基于氣相色譜-質譜和超高效液相色譜的火麻油中萜烯類、大麻素類成分分析

張瑞婷，蔡尤西，張 浩，孫 卉，孫曉東，滕亞君，李曉蕾,

（1.昆明理工大學材料科學與工程學院，云南 昆明 650093；2.昆明理工大學分析測試研究中心，云南 昆明 650093；3.昆明海關技術中心，云南 昆明 650000）

火麻（Cannabis sativaL.），在中國也稱為漢麻或工業大麻，大麻科（Cannabaceae）、大麻屬（Cannabis）植物，是人類最早種植的作物之一。火麻具有十分悠久的栽培歷史，據考證可追溯至六千年前，兩千多年前《周禮》中記載的“麻、麥、稷、黍、豆”五谷，“麻”即為火麻的籽。火麻籽富含油脂、蛋白質、碳水化合物及礦質元素，常用于食品與藥品。火麻油，即由火麻籽榨制而成，是富含多不飽和脂肪酸和多種營養元素的功能性油脂，具有良好的營養保健和藥療功效，還可作為高血脂、冠狀動脈粥樣硬化以及心血管病人的長期食療保健油[1]。《本草綱目》中關于火麻醫藥和保健用途的記載多達數百條。現代藥理學研究表明，來自大麻屬植物的大麻素類化合物大麻二酚（cannabidiol，CBD）在治療抑郁、焦慮，癲癇、心腦血管疾病方面具有很高的藥用價值；大麻素類成分如大麻萜酚（cannabigerol，CBG）、大麻酚（cannabinol，CBN）也因其獨特的藥理作用在醫藥領域越來越受到關注。Δ9-四氫大麻酚（Δ9-tetrahydrocannabinol，Δ9-THC）屬于精神活性物質，具有成癮性，被列入我國第一類精神藥品品種目錄管制。2020年12月2日，在聯合國麻醉品委員會第63屆會議續會上，接受了世界衛生組織把大麻和大麻脂從《1961年麻醉品單一公約》附表四中刪除這條建議，這標志著大麻植物中許多有益大麻素的醫療用途在聯合國層面得到了承認，也將有助于進一步研究大麻的醫用價值。萜烯類成分則是大麻屬植物及種籽具有特殊氣味的主要原因，一些活性萜烯成分，如β-石竹烯，被認為與植物大麻素有較好的藥物協同作用，共同作用于人體內內源性大麻素受體系統的CB1和CB2受體，發揮多種生理活性[2-3]。

盡管大多數的研究均證實，火麻油是可媲美魚油的無毒、優質食用油[4]，但由于其來自傳統火麻或工業大麻植物，火麻油的食用安全性在近年受到了國內外的廣泛關注[5-7]。全球范圍內一些國家和地區陸續出臺相關規定，要求檢測火麻油食品中的Δ9-THC含量，并開始對含量上限進行規定。根據實際種植情況，目前云南地區市售的火麻油種籽原料主要來自于“云麻7號”和“云麻8號”工業大麻品種，因此云南的火麻油即工業大麻油。工業大麻是近三十年來我國在傳統種植的“火麻”基礎上進行規范化、低毒化培育的、植物干花葉中Δ9-THC質量分數低于0.3%的工業用火麻品種。

本實驗主要對近年來云南省廣泛種植的“云麻7號”“云麻8號”工業大麻麻籽冷榨制得的火麻油中獨特的萜烯類成分、脂肪酸和大麻素類成分進行研究與分析，特別關注Δ9-THC超標問題。通過實驗數據與文獻資料，對火麻油的化學成分和安全性進行探討并提出建議，為產業的安全發展提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用火麻油樣品由云南谷益美農業開發有限公司提供，來源植物品種為“云麻7號”和“云麻8號”，2022年種植、采收、冷榨加工而成。

樣品前處理所用甲醇、乙醇、丙酮等化學試劑為分析純，儀器分析試劑均為質譜純或色譜純，購自美國Sigma和Fisher公司；11 種大麻素實驗標準品Δ9-THC（批號：FE01041701，純度98.1%）、C B D（批號：F E 10071912，純度99.8%）、Δ8-四氫大麻酚（Δ8-tetrahydrocannabinol，Δ8-THC）（批號：FE12271903，純度99.7%）、大麻環萜酚（cannabichromene，CBC）（批號：FE10281904，純度99.2%）、大麻二酚酸（cannabinoid acid，CBDA）（批號：FE04301903，純度99.5%）、次大麻二酚（cannabidivarin，CBDV）（批號：FE05121901，純度99.9%）、CBG（批號：FE01181901，純度99.6%）、四氫次大麻酚（tetrahydrocannabivarin，THCV）（批號：FE10111901，純度99.5%）、四氫大麻酚酸（tetrahydrocannabinoid acid，THCA-A）（批號：FE09271901，純度98.9%）、大麻萜酚酸（cannabigerolic acid，CBGA）（批號：FE01082007，純度99.5%）、CBN（批號：FE01202013，純度99.6%），均購自美國Sigma公司，供應商為美國Cerilliant公司。

