣抓喜秀龍鄉（102°44′11″-102°46′17″ E，37°11′42″-37°13′05″ N，海拔2900 m 左右），屬高原大陸性氣候，草地類型為高山草甸類，主體海拔2900 m，太陽輻射強，晝夜溫差較大，年平均氣溫0.1 ℃，年蒸發量1137～2581 mm，平均降水量400 mm，集中于7-9 月，平均相對濕度55%，全年≥0 ℃的積溫為1360 ℃左右，無絕對無霜期。主要土壤類型是亞高山草甸土，山地黑鈣土。主要植物以垂穗披堿草（Elymus dahuricus）、甘肅棘豆（Oxytropis kansuensis）、草地早熟禾（Poa pratensis）、扁蓿豆（Melissilus ruthenicus）、乳白香青（Anaphalis lactea）、火絨草（Leontopodium leontopodioides）、線葉嵩草（Kobresia capillifolia）、賴草（Leymus secalinus）、珠芽蓼（Polygonum viviparum）、矮生嵩草（Kobresia humilus）等為主。

1.2 采樣點布設及根際土壤樣品采集

試驗于2020 年7 月正式開展，同時根據任繼周［12］的草甸退化研究方法對試驗區域進行實地調查，在研究區選取4 個樣地，分別為輕度退化草地（light degraded grassland，LD）、中度退化草地（moderate degraded grassland，MD）、重度退化草地（severely degraded grassland，SD）以及對照樣地未退化草地（non-degraded grassland，ND）。在每個樣地中選取1 個大小為200 m×200 m 草地狀況均一的采樣區域，并且在每個采樣區域內以S 型設6 個1 m×1 m 的調查樣方，每個樣方間距50 m 左右。用方格法［12］測定每個樣方中植物高度（cm），植被蓋度（%），植物種類以及植物數量，分別計算出不同退化草地的優勢植物。同時在調查樣方中布設1 個50 cm×50 cm 的小樣方，挖取1 個0.2 m×0.2 m×0.3 m（土壤深度）的土塊做好標記，用保鮮膜封裝后放入干冰箱中盡快帶回實驗室在超凈工作臺下進行下一步土壤樣品的處理。4 個退化樣地共計24 個采樣位點，研究區樣地具體信息如表1。

表1 不同退化程度高寒草甸樣地基本信息Table 1 Basic information of alpine meadow plots with different degrees of degradation

將帶回實驗室的土塊放置于無菌工作臺中，參考Chaudhary 等［13］的方法，采集4 個不同退化程度樣地中優勢植物的根際土壤（rhizosphere soil，RS）樣品。一般而言，抖落之后仍粘在植物根系上的土壤為根際土壤（附著的根際土為<2 mm），采用人工手段將附著在根系上的土壤掃入無菌自封袋，保證每個退化樣地的優勢植物根際土充分混勻，共計24 個根際土壤樣品。將根際土保存至-20 ℃超低溫冰箱中，進行后續微生物高通量測序分析。

1.3 高通量測序分析

采用CTAB/SDS 方法［14］對24 個新鮮根際土樣進行DNA 提取，使用1%瓊脂凝膠電泳檢測所提DNA 的濃度和純度。采用ITS5-1737F（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和ITS2-2043R（5′-GCTGCGTTC TTCATCGATGC-3′）為引物，對真菌ITS 區進行擴增［14］。PCR 擴增反應體系為30 μL：高保真DNA 聚合酶預混液15 μL（New England Biolabs），10 ng 模板DNA 以及超純水，上下游引物各0.2 μmmol·L-1。PCR 擴增順序如下：98 ℃預變性1 min；98 ℃變性10 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，進行30 次循環；72 ℃ 5 min 最終延伸。將PCR 擴增產物用1×TAE 濃度2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，由北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行后續的樣品建庫，并通過Ion S5TMXL（Thermofisher）平臺，利用單端測序（single-end）方法進行高通量測序工作。

測序數據處理流程：首先利用Cutadapt（V1.9.1）［15］將原始數據進行拼接和過濾得到有效數據，同時采用UCHIME Algorithm（V4.2）對比數據庫去除嵌合體序列，獲得可被利用的測序數據；其次采用Uparse 軟件（v7.0.1001）將相似性大于97%的序列聚類成為分類操作單元（operational taxonomic units，OTUs），并篩選出頻數最高的OTUs 代表序列進行后續物種注釋分析［16］；再次基于Mothur 算法［17］，采用Unite（7.2）數據庫與代表性的OTUs 比對，并進行分類學注釋，利用MUSCLE（V3.8.31）軟件進行快速多序列比對，獲得OTUs 序列的系統發生關系；最后將每個樣品的數據進行標準化處理，以便后續進行真菌群落多樣性分析。

