基于非靶向代謝組學的不同菌種強化發(fā)酵瀏陽豆豉的代謝差異分析

劉晶晶，鄧高文，胡嘉亮，覃業(yè)優(yōu)，劉 洋,，蔣立文,

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.湖南壇壇香食品科技有限公司，湖南 長沙 410300）

豆豉是中國傳統(tǒng)特色發(fā)酵豆制品，其歷史最早可追溯至秦漢時期[1]。豆豉中富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽、磷、鎂、鈣及多種維生素，不僅能用于調(diào)味，還可用于入藥[2-3]。瀏陽豆豉歷史悠久，其味、香獨特，色、形俱佳，但現(xiàn)階段瀏陽豆豉生產(chǎn)大多依靠自然發(fā)酵，具有季節(jié)性，因此基本呈小作坊形式生產(chǎn)，工業(yè)化程度低。而強化發(fā)酵為在自然發(fā)酵基礎上，人為添加優(yōu)勢菌種，使發(fā)酵過程不受季節(jié)限制，有利于推進傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)的工業(yè)化[4]。

通常，微生物代謝是發(fā)酵食品風味產(chǎn)生的決定性因素，食品中簡單的營養(yǎng)物質(zhì)如葡萄糖、蛋白質(zhì)等可通過微生物代謝產(chǎn)生芳香風味物質(zhì)和味感風味物質(zhì)，因此微生物代謝調(diào)控已成為提升食品風味的重要手段[5]。李玉斌等[6]利用酵母菌強化發(fā)酵增加保寧醋風味物質(zhì)的種類及含量以改善風味。石媛媛等[7]發(fā)現(xiàn)乳酸菌強化發(fā)酵可保留刺梨果醋中的營養(yǎng)物質(zhì)并增加其揮發(fā)性風味物質(zhì)的種類及含量。He Guiqiang等[8]指出毛霉型豆豉在發(fā)酵完后第二年具有較高的醇類、酯類、酚類、酮類和吡嗪類等特征風味物質(zhì)。而目前對于瀏陽豆豉的研究多集中于微生物菌落結(jié)構分析、優(yōu)勢微生物的分離鑒定和揮發(fā)性物質(zhì)組成及分析上，對豆豉中微生物的代謝特征知之甚少。因此，研究不同分離菌種強化發(fā)酵瀏陽豆豉的代謝差異，對推動瀏陽豆豉工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

非靶向代謝組學是一種研究生物體內(nèi)代謝組成和變化的方法，它通過對整個生物體進行全面組學分析，從而獲得大量有關生物體代謝組成和變化的信息。非靶向代謝組學研究工具包括核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用以及高效液相色譜-質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）聯(lián)用[9]。其中HPLC-MS因其樣品制備和前處理操作簡易、穩(wěn)定性和靈敏度高而被廣泛應用。Zhang Ping等[10]采用HPLCMS技術研究發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵大醬中微生物蛋白的數(shù)量和種類均存在差異。Peng Jiangying等[11]基于HPLCMS技術探究褐色發(fā)酵乳與傳統(tǒng)發(fā)酵乳代謝產(chǎn)物差異，發(fā)現(xiàn)褐色發(fā)酵乳經(jīng)過美拉德反應產(chǎn)生了更多的風味物質(zhì)。

前期研究在瀏陽豆豉不同階段樣品中分離出2 株高產(chǎn)蛋白酶活性黃曲霉菌株，經(jīng)黃曲霉產(chǎn)毒培養(yǎng)基法檢測以及采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性分析法鑒定發(fā)現(xiàn)均不具備產(chǎn)黃曲霉毒素能力[12]。本研究利用此兩菌株及復合菌株對瀏陽豆豉進行強化發(fā)酵，并比較米曲霉菌種強化發(fā)酵豆豉和自然發(fā)酵豆豉的總酸含量、氨基酸態(tài)氮含量以及代謝產(chǎn)物的差異，探究不同菌種強化發(fā)酵對瀏陽豆豉代謝產(chǎn)物形成的影響，以期為瀏陽豆豉的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麩皮 億鄉(xiāng)情名優(yōu)農(nóng)產(chǎn)品創(chuàng)業(yè)店；陜西黃仁腎形小黑豆 湖南壇壇香食品科技有限公司。實驗用菌種黃曲霉AF7214（Aspergillus flavus7214，AF7214）（CGMCC 20735）、黃曲霉7622（A.flavus7622，AF7622）（實驗室自藏）系實驗室前期從瀏陽豆豉自然發(fā)酵不同階段樣品分離所得優(yōu)勢菌；混合組AF77為AF7214與AF7622等比例混合；米曲霉 濟寧玉園生物科技有限公司；酚酞指示劑 天津市化學試劑研究所有限公司；氫氧化鈉國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇 鄭州派尼化學試劑廠；甲醇、乙腈（均為色譜級）美國賽默飛世爾科技公司；2-氯苯丙氨酸、鄰苯二甲酸氫鉀 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲酸、甲酸銨 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