實驗用水為超純水，由Milli-Q超純水系統（美國Millipore公司）制備。

1.2 儀器與設備

BP211D型電子天平 德國Sartorius科學儀器有限公司；KQ-300DA型數控型超聲波提取儀 上海波龍電子有限公司；8890A/5977B型固相微萃取-氣相色譜-質譜（solid phase microextraction-gas chromatographymass spectrometry，SPME-GC-MS）聯用儀、7890B型氣相色譜-火焰離子化檢測器（gas chromatography-flame ionization detector，GC-FID）、1290型超高效液相色譜（ultra-high performance liquid chromatography，UPLC）儀美國Agilent科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPME-GC-MS分析萜烯類成分含量

SPME采用DVB/CWR 80 μm纖維吸附頭，樣品溫度60 ℃。火麻油樣品準確稱取0.6 g（精確至0.0001 g），置于進樣瓶。色譜條件：色譜柱HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm），進樣口溫度250 ℃，分流比10∶1，載氣He，流量1 mL/min。程序升溫：45 ℃保持1 min，4 ℃/min升至120 ℃，保持2 min，4 ℃/min升至200 ℃，保持2 min，15 ℃/min升至260 ℃，保持9 min，分析時間55 min。質譜條件：傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，電子電離源，電離能70 eV，掃描范圍35～450 u。

1.3.2 GC-FID分析脂肪酸含量

采用GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的測定》第三法歸一化法。水解-提取法：試樣經水解-乙醚溶液提取其中的脂肪后，在堿性條件下皂化和甲酯化，生成脂肪酸甲酯，經毛細管柱氣相色譜分析，面積歸一化法定量測定脂肪酸相對含量。

儀器條件：毛細管色譜柱HP-88（100 m×0.25 mm，0.20 μm），進樣口溫度250 ℃，FID溫度300 ℃，程序升溫：初始溫度80 ℃，持續2 min；80～180 ℃，升溫速率5 ℃/min，保持5 min；180～230 ℃，升溫速率10 ℃/min，保持15 min。載氣：氮氣，分流比15∶1。

1.3.3 UPLC分析11 種大麻素成分

色譜柱Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～10 min，22% A、78% B；10.1～15.0 min，22%～20% A、78%～80% B；15.1～17.5 min，0% A、100% B；17.6～20.0 min，22% A、78% B；流速0.3 mL/min；色譜柱溫度30 ℃；進樣量1 μL；紫外檢測波長220 nm。

樣品前處理方法：稱取火麻油0.5 g（精確至0.0001 g）于離心管中，加入5 mL乙腈，旋渦2 min充分混勻，超聲15 min，提取液以12000 r/min離心5 min，取上清液用0.22 μm有機系濾膜過濾，取續濾液至色譜進樣瓶待分析。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 火麻油中萜烯類成分分析

目前在大麻屬植物中已發現了100多種萜烯[8-9]，萜類化合物一般存在于根、葉以及花蕊中，麻籽也有微量存在，因而產生出該屬植物獨特的氣味。研究表明萜烯可以與大麻素類物質產生協同增效作用，即使在微量情況下也可能產生顯著的生物活性。

本實驗中采用SPME-GC-MS技術分析4 種火麻油中的揮發性成分，總離子流圖見圖1，共檢測到30余種物質，將其中相對含量高于1%的成分進行對比分析（表1）。火麻油中含量較高的特色萜烯類物質有：β-石竹烯、β-月桂烯、(E)-2-庚烯醛、蛇麻烯、檸檬烯等。部分萜烯和植物大麻素一樣，可與人體內大麻素受體CB1或CB2結合發揮作用，不同的萜烯似乎與受體系統有獨特的相互作用。例如，β-石竹烯是一種活性很好的倍半萜，主要存在于一些植物精油和綠葉蔬菜中，在對工業大麻的研究中發現它無論在花葉還是種籽中含量都居于所有萜烯的首位，在火麻油中含量也比較豐富。β-石竹烯被稱為一種“膳食大麻素”，它能夠直接與大麻素受體CB2結合，對胃具有保護作用，對某些潰瘍也有很好的治療效果，因此它還具有治療炎癥和自身免疫疾病的前景。