1.4 分子生態網絡分析

本研究以MENA 平臺（http：//ieg4.rccc.ou.edu/mena）構建分子生態網絡（molecular ecological networks，MENs）［18］，以獲取相關網絡參數，具體步驟如下：將測序獲取的根際土壤樣本OTUs 數據進行對數轉化，并基于Spearman 相關系數，轉化為相似性矩陣，并依據隨機矩陣理論分析相關矩陣特征值的最近鄰間距分布預測生態群落。為了計算真菌生態網絡共現/互斥的統計顯著性，通過迭代1000 次獲取并計算邊緣特定的排列和引導分數分布，并對所有數據進行重新歸一化。最終按照Barberán 等［19］的方法描述網絡拓撲特征，分子生態網絡模型參數中聚類系數（即識別網絡的模塊化組織的度量）、度連接分布（連接到節點的邊數）、中介中心性（反映該節點對其他節點的交互施加的控制量在網絡中）和拓撲系數（網絡中節點具有共享鄰居的趨勢）以及每個節點的連接度，正（共現）和負（互斥）邊緣的數量，同時根據節點的模塊內連通性（within-module connectivity，Zi）和模塊間連通性（among-module connectivity，Pi）評估節點的拓撲角色，其中表述微生物群落網絡的關鍵節點主要依據網絡與模塊中心點及連接節點。這些結構特性提供了對來自不同退化程度高寒草甸的復雜數據集進行快速和簡單比較的潛力，以探索草地退化是如何確定根際土壤中真菌群落的組裝。最后采用Gephi 0.9.2 對其網絡進行可視化［20］。

1.5 數據統計與分析

采用Excel 2019 和SPSS 18.0 軟件對數據進行整理和統計分析，通過單因素（one-way ANOVA）和Duncan法進行方差分析和多重比較（α=0.05），圖表中所有數據均表示為平均值±標準誤（mean±standard error）；根際真菌群落組成、Alpha 多樣性（Coverage、Shannon-Weiner、ACE、Chao1 指數）和Beta 多樣性的主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）和非度量多維尺度分析（non-metric multi-dimensional scaling，NMDS）于諾禾致源云平臺進行分析，采用線性判別分析效應大小（linear discriminant analysis Effect Size，LEfSe）進行分析，其中線性判別分析（linear discrimination analysis，LDA）的閾值設置為3.5 以判定顯著差異物種，利用FunGuild 對真菌群落進行功能注釋。運用GraphPrism 9.0 進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 不同退化程度高寒草甸根際土壤真菌DNA 測序分析

通過IonS5TMXL 測序平臺，對4 個退化樣地根際土壤樣品進行了高通量測序分析，24 個樣本共獲得了81548條序列，經過質控優化后獲得80214 條有效序列，并且在97%序列相似度水平上聚類共獲得3375 個可分析的OTUs。對4 個退化程度高寒草甸根際土壤真菌進行稀釋曲線分析發現，各樣本曲線隨測序深度的增加整體變化趨于平坦（圖1A），同時結合各樣地測序覆蓋率99.7%的結果可知（表2），本研究取樣方式合理、樣本量充分，測序結果能夠真實反映不同樣地真菌群落數目。不同退化程度下共有根際真菌OTU 數為1236 個，并且根際土壤真菌OTU 分布數目表現為LD>ND>MD>SD（表2）。根據不同退化程度高寒草甸根際真菌的OTU 數量繪制韋恩圖可知（圖1B），ND 樣地特有OTU 數為237 個；LD 樣地特有OTU 數為172 個；MD 樣地特有OTU 數為203個；SD 樣地特有OTU 數為204 個。

圖1 不同退化程度高寒草甸優勢物種根際土壤真菌稀釋曲線（A）和韋恩圖（B）Fig.1 Rarefaction curves（A）and Venn diagrams（B）of rhizosphere fungi of dominant species in degraded alpine meadows with different degrees

表2 不同退化程度高寒草甸優勢物種根際土壤真菌多樣性指數Table 2 The rhizosphere soil fungal diversity index of dominant species in degraded alpine meadows with different degrees