H1850冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；VORTEX-5旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；KW-100TDV超聲波清洗器 舒美超聲儀器有限公司；SCIENTZ-48組織研磨器 寧波新芝生物科技股份有限公司；U3000液相色譜儀、QE質(zhì)譜儀美國Thermo公司；READMAX1900酶標儀 上海閃譜生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 瀏陽豆豉制作工藝及操作要點

前處理（新鮮的黑豆→清洗→浸泡→蒸煮→攤涼冷卻）→前發(fā)酵（自然發(fā)酵/強化發(fā)酵制曲→晾曲→洗曲）→后發(fā)酵（渥堆→轉(zhuǎn)桶→渥堆→曬制）→成品

前處理：選取50 kg新鮮飽滿無蟲害黑豆，清洗雜質(zhì)，水溫25 ℃水面高于豆豉5 cm浸泡2 h，結(jié)束后迅速倒入蒸籠，蒸汽完全滲透豆子（即頂部豆子布滿水蒸氣）開始計時40 min，將蒸煮過后的黑豆打散攤涼，溫度控制在30 ℃以下，防止溫度過高導致制曲接入的菌種死亡。

前發(fā)酵：將豆子與擴培后的麩皮混勻，接種量為0.2%，裝盤制曲（溫度28～35 ℃、相對濕度50%～80%）。此階段黑豆開始發(fā)酵，制曲持續(xù)8 d，室溫通風7 d，通風后放入翻缸清洗機洗凈黑豆表面曲霉，前發(fā)酵共15 d。

后發(fā)酵：洗曲后的豆子用紗布包裹放入3 m3竹桶中室溫下渥堆4 d，其中渥堆第2天進行轉(zhuǎn)桶操作并加入3%食鹽混勻，渥堆結(jié)束曬制2 d，得到豆豉成品，后發(fā)酵時間共6 d。

采用分離的優(yōu)勢菌株以及米曲霉對小黑豆進行強化發(fā)酵制曲，得到AF7214強化發(fā)酵豆豉（AF 72D）、AF7622強化發(fā)酵豆豉（AF 76D）、AF7214和AF7622等比例混合強化發(fā)酵豆豉（AF 77D）、米曲霉強化發(fā)酵豆豉（AOD）、自然發(fā)酵豆豉（NFD）。

1.3.2 取樣

AF 72D、AF 76D、AF 77D、AOD、NFD取制曲第2、5、8天、洗曲、轉(zhuǎn)桶、渥堆第4天共30 個樣品進行總酸及氨基酸態(tài)氮含量測定，取豆豉成品進行代謝物的多元統(tǒng)計分析。為消除隨機誤差，每次取樣在豆豉堆的上層、中層、下層分別取樣50 g并混和，作為該階段代表性樣品，重復3 次。

1.3.3 指標測定

總酸測定：采用pH計電位滴定法，參考GB 12456—2021《食品中總酸的測定》[13]；氨基酸態(tài)氮測定：采用酸度計法，參考GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》[14]。

1.3.4 HPLC-MS分析

樣品前處理：參考Vasilev等[15]方法，稱量200 mg樣本與0.6 mL質(zhì)量濃度4 μg/mL的2-氯苯丙氨酸混合于EP管中，渦旋振蕩30 s，加入玻璃珠60 Hz下研磨90 s，而后室溫下超聲處理15 min，4 ℃、12000 r/min離心15 min，取上清液過0.22 μm膜，濾液進行HPLC-MS檢測。

色譜條件：參考Omnia等[16]的方法。洗脫條件：自動進樣器溫度8 ℃；流速0.25 mL/min；柱溫40 ℃；進樣2 μL。流動相為正離子模式0.1%甲酸溶液-0.1%甲酸乙腈溶液；負離子模式5 mmol/L甲酸銨溶液-乙腈。