表1 SPME-GC-MS分析火麻油揮發性成分的相對含量Table 1 Relative contents of volatile components in hemp oil determined by SPME-GC-MS

圖1 火麻油SPME-GC-MS總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatogram of hemp oil by SPME-GC-MS

2.2 火麻籽和火麻油中脂肪酸分析

脂肪酸分析結果（表2）表明，火麻油中不飽和脂肪酸非常豐富，占總脂肪酸的比例超過85%，高于大部分中國傳統食用油類，其中亞油酸和亞麻酸含量最高，兩者的比例接近2.5∶1。根據聯合國糧油組織發布的《健康食用油的標準》推薦，必需脂肪酸中亞油酸與亞麻酸的比例應小于或等于4∶1，此時對人體的機能最為高效，外界疾病不容易侵入人體，當人體內的亞油酸和亞麻酸比例為3∶1左右時，能夠有效降低脂代謝異常相關疾病的風險[10]。我國國民現階段食物結構中這兩種脂肪酸的比例約為33∶1，亞油酸比例過高而亞麻酸不足，比例嚴重失衡。因此，采用火麻籽冷榨方法制得的火麻油非常適宜我國居民食用，可替代魚油，補充亞麻酸不足的問題。最新研究表明，高海拔產區的火麻籽油中的脂肪酸及活性萜烯類、酚類和黃酮類成分的含量均明顯高于低海拔產區，其抗氧化活性也更好[11]。

表2 GC-FID分析火麻籽和火麻油中脂肪酸類成分含量Table 2 Contents of fatty acids in hemp seeds and oil determined by GC-FID

2.3 火麻油中大麻素的UPLC分析

目前從大麻屬植物中分離得到的化合物已有560 多種[12-13]，其中大麻素類化合物是一類僅存在于大麻植物中的次生代謝產物。目前已分離鑒定出120 種以上[14-15]，主要包括Δ9-THC、CBD、CBC、CBN、CBG及它們的酸同系物和丙基同系物，其中以Δ9-THC和CBD的含量最高。現代藥理學研究表明，大麻素類化合物具有多種藥理作用[16-20]，其中Δ9-THC（致幻成癮性精神活性成分）和CBD（非精神活性成分）在神經系統保護[21-22]、免疫調節、抗癲癇[23]、抗抑郁和抗炎抗氧化等方面具有顯著的藥用價值[24]，近些年在藥理研究和新藥研發方面取得較大進展。大麻素類成分主要作用于人體內源性大麻素受體系統的兩種受體CB1和CB2，可發揮多種生理作用[25-26]，當前人體內源性大麻素信號系統已經作為治療藥物發展的熱點和重要目標，而萜烯類成分與大麻素的協同增效也成為研究熱點。

實驗室建立了15 min內準確定量分析火麻油中11 種大麻素的UPLC方法，并對“云麻7號”帶殼冷榨火麻油、“云麻7號”脫殼火麻油和“云麻8號”帶殼火麻油、“云麻8號”脫殼火麻油樣品進行分析（圖2）。分別對11 種大麻素以峰面積為縱坐標、質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，所得回歸方程的線性關系均良好，方法在0.1～50 μg/mL線性范圍內的R2值均在0.999以上（表3）。精密度考察采用對照品溶液，按方法連續進樣6 次，記錄其峰面積響應值，11 種大麻素的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在0.85%～8.95%之間，說明方法精密度良好。重復性考察取同一批次樣品6 份，按照方法制備并加標，詳細記錄峰面積響應值，計算各物質含量，RSD在0.96%～9.91%之間，說明方法重復性良好。在信噪比3和10條件下確定檢出限和定量限，檢出限在0.05～0.67 μg/g之間，定量限在0.17～2.22 μg/g之間。