2.2 不同退化程度高寒草甸根際土壤真菌群落多樣性變化

基于OTU 的分類水平對4 個退化樣地根際土壤真菌的Alpha 多樣性指數分析可知（表2），高寒草甸4 個退化程度樣地中根際土壤真菌群落豐富度指數（Chao1 指數和ACE 指數）均表現為：LD>ND>MD>SD；根際土壤真菌Shannon-Weiner 指數和Simpson 指數分別表現為：ND>LD>MD>SD 和MD>SD>ND>LD。整體而言，4 個退化高寒草甸根際土壤真菌Alpha 多樣性差異不顯著。

基于Bray-Curtis 距離的主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）結果可知（圖2A），以主成分PC1（解釋率21.88%）和PC2（解釋率9.98%）為坐標軸構建的二維坐標系在OTU 水平上退化高寒草甸根際土壤真菌群落表現出一定差異，同時結合非參數檢驗方法（Anosim）進行組間差異檢驗發現，ND 與LD、MD 和SD 間根際土壤真菌群落結構組成差異顯著（R=0.5315，P=0.004；R=0.4241，P=0.001；R=0.9648，P=0.004），LD 與MD 和SD 間根際土壤真菌群落結構組成差異顯著（R=0.5741，P=0.007；R=0.4241，P=0.001），而MD 與SD間根際土壤真菌群落結構組成差異不顯著（R=0.1519，P=0.101），在一定程度上解釋了不同退化樣地的遠近差異和相似度。通過非度量多維尺度分析（non-metric multi-dimensional scaling，NMDS）發現（圖2B），隨退化程度加劇根際土壤真菌群落特征存在顯著差異（P<0.05），并且4 個退化樣地根際土壤真菌群落能夠被很好地區分。

圖2 不同退化程度高寒草甸根際土壤真菌OTU 水平下PCoA 和NMDS 分析Fig.2 Principal co-ordinates analysis（A）and non-metric multi-dimensional scaling analysis（B）based on OTU level of rhizosphere soil fungi in alpine meadows with different degradation degrees

2.3 不同退化程度高寒草甸根際土壤真菌群落組成與結構差異性分析

本研究在4 個退化高寒草甸根際土壤樣本中共檢測出13 個真菌門類。通過制作門水平上的群落相對豐度圖發現，隨退化程度加劇根際土壤真菌群落的組成結構及相對豐度比例出現明顯變化趨勢。如圖3 所示，門水平上，4 個退化程度草地根際土壤真菌群落主要由擔子菌門（Basidiomycota，相對豐度14.33%～43.20%，均值27.34%）、被孢霉門（Mortierellomycota，相對豐度9.29%～20.16%，均值14.43%）和子囊菌門（Ascomycota，相對豐度16.99%～25.32%，均值21.79%）組成，并且是相對豐度大于1%的真菌門類，而相對豐度低于1%的類群占28.14%～40.19%。4 個不同退化程度草地根際土壤真菌在門分類水平上表現出一定的變化趨勢，其中擔子菌門表現為LD>ND>MD>SD，被孢霉門表現為SD>MD>LD>ND，子囊菌門表現為SD>MD>ND>LD。

圖3 不同退化程度高寒草甸根際土壤真菌群落門水平相對豐度Fig.3 Relative abundance of phylum levels of rhizosphere soil fungal communities in alpine meadows with different degrees of degradation

為明確高寒草甸退化過程中特定根際土壤真菌類群，本研究采用LEfSe 鑒定不同退化程度根際真菌群落豐度差異（圖4），并利用線性判別分析（LDA）閾值判別具有顯著差異的物種，構建群落進化分支圖（圖4），其中LDA 閾值為3.5。結果表明，門分類水平上，LD 樣地中擔子菌門（Basidiomycota）的相對豐度具有顯著優勢。綱分類水平上，ND 樣地中傘菌綱（Agaricomycetes）、座囊菌綱（Dothideomycetes），MD 樣地的錘舌菌綱（Leotiomycetes）和SD 樣地的糞殼菌綱（Sordariomycetes）為各退化樣地的顯著優勢綱。目分類水平上，ND 樣地中傘菌目（Agaricales）、貝殼菌目（Mytilinidiales）、蠟殼耳目（Sebacinales），MD 樣地的Thelebolales、肉座菌目（Hypocreales）和SD 樣地的糞殼菌目（Sordariales）為各退化樣地的顯著優勢目?？品诸愃缴?，ND 樣地中船殼菌科（Gloniaceae）、蠟殼耳科（Sebacinaceae）、絲膜菌科（Cortinariaceae），LD 樣地的絲蓋傘科（Inocybaceae）、珊瑚菌科（Clavariaceae）和MD 樣地的假散囊菌科（Pseudeurotiaceae）、叢赤殼科（Nectriaceae）、口蘑科（Tricholomataceae）為各退化樣地的顯著優勢科。屬分類水平上，ND 樣地空團菌屬（Cenococcum）、絲膜菌屬（Cortinarius）、蠟殼耳屬（Sebacina），LD 樣地的絲蓋傘屬（Inocybe）和MD 樣地的Gymnostellatospora、Dactylonectria為各退化樣地的顯著優勢屬。種分類水平上，ND 樣地的土生空團菌（Cenococcum_geophilum）、棕黑絲膜菌（Cortinarius_diasemospermus），MD 樣地的Dactylonectria_hordeicola為各退化樣地的顯著優勢種。