質(zhì)譜條件：參考Gustavo等[17]方法。儀器使用電噴霧離子源，條件設置如下：鞘氣體流量為30 arb，輔助氣體流量為10 arb，毛細管溫度325 ℃，分辨率為70000，掃描范圍81～1000，噴霧電壓分別為3.5 kV（正）或-2.5 kV（負），進行峰值檢測、提取、比對和整合。

1.4 數(shù)據(jù)分析

總酸及氨基酸態(tài)氮的測定實驗重復3 次，測定數(shù)據(jù)通過Origin 2021軟件進行分析，結(jié)果采用±s表示。HPLC-MS原始數(shù)據(jù)通過峰識別、對其等數(shù)據(jù)預處理操作得到數(shù)據(jù)矩陣，并根據(jù)Studentt檢驗的P＜0.05，以及多維統(tǒng)計變量重要投影（variable importance in projection，VIP）＞1.5篩選差異代謝物，利用OmicStudio（https://www.omicstudio.cn/tool）進行熱圖繪制；代謝通路分析結(jié)合京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫，并采用網(wǎng)絡圖進行進一步信息挖掘，在https://www.biodeep.cn/login網(wǎng)站上進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌種強化發(fā)酵瀏陽豆豉各階段總酸、氨基酸態(tài)氮含量的變化

2.1.1 總酸含量的變化

由圖1可知，5 組不同菌種強化發(fā)酵瀏陽豆豉隨著發(fā)酵時間的延長，總酸含量均呈現(xiàn)上升的趨勢。其中，在制曲、洗曲階段（1～15 d），總酸含量的增長相對緩慢。而渥堆前期（15～17 d）總酸含量增長迅速，渥堆后期變化較小，這可能系渥堆前期無鹽導致微生物大量繁殖，乳酸菌等細菌產(chǎn)生大量的有機酸。而在渥堆后期（17～19 d），由于食鹽的添加抑制了微生物的生長及代謝，總酸含量變化趨于穩(wěn)定[18]。其中AF 72D的總酸增速最大，發(fā)酵結(jié)束后總酸質(zhì)量分數(shù)高達3.52%，增幅為2.48%；其次是AOD、NFD、AF 77D，而AF76D的總酸質(zhì)量分數(shù)最低僅有1.64%，這可能與豆豉接入微生物和自然發(fā)酵微生物的種類及其分泌酶系有關。

圖1 不同菌種強化發(fā)酵瀏陽豆豉總酸含量的變化Fig.1 Changes of total acid contents in Liuyang Douchi fermented by different strains

2.1.2 氨基酸態(tài)氮含量的變化

氨基酸態(tài)氮不僅是判定發(fā)酵豆制品發(fā)酵程度的特性指標，還可以衡量瀏陽豆豉發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)的水解程度，同時也是瀏陽豆豉的滋味來源之一[19]。如圖2所示，隨著瀏陽豆豉發(fā)酵時間的延長，氨基酸態(tài)氮含量不斷增加，其中渥堆前期（15～17 d）氨基酸態(tài)氮含量上升尤為明顯，與總酸變化趨勢類似。渥堆后期（17～19 d）由于添加食鹽抑制了微生物的活性，氨基酸態(tài)氮增長速率逐漸趨于平緩并達到最大值，AF 72D的氨基酸態(tài)氮含量最高，為1.47 g/100 g，AF 76D的氨基酸態(tài)氮含量最低，僅有0.82 g/100 g，這可能由于AF7214的蛋白酶活性高于AF7622所致[12]。由此可見AF7214菌株發(fā)酵特性較好，可作為瀏陽豆豉良好的發(fā)酵劑。

1.全社會要形成關注藍天、保護綠色生態(tài)的共識。可持續(xù)發(fā)展是長期的科學發(fā)展觀念，不以一時的效益作為發(fā)展目標，也不以損害環(huán)境作為生活或者發(fā)展的代價。想要真正做到可持續(xù)發(fā)展，就必須讓全社會都行動起來，當綠色生活成為一種社會風氣之后，可持續(xù)發(fā)展自然就能夠得以實現(xiàn)。社會的每一個人在使用綠色理念來指導整個產(chǎn)業(yè)發(fā)展時，其通過嚴格意義上的自我規(guī)范和約束，從而讓這個社會在發(fā)展過程中的資源成本利用率最高。我國在未來實行可持續(xù)發(fā)展的過程中，要注重選擇合適的產(chǎn)業(yè)，因為該理念對社會發(fā)展的影響是全面的和深厚的，所以在當前社會中必須要形成一種全社會的綠色經(jīng)濟氛圍。