表3 11 種大麻素分析的方法學考察Table 3 Analytical figures of merit for 11 cannabinoids

圖2 11 種大麻素成分的UPLC圖Fig.2 UPLC chromatogram of 11 cannabinoids

4 種火麻油樣品中11 種大麻素成分的分析結果表明，不同品種、不同工藝的火麻油中均可檢測到微量、多種的大麻素類成分，其中含量較高的是3 種酸性大麻素CBDA、THCA-A和CBGA，它們分別是中性大麻素CBD、Δ9-THC和CBG未脫羧的前體物質，其中CBDA含量遠高于其他大麻素。分析原因，可能是火麻油冷榨工藝是在較低的溫度下進行的，麻籽中的酸性大麻素并未發生脫羧反應，能夠較好地保留在火麻油中，成為其中的優勢大麻素成分。通過帶殼與脫殼火麻油中的大麻素含量對比（圖3A）發現，脫殼工藝使火麻油中各種大麻素含量均明顯降低，主要原因可能是火麻籽中的大麻素類成分主要分布于火麻仁外層的薄膜和硬殼當中，脫除后含量減少。該原因推測在本實驗對麻糠（麻籽脫去麻仁后的薄膜和硬殼部分）的分析中得到了證明：麻糠中大麻素類成分的含量近似或略低于花葉，遠低于麻籽。“云麻7號”與“云麻8號”兩個不同品種的帶殼火麻油中大麻素含量對比（圖3B）顯示，“云麻8號”品種的種質優化效果比較明顯，有益活性大麻素CBDA含量明顯提高，而精神活性成分THC及其前體物質THCA-A含量均有所降低。

圖3 2 種不同火麻油大麻素類成分含量對比Fig.3 Comparison of cannabinoid contents of hemp oil from two different cultivars

由于第1次采集樣品時市場銷售的成品只有“云麻7號”帶殼火麻油、“云麻7號”脫殼火麻油和“云麻8號”帶殼火麻油3 種樣品，故本研究先進行3 種樣品的分析檢測。為了數據對比和實驗完整性，委托廠家生產加工了“云麻8號”脫殼火麻油，因此“云麻8號”脫殼火麻油樣品為2022年采集的火麻籽2023年7月脫殼冷榨制得。大麻素分析結果（表4）表明，在8 個多月的貯存時間內，一些不穩定的大麻素成分發生了化學變化：酸性大麻素CBDA、THCA-A、CBGA脫羧致其含量減少，而對應的中性大麻素CBD、Δ9-THC、Δ8-THC、CBG含量發生增長；CBN作為Δ9-THC、Δ8-THC氧化后產物，長時間放置也會致其增長[27]。因此在表4可以看到，“云麻8號”脫殼火麻油樣品中含量本應在脫殼工藝后降低的Δ9-THC和Δ8-THC含量反而增長了，正是由于放置時間內THCA-A或其他前體物質的轉化而使其含量增加。這提示還應警惕和關注火麻油及火麻籽在放置時間內大麻素成分是否還在持續發生變化，也將是下一步繼續深入研究的內容，以進一步為火麻油食品安全提供更完善、更科學的數據。

表4 不同火麻油樣品中11 種大麻素的含量Table 4 Contents of 11 cannabinoids in different hemp oil samples

基于食品安全性的考慮，目前全球范圍內已有許多國家和地區對火麻油中的Δ9-THC要求檢測識別并進行限量，但限量水平不一，如：德國和美國要求低于5 μg/mL，澳大利亞、比利時、加拿大、歐洲工業大麻協會、新西蘭、韓國和中國臺灣要求低于10 μg/mL，瑞士要求低于20 μg/mL[28]。結果顯示，來自云南的4 種火麻油樣品均有不同含量的Δ9-THC被檢測到，分別為38.0、30.1、9.4、21.6 μg/g，使用實際測量的火麻油密度0.925 g/mL進行換算后轉化后結果為35.2、27.8、8.7、20.0 μg/mL，增加脫殼工藝以及使用更優的品種有助于降低Δ9-THC含量。查閱文獻也發現，在國內外市售的部分火麻油或火麻籽中，大都檢測出不同含量的Δ9-THC[29-31]，有的甚至高達55.5 μg/mL左右。分析其原因，有可能與植物品種、產地、氣候環境、種植模式等因素有關，也可能與油的加工方式有關，如是否脫殼、是否進行溫度控制、是否炒制等[32]。由本實驗的研究數據可得出：脫殼工藝可有效降低火麻油中Δ9-THC的含量，降低比例約為21%；冷榨工藝更適合火麻油，因為升溫或炒制可能使THCA-A脫羧轉化為THC，使Δ9-THC含量增加；同時應警惕火麻油貯存放置過程中可能發生的Δ9-THC含量變化，做好相關監測。火麻油中Δ9-THC含量過高，必將帶來一定程度的食品安全隱患。因此，建議我國火麻油及火麻相關食品也對Δ9-THC實施檢測識別，并嚴格控制其含量，生產企業也有必要進一步改善和規范生產工藝，加強質控，盡可能降低最終產品中Δ9-THC的含量。同時建議相關部門盡快制定火麻食品中相關大麻素類成分的檢測標準及限量要求等，逐步完善監管制度，保障食品安全，同時也促進產品質量與國際接軌。