圖4 不同退化程度高寒草甸根際土壤真菌線性判別分析Fig.4 Linear discriminant analysis effect size of rhizosphere soil fungal community in alpine meadows with different degradation degrees

2.4 不同退化程度高寒草甸根際土壤真菌的功能預測分析

本研究通過FUNGuild 數據庫對4 個不同退化程度高寒草甸根際土壤真菌群落進行功能預測（圖5），可被注釋的草地根際真菌為32.31%～45.19%，表現為ND>SD>LD>MD。通過營養方式劃分，退化草地根際土壤真菌主要以共生營養型、腐生營養型、病理營養型為主。根據Guilds 小類可知，高寒草甸根際土壤真菌主要由未定義的腐生真菌（undefined_saprotroph）、外生菌根真菌（ectomycorrhizal）和土壤腐生真菌（soil_saprotroph）等功能真菌群組成。其中未定義的腐生真菌在MD 和SD 根際樣品中占比較高，分別為13.98%和14.93%；外生菌根真菌在ND 根際樣品中占比最高，為13.74%，并且表現為隨退化程度加劇逐漸降低的趨勢；土壤腐生真菌在SD 根際樣品中占比最高，為6.31%，表現出隨退化程度加劇升高的趨勢。在4 個不同退化程度樣地中未被注釋的根際土壤真菌相對較高，最高達67.62%。由此可知，高寒草甸根際土壤的功能真菌主要以共生營養型和腐生營養型為主，并且表現出隨退化程度的加劇真菌功能由共生營養型向腐生營養型轉變，因此，草地退化對于根際土壤真菌功能類群的結構產生了影響。

圖5 不同退化程度高寒草甸根際土壤真菌營養功能類群Fig.5 Rhizosphere soil fungal nutritional function groups in different degraded alpine meadows

2.5 不同退化程度高寒草甸根際土壤真菌生態網絡分析

由圖6 和表3 可知，草地退化對根際土壤真菌OTU 分子生態網絡的穩定性產生了顯著影響。本研究對4 個不同退化程度草地根際土壤真菌網絡進行搭建，基于隨機矩陣理論，4 個退化程度高寒草甸根際真菌群落的閾值分別是ND（0.970）、LD（0.960）、MD（0.950）和SD（0.970），并結合其網絡拓撲性質表明，LD 樣地的網絡結構相比于其他3 個樣地更為復雜，其中ND、MD 和SD 的網絡分別有839、971、768 個OTU 節點和6901、8445、5985 條邊構成，遠低于LD（1219 個節點和12929 條邊），其大于1% 的模塊性方面表現為LD（88.51%）>MD（83.56%）>SD（82.18%）>ND（78.14%）；草地發生退化時，3 個退化樣地［LD（62.19%）、MD（69.37%）和SD（73.92%）］其網絡節點之間的負向關系高于ND（54.31%），從而表明根際真菌群落隨草地退化的加劇呈競爭關系。本研究中4 個樣地的網絡連通冪律模型（R2值為0.712～0.806）吻合程度一般，但能夠在一定程度上反映出網絡的無標度（scale-free）性。同時隨退化程度加劇，根際真菌群落中平均度（average degree）和平均聚集系數（average clustering coefficient）呈先升高后降低的趨勢，均表現為LD>ND>MD>SD，平均路徑長度（average path length）呈逐漸上升趨勢，介數中心性（centralization of betweenness）表現出逐漸升高趨勢，均表明草地退化導致真菌群落網絡變得更加松散，以及網絡復雜性逐漸降低。