圖2 不同菌種強化發(fā)酵瀏陽豆豉氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.2 Changes of amino nitrogen contents in Liuyang Douchi fermented by different strains

2.2 不同菌種強化發(fā)酵瀏陽豆豉的代謝差異分析

2.2.1 偏最小二乘判別分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA）

PLS-DA對相關性較小的變量較敏感，能夠忽略組內(nèi)誤差、消除與研究目的無關的隨機誤差，常用于分析不同樣品之間的相似度以及差異性。根據(jù)圖3A可以發(fā)現(xiàn)，樣本在PC1維度可以分為兩組，包括正方向的AF 72D和AF 77D，以及負方向的NFD、AOD和AF 76D，各樣本點可良好區(qū)分，說明樣本之間差異明顯。此外，AF 77D和AF 72D距離較近，表明兩種樣品之間代謝產(chǎn)物組成相似。圖3B置換檢驗圖中Q2值為0.967，Q2回歸線在X＝0的交點為（0.0，-0.69），說明該PLS-DA模型穩(wěn)定性較好且沒有出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，具有較好的預測能力，數(shù)據(jù)有效可進行后續(xù)分析。值分別為0.645、0.993，均大于0.5且值接近于1，說明該模型能很好的解釋樣本之間的差異。

圖3 不同菌種強化發(fā)酵瀏陽豆豉代謝物的PLS-DA得分圖（A）和置換檢驗圖（B）Fig.3 PLS-DA score plot (A) and permutation test (B) of metabolites in Liuyang Douchi fermented by different strains

2.2.2 差異代謝通路分析

KEGG是大型分子數(shù)據(jù)集生成的基因組測序和其他高通量實驗技術的實用程序數(shù)據(jù)庫資源[20]。圖4A與圖4B分別為AF72D、AF 76D同NFD的差異代謝通路，可以看出與自然發(fā)酵樣品相比，AF72D、AF 76D在氨酰生物合成，精氨酸生物合成，乙醛酸和二羧酸代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，三羧酸循環(huán)通路上均具有顯著性差異。其中，AF 72D同NFD影響最為顯著的差異代謝通路為氨酰生物的合成，參與氨酰生物合成的差異代謝物有L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-蘇氨酸以及L-酪氨酸等在內(nèi)的14 種氨基酸及其衍生物，其中L-天冬氨酸、L-谷氨酸為鮮味氨基酸，是豆豉的主要鮮味來源，L-谷氨酸可通過大豆蛋白降解或者L-谷氨酰胺脫酰胺產(chǎn)生；L-蘇氨酸廣泛存在于發(fā)酵食品中，與葡萄糖共熱可產(chǎn)生焦香味，對豆豉有增香作用；L-亮氨酸是人體必需氨基酸，具有降血糖的功能。而AF 76D同NFD影響最為顯著的差異代謝通路為乙醛酸和二羧酸代謝，參與乙醛酸和二羧酸代謝的差異代謝物主要為丙酮酸、琥珀酸、L-絲氨酸、檸檬酸等氨基酸及有機酸類物質(zhì)，這幾種差異代謝物同時也參與了多條代謝通路，例如丙酮酸可在有氧條件下轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，通過三羧酸循環(huán)產(chǎn)生檸檬酸、琥珀酸等[21]，為機體生命活動提供能量。

圖4 優(yōu)勢菌種強化發(fā)酵瀏陽豆豉同自然發(fā)酵瀏陽豆豉的差異代謝物KEGG富集圖Fig.4 KEGG enrichment analysis of differential metabolites among Liuyang Douchi fermented naturally and using starter cultures

如圖4C所示，AF 77D同NFD具有顯著差異的代謝通路為精氨酸和脯氨酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、精氨酸生物合成、色氨酸代謝、三羧酸循環(huán)。色氨酸代謝后部分色氨酸經(jīng)氧化脫羧后轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥色胺，5-羥色胺具有穩(wěn)定情緒的作用，常被用于抗抑郁藥物[22]。而Impact值最大的代謝通路為丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，這3 種氨基酸均為生糖氨基酸，代謝后先轉(zhuǎn)化為丙酮酸、α-酮戊二酸、琥珀酸或草酰乙酸，再轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟呛吞窃稍黾佣刽鸲取?/p>