2.4 主成分分析（principal component analysis，PCA）結果

利用Metabo Analyst 5.0在線數據分析平臺，對“云麻7號”“云麻8號”的帶殼、脫殼火麻油4 種樣品中大麻屬植物獨特的大麻素類和萜烯類共32 種化學成分，進行PCA并作圖。

根據火麻油揮發性成分含量結果（表1）及火麻油中大麻素的分析結果（表4）數據進行PCA（圖4）。圖4A顯示，方法可明顯辨別4 種樣品之間的差異，前兩個PC的影響占到了70.4%。在PC1上，位于正象限的脫殼工藝火麻油可以有效地與兩種帶殼工藝火麻油分離，這可能與脫殼工藝后大麻素類物質的含量明顯降低有關系。在PC2上，“云麻8號”品種的種籽壓榨的火麻油也可與“云麻7號”很好地區分開來，這可能是由于兩品種大麻素類和萜烯類成分含量有普遍差異。基于偏最小二乘回歸分析（partial least square discriminate analysis，PLS-DA）的VIP評分排序（圖4C）可用于確定不同變量對樣品區分的影響程度，VIP值高于1的每一種化合物都將被認為對組間差異有顯著貢獻。PCA的雙標圖（圖4B）和VIP評分圖（圖4C）共同表明，在4 組樣品中，萜品油烯、(E)-2-庚烯醛、橙花醛、β-瑟林烯、β-石竹烯、β-月桂烯以及THCA-A、Δ8-THC、CBC等成分的得分均在1.2 分以上，是重要區分物質。4 組樣品的熱圖（圖4D）也是探索不同群體之間差異的有效工具，熱圖和基于Pearson相關系數的相關矩陣圖（圖4E）都通過顏色的差別明確標示出對不同樣品差異性的貢獻最大的物質，及對4 種火麻油樣品有效聚類。如圖所示，多元分析結果相互支持，對“云麻7號”和“云麻8號”的脫殼工藝、帶殼工藝4 種火麻油樣本進行完美鑒定和區分。

圖4 4 種火麻油樣品揮發性成分和大麻素類成分的PCA、PCA雙標、PLS-DA VIP評分、熱圖及相關系數矩陣圖Fig.4 PCA plot,PCA biplot,PLS-DA VIP score plot,heatmap and correction matrix plot of volatile compounds and cannabinoids in four different hemp oil samples

3 結論

本實驗主要基于GC-MS和UPLC的儀器分析方法，對云南省種植品種的火麻油進行萜烯類、脂肪酸和大麻素類化學成分的分析與研究，并利用數據分析軟件進行PCA，為云南省火麻油及植物種質特性提供了更多基礎科學數據，并在分析基礎上對火麻油食品安全問題提出建議。

結果表明，云南火麻油與火麻仁中不飽和脂肪酸豐富，其中亞油酸與亞麻酸含量比屬于黃金比例，約為2.5∶1。火麻籽中的脂肪酸在榨油過程中全部保留進入火麻油，冷榨工藝前提下火麻籽是否脫殼對油中脂肪酸含量和比例無影響。采用SPME-GC-MS法，從云南火麻油中檢測到30余種揮發性成分，其中含量較高的特色萜烯類物質包括：β-石竹烯、β-月桂烯、2-庚烯醛、蛇麻烯、檸檬烯等。對火麻油中11 種大麻素成分的分析結果表明，不同品種、不同工藝的火麻油中均可檢測到微量、多種活性大麻素成分，其中含量最高的是CBDA和THCA-A兩種酸性大麻素。脫殼工藝可使火麻油中大麻素成分含量明顯降低，“云麻7號”和“云麻8號”種質優化表現為提高CBDA含量的同時降低了THC含量。利用MetaboAnalyst 5.0在線數據分析平臺對檢測到的萜烯類和大麻素類成分進行PCA，對4 種火麻油樣本進行了完美的鑒定和區分，并找出其中的重要區分物質。

最后，從食品安全和產品出口的雙重角度考慮，在全球許多國家已經開始對工業大麻相關食品中的Δ9-THC實施檢測要求的現狀下，建議我國也盡快制定相應的標準或規范，對火麻油及火麻相關食品進行Δ9-THC的含量檢測要求，首先將其識別出來，再進一步進行安全范圍的限定。生產企業也有必要進一步改善和規范工藝，應盡可能地減少成品油中精神活性大麻素Δ9-THC的含量。及時制定火麻食品中相關大麻素類成分檢測的標準或規范，有助于完善監管制度，保障食品安全，同時還將促進產業的發展及其與國際接軌。