圖6 不同退化程度高寒草甸根際土壤真菌群落分子生態網絡Fig.6 Molecular ecological network of rhizosphere soil fungal communities alpine meadows with different degradation degrees

表3 不同退化程度高寒草甸根際土壤真菌網絡拓撲參數Table 3 Rhizosphere soil fungal molecular ecological network characteristics of alpine meadow with different degradation degrees

本研究中4 個不同退化程度樣地根際土壤真菌網絡中均未發現網絡中心點（Zi≥2.5 且Pi≥0.62）（圖7）。整體而言，退化高寒草甸真菌網絡中，絕大部分節點為外圍節點（Zi<2.5 且Pi<0.62），大約占90%以上。一般而言，真菌網絡中Zi≥2.5 或Pi≥0.62 的節點均可視為關鍵物種，本研究中根際土壤真菌物種表現為LD>ND>MD>SD，并且不同退化程度草地中生態網絡的關鍵物種也明顯不同。同樣，本研究發現，草地退化后模塊樞紐節點（Zi>2.5 且Pi<0.62）呈上升趨勢，表現為SD

圖7 不同退化程度高寒草甸根際土壤真菌OTUs 在網絡中的位置Fig.7 Location of rhizosphere soil fungal OTUs in the network of alpine meadows with different degrees of degradation

3 討論

高寒草甸退化能直接影響土壤中根際微生物群落結構和功能。本研究發現，隨草地退化程度加劇，根際土壤中真菌群落Alpha 多樣性整體呈降低趨勢，但差異不顯著。同樣，Zhang 等［21］對亞高山地區演替過程中優勢植物物種根部真菌群落和功能進行研究發現，根際真菌Alpha 多樣性在3 個演替階段無顯著差異，本研究結果與其一致。這種現象可能歸因于“根際效應”，其原因是草地退化過程中優勢植物的改變會使植物根系分泌物的組成和數量發生變化（即碳水化合物、氨基酸、多元醇和有機酸等），從而為根際微生物提供豐富的碳源物質，使根際微生物豐富度提高，影響了真菌的Alpha 多樣性［22-23］。采用PCoA 和NMDS 分析對本研究中4 個退化程度高寒草甸根際土壤真菌群落進行Beta 多樣性分析發現，草地退化導致根際土壤真菌群落被區分開來，表明根際真菌群落結構受草地退化影響較為顯著。進一步說明草地退化過程中根際土壤真菌群落的組成差異受草地優勢物種的影響較為嚴重，這可能是由于受根際真菌可利用底物不同所引起的，Wagg 等［24］的研究中也有相似的結論。相比根際真菌多樣性而言，高寒草甸根際土壤真菌優勢種群和物種組成對草地退化程度響應較為敏感，這與前期土壤真菌群落響應草地退化的研究結果一致［25］。本研究中4 個退化草地根際土壤中主要優勢真菌類群由擔子菌門、被孢霉門和子囊菌門組成，且不同退化程度下根際真菌類群的相對豐度差異顯著，表現為隨退化程度加劇擔子菌門整體呈降低趨勢（LD>ND>MD>SD），子囊菌門和被孢霉門呈上升趨勢（SD>MD>LD>ND），這與Gao 等［26］和尹亞麗等［27］的研究結論一致。這是由于擔子菌門和子囊菌門均能作為分解動植物殘體的主要真菌類群，但其中擔子菌門多存在于土壤質量較好的區域［28］，而子囊菌門由于具有較高的耐受性和高的周轉率，能夠更好地抵御環境壓力從而提高其在退化嚴重草地中的優勢地位［29］。被孢霉門多存在于有害生物（如線蟲）中，可作為土壤健康狀況的評價性指標［30］，因此在預示高寒草甸植被和土壤的健康狀態方面有很重要的作用。綜上所述，高寒草甸退化導致根際土壤中真菌群落的分布出現差異性，但優勢種群具有相似性，這可能與草地植物根系所分泌的物質不同有關，進而影響根際真菌群落結構發生變化。