圖4D為AOD與NFD的差異代謝物所映射的24 條代謝通路，富集到的差異代謝物較多且Impact值相對較高的前5 條代謝通路分別為賴氨酸生物合成，苯丙氨酸代謝，三羧酸循環(huán)，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝。其中賴氨酸生物合成與苯丙氨酸的代謝影響顯著（P＜0.05）。L-賴氨酸主要由α-氨基己二酸在α-氨基乙二酸還原酶等的催化下合成。而苯丙氨酸一方面可通過代謝產(chǎn)生苯乙醛、苯乙酮等致香前體物質(zhì)[23]；另一方面，苯丙氨酸通過苯丙氨酸羥化酶氧化生成酪氨酸，進一步參與豆豉中的糖代謝和脂類代謝。

2.2.3 不同菌種強化發(fā)酵瀏陽豆豉的差異性化合物分析

為進一步討論不同菌種發(fā)酵瀏陽豆豉代謝差異，以PLS-DA模型為基礎，篩選出VIP＞1.5、P＜0.05的差異代謝物共62 種，如表1所示。其中氨基酸及其衍生物26 種、有機酸及其衍生物16 種、脂類及其衍生物12 種、吡啶及其衍生物4 種、核苷酸類及其衍生物4 種。對62 種差異代謝物繪制熱圖進行凝聚層次聚類（圖5），可將AF 72D和AF 77D聚為一類，NFD、AOD、AF 76D聚為一類，可見AF 76D同NFD以及AOD代謝產(chǎn)物更為接近，這與PLS-DA結(jié)果（圖3A）一致。

表1 不同菌種強化發(fā)酵瀏陽豆豉差異代謝物的篩選結(jié)果Table 1 Screening results of differential metabolites in Liuyang Douchi fermented by different strains

圖5 不同菌種強化發(fā)酵瀏陽豆豉差異代謝物熱圖Fig.5 Heatmap of differential metabolites in Liuyang Douchi fermented by different strains

氨基酸既是豆豉的重要呈味基礎，也是風味物質(zhì)形成的底物[24-25]。表1所篩選出的氨基酸類差異代謝物包括多種呈味氨基酸，如呈苦味的L-賴氨酸以及呈甜味的L-絲氨酸。通過比較表1中不同菌種發(fā)酵豆豉的峰面積，可知分離菌株強化發(fā)酵豆豉的L-賴氨酸峰含量均低于NFD，而L-絲氨酸含量高于NFD及AOD，這可能造成分離菌株強化發(fā)酵豆豉的甜度高于NFD。同時，分離菌株強化發(fā)酵豆豉的色胺及腐胺含量要低于NFD，可見分離菌株強化發(fā)酵豆豉要比自然菌種發(fā)酵豆豉更加安全健康[26]。

脂類衍生物包括酯類、醇類。表1中，共鑒定出12 種脂類及其衍生物，這些物質(zhì)中有部分是芳香物質(zhì)，可為豆豉增加風味。如(S)-1-苯乙醇帶有清甜的草莓香以及梔子花香氣味[31]，茉莉酸甲酯有茉莉花香[32]，而分離菌株強化發(fā)酵豆豉中的苯乙醇和茉莉酸甲酯的含量高于NFD，這賦予了分離菌株強化發(fā)酵豆豉較之NFD更加明顯的清爽花果香氣味，說明分離微生物是瀏陽豆豉發(fā)酵中的優(yōu)勢微生物。

圖5共篩選出4 種吡啶及其衍生物（解磷定、三氧嘧啶、2,4-二羥基吡啶、四氫蝶啶），以及4 種核苷酸及其衍生物（脫氧肌苷、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶）。其中解磷定醫(yī)藥上被用于烷基磷酸酯類家藥中毒的解毒劑。而胞嘧啶與尿嘧啶均為核酸主要堿基組成成分之一，胞嘧啶是合成抗癌藥物以及抗艾滋病藥物的重要中間體，尿嘧啶與核糖生成的尿苷則是抗心腦血管疾病藥物的關鍵原料，說明瀏陽豆豉具有一定的藥用價值[33]。

2.2.4 不同菌種強化發(fā)酵瀏陽豆豉差異代謝通路及代謝物關系分析

根據(jù)不同菌種強化發(fā)酵豆豉的差異代謝物構建了差異代謝通路及代謝物關系網(wǎng)絡圖（圖6）。氨基酸的生物合成通路富集到的差異代謝物最多，涉及多種氨基酸如L-精氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸、L-絲氨酸等。其中L-谷氨酸參加了7 條關鍵代謝通路，是參加關鍵代謝通路最多的物質(zhì)，有利于改善豆豉鮮味。其在精氨酸和脯氨酸代謝通路中由精氨酸的中間體N2-琥珀酸-L-鳥氨酸和N-琥珀酰-L-谷氨酸-5-半醛等以及脯氨酸的中間體1-吡諾林-5-羧酸酯等反應生成，在N-乙酰谷氨酸合成酶[EC 2.3.1.1]的作用下轉(zhuǎn)化為N-乙酰-L-谷氨酸可進一步生成蘇氨酸。L-絲氨酸呈甜味，在豆豉發(fā)酵過程中共參與了4 條代謝通路，其在L-絲氨酸脫水酶[EC 4.3.1.17]的催化下產(chǎn)生丙酮酸，而丙酮酸是豆豉中產(chǎn)醬香風味的重要中間代謝物[34]。L-精氨酸則參與了6 條關鍵代謝通路，其在精氨酸和脯氨酸代謝通路中可轉(zhuǎn)化生成L-脯氨酸參與蛋白質(zhì)的消化吸收及ABC轉(zhuǎn)運通路。L-酪氨酸參與了4 條關鍵代謝通路，它可由苯丙氨酸在苯丙氨酸-4-羥化酶[EC 1.14.6.1]的作用下轉(zhuǎn)化生成，也可在氨基酸的生物合成通路中由對羥苯丙酮酸通過芳香氨基酸轉(zhuǎn)氨酶[EC 2.6.1.57]的作用生成。L-酪氨酸是合成多巴胺的原料，其被攝入人體后可在酪氨酸羥化酶的作用下轉(zhuǎn)化為左旋多巴，并進一步生成多巴胺[35]。

圖6 不同菌種強化發(fā)酵瀏陽豆豉差異代謝物及其代謝通路的富集關系圖Fig.6 Enrichment relationship network of differential metabolites and metabolic pathways in Liuyang Douchi fermented by different strains

3 結(jié)論

本研究通過測定分離菌株強化發(fā)酵同自然發(fā)酵以及米曲霉強化發(fā)酵瀏陽豆豉的總酸、氨基酸態(tài)氮含量并采用HPLC-MS非靶向代謝組學技術對其代謝產(chǎn)物進行分析，發(fā)現(xiàn)AF 72D的總酸質(zhì)量分數(shù)、氨基酸態(tài)氮含量最高，分別為3.52%、1.47 g/100 g，且渥堆后期較發(fā)酵初期總酸含量增長顯著。PLS-DA結(jié)果顯示5 組豆豉中AF 76D和NFD的代謝產(chǎn)物差異最小。AF 72D、AF 76D、AF 77D同NFD在精氨酸生物合成、乙醛酸和二羧酸代謝、三羧酸循環(huán)代謝通路上均具有顯著差異，而米曲霉強化發(fā)酵同NFD的差異體現(xiàn)在賴氨酸生物合成與苯丙氨酸的代謝等通路上。5 組豆豉的差異代謝產(chǎn)物共62 種，其中氨基酸類（26 種）、脂類（12 種）、有機酸類（16 種）、吡啶類（4 種）及其核苷酸類（4 種），并發(fā)現(xiàn)在其所映射的8 條關鍵代謝通路中，氨基酸的生物合成通路富集到的差異代謝物最多，富集到21 種。其中L-谷氨酸參與了7 條關鍵代謝通路，可見分離菌株強化發(fā)酵對豆豉發(fā)酵過程中氨基酸代謝的影響最為顯著。同時結(jié)合代謝組學發(fā)現(xiàn)瀏陽豆豉中部分物質(zhì)被應用于醫(yī)藥或為藥用物質(zhì)的重要前體，下一步將對關鍵核心物質(zhì)成分進行目標調(diào)控，為瀏陽豆豉成為藥食同源提供重要的物質(zhì)基礎和理論依據(jù)。