為進一步探究草地退化過程中根際土壤真菌群落的差異性，本研究通過LEfSe 分析發現，ND 和LD 樣地中擔子菌門、傘菌綱和座囊菌綱為主要的差異物種，這表明退化不嚴重的高寒草甸土壤中，植物根際參與養分周轉非?；钴S，表現出植物與土壤間的交互能力為根際微生物的生存和繁衍提供棲息地［31］。而隨著草地退化程度的不斷加劇，MD 和SD 樣地的根際土壤中錘舌菌綱和糞殼菌綱則成為主要的差異物種。大量研究報道指出，錘舌菌綱和糞殼菌綱多為植物有害病菌，能夠通過繁殖大量子囊影響草地土壤的健康和植物正常生長，在一定程度上可以反映草地的生態功能［32］，因此可作為檢測草地退化的指示性微生物。同樣本研究也發現蠟殼耳屬、絲蓋傘屬、絲膜菌屬等外生菌根真菌在退化草地的根際出現了富集，但隨著退化程度的加劇則逐漸降低甚至消失，這也與前人的研究結論具有相似性［11］。這一現象既反映了根際真菌的宿主特異性和主動選擇性，也進一步印證了草地退化過程中優勢物種的變化對土壤真菌群落結構的影響［33］。與根際真菌群落結構的變化相似，不同退化階段高寒草甸形成了不同的真菌功能群落。本研究基于FUNGuild 對4 個退化樣地根際土壤真菌群落進行功能預測發現，退化草地根際真菌主要以共生營養型、腐生營養型、病理營養型為主，同時包含多種交叉營養型，并且以共生營養型和腐生營養型為主要響應功能群。研究發現，隨退化程度加劇根際土壤真菌功能主要由共生營養型向腐生營養型轉變，這可能受退化草地中土壤養分限制的因素，導致植物與共生型真菌之間關系減弱所引起的；或者是受到優勢物種的改變所引起，因為不同優勢植物根部所分泌的物質不同，所起到的驅動微生物聚集效應差異很大。前人研究也發現受過牧影響的溫帶草原土壤中共生營養型真菌群落顯著降低，而腐生型真菌群落顯著增長［34］。本研究還發現，腐生營養型占比在退化嚴重的樣地中相對較高，這是由于退化嚴重的草場植物為了完成正常生活史，通過根系分泌物驅動根際微生物中的腐生營養型真菌的積累，提高分解土壤中動植物殘體和草原生物糞便能力和效率所引起的，從而表現出重度退化區域植物根際腐生營養型真菌相對豐度增加的趨勢。

生態網絡分析作為闡明微生物間相互作用的重要手段，在探討草地退化過程中根際微生物組裝、搭建和穩定性方面具有重要意義。本研究發現，草地退化降低了根際土壤中真菌網絡的復雜性，主要表現在平均度和平均聚集系數的降低，以及網絡總節點、總邊和連通度下降等方面。這與前期de Vries 等［35］和徐鵬等［36］分別在不同草地類型中真菌網絡響應逆境脅迫方面的研究結果具有一致性。同時草地退化對真菌網絡模塊化特征有直接影響，本研究發現，隨草地退化程度加劇根際真菌網絡模塊化指數呈降低趨勢和介數中心性呈不斷升高的趨勢，這表明草地退化使根際真菌群落復雜性降低，結構更加松散。Mapelli 等［37］前期研究發現，土壤發育程度越高，其根際真菌群落結構的緊密性越強，本研究結果與其一致。導致草地退化過程中根際真菌群落復雜性降低和結構松散的原因可能受土壤養分資源限制或根際中真菌群落的競爭所影響。而本研究發現，退化高寒草甸中根際真菌群落以負相關關系為主，并且退化程度越劇烈負相關比例越高。這表明競爭關系在維持根際真菌群落穩定性方面占據主導作用［37］。同樣，通過分子生態網絡拓撲參數也能進一步解釋根際真菌群落對于維持群落結構穩定性方面的作用［38］，本研究發現，草地退化影響了根際真菌網絡拓撲參數，并表現為隨退化程度加劇根際真菌的關鍵物種互作性和連通率降低的趨勢。這也進一步說明草地退化使優勢植物發生改變，影響了根際真菌群落網絡中關鍵的核心物種，最終導致高寒草甸退化降低了根際真菌相互作用的能力。

4 結論

本研究發現，高寒草甸退化對根際土壤中真菌群落的Alpha 多樣性影響不顯著，但會顯著改變根際土壤真菌群落的Beta 多樣性；高寒草甸退化對根際土壤中擔子菌門、被孢霉門和子囊菌門等優勢種群影響不大，但對于根際土壤優勢真菌的相對豐度影響較為劇烈；高寒草甸退化使根際土壤真菌群落的功能發生了顯著變化，表現出隨退化程度加劇由共生營養型向腐生營養型轉變的趨勢；高寒草甸退化使根際土壤真菌網絡呈不穩定和松散的態勢。