發酵過程中烏鱧魚糜的品質特征變化

李松林，錢心睿，張藝彤，馬海清

（1.淮陰工學院生命科學與食品工程學院，江蘇 淮安 223003；2.淮安市產業投資有限公司，江蘇 淮安 223001）

烏鱧（Channa argus）是蛇頭魚科的主要品種，因其蛋白質和多不飽和脂肪酸含量高、脂肪含量低以及價格相對便宜而受到關注，在我國是重要的淡水養殖魚類，年產量超過50萬 t[1-2]。目前烏鱧加工方式較為簡單，且產品類型較少，主要以冷凍魚片作為出口水產品[3]。因此，開展烏鱧精深加工，對更好地利用烏鱧資源以及提高其產品經濟價值具有重要意義。

魚糜是一種深受世界各地消費者喜愛的高蛋白、低脂肪的健康食品，將魚肉加工成魚糜，可以豐富產品的多樣性，增加其附加值[4]。目前對于烏鱧魚糜的研究主要集中于魚糜的品質研究。吳豐芮[5]研究了當歸、黨參和山藥的添加對烏鱧魚糜質構特性和感官評價的影響。米紅波等[6]對烏鱧魚糜與其他淡水魚的營養特性和品質差異進行了分析比較。俞啟[7]建立了烏鱧魚糜制品品質的快速檢測方法，對近紅外光譜技術應用于魚糜制品原料的質量控制進行了探究。微生物發酵技術被廣泛應用于食品加工中，魚糜的風味、質地、色澤等品質屬性在經過發酵后會發生不同程度的變化。傳統發酵魚制品主要依靠自然界和原料自身攜帶的微生物在適宜溫濕度條件下發酵而成，存在發酵時間長、產品質量不穩定等缺點[8]。而接種發酵劑進行發酵是提升發酵魚制品品質的一種有效途徑，可以縮短發酵過程，提升營養、質地和風味品質[9]。益生菌尤其是片球菌屬被廣泛應用于生產淡水魚糜。Xu Yanshun等[10]采用戊糖片球菌發酵鰱魚魚糜48 h后，可形成致密的凝膠網絡，增強了凝膠強度，提升了質構品質。Li Chunsheng等[11]發現戊糖片球菌發酵改善了魚糜的凝膠強度和硬度等物理特性，同時顯著提高了鮮味和甜味游離氨基酸含量。此外，Nie Xiaohua等[12]采用戊糖假單胞菌GY23發酵草魚香腸，發現接種菌株在發酵過程中可以快速降解蛋白質，顯著增加了與風味形成相關的游離氨基酸濃度。雖然微生物發酵技術在魚糜加工中得到了廣泛的研究與應用，但對于采用微生物發酵劑接種發酵烏鱧魚糜提升其品質的研究鮮見報道。

因此，本研究采用戊糖片球菌發酵烏鱧魚糜，以自然發酵魚糜為對照，以pH值、總酸、總揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值、色差、質構特性、游離氨基酸、總氨基酸、脂肪酸和感官評價為主要指標，研究發酵過程中魚糜的品質變化情況，以期為人工接種發酵劑進行烏鱧魚糜加工提供理論依據和支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烏鱧、食鹽和葡萄糖（食品級）購于本地超市。

戊糖片球菌 中國工業微生物菌種保藏管理中心；MRS培養基 上海弘順生物科技有限公司；沃特曼4號濾紙 英國Whatman公司；氯仿、甲醇 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

TA-XT物性測試儀 英國Stable Micro Systems公司；SP907R料理機 浙江紹興蘇泊爾生活電器有限公司；5810R冷凍高速離心機 德國艾本德股份有限公司；BG-160隔水式培養箱 上海博迅醫療生物儀器股份有限公司；PHS-2F型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；MiniScan EZ4000L色差儀 美國HunterLab公司；L-8800氨基酸分析儀 日本日立公司；6890-5973型氣相色譜-質譜聯用儀、HP-88毛細管柱 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 烏鱧發酵魚糜的制備

戊糖片球菌在MRS培養基中以30 ℃培養24 h，進行2 次傳代，隨后4 ℃、10 000 r/min離心15 min收集菌體，用無菌生理鹽水稀釋成108～109CFU/mL的菌懸液，用于魚糜接種。烏鱧去除鱗片、頭、刺和內臟后，將魚肉切片，使用無菌水清洗3 次后攪成肉糜。以原料魚糜質量為基準加入質量分數2%食鹽和1%葡萄糖，隨后混合均勻。最后，將適量的菌懸液接種至魚糜中，使其最終濃度為7（lg（CFU/g））。將接種后的魚糜灌入直徑32 mm塑料腸衣中，35 ℃發酵48 h，每12 h取非熟化魚糜制品進行分析檢測。

1.3.2 pH值、總酸和TVB-N值的測定

取魚糜制品（5.0 g）加入50 mL蒸餾水研磨均質后，采用pH計測定pH值；總酸的測定方法參考GB 12456—2021《食品中總酸的測定》[13]；TVB-N值的測定方法參考GB 5009.228—2016《食品中揮發性鹽基氮的測定》[14]。

1.3.3 色差的測定

將魚糜制品切成塊狀（20 mm×20 mm×15 mm），采用色差儀測定L*（亮度值）、a*（紅/綠值）和b*（黃/藍值）。

1.3.4 質構特性的測定

將半固態的魚糜制品切成塊狀（20 mm×20 mm×15 mm），采用帶P/5探頭的物性測試儀測定硬度、附著性、彈性和內聚性。測試速率和觸發力分別為0.7 mm/s和0.2 N，兩次壓縮過程的時間間隔為5 s，實驗樣本平行測定6 次。

1.3.5 游離氨基酸和總氨基酸的測定

在魚糜樣品（5.0 g）中加入45 mL蒸餾水進行研磨均質，隨后在4 ℃、10 000 r/min離心10 min獲得上清液。上清液經過0.22 μm過濾膜過濾后，采用氨基酸分析儀測定游離氨基酸。另取5.0 g魚糜樣品與10 mL鹽酸溶液（6 mol/L）混合后置于水解管中，110 ℃水解22 h。隨后將冷卻至室溫的水解液過濾至容量瓶中，定容至50 mL。取1.0 mL濾液于10 mL試管中進行干燥，隨后加入檸檬酸鈉緩沖溶液（pH 2.2），經過0.22 μm過濾膜過濾后，采用氨基酸分析儀測定總氨基酸。

1.3.6 蛋白質質量評價

化學評分和必需氨基酸指數按照參考文獻[15]的方法進行計算，分別如式（1）、（2）所示：

式中：s為實驗樣本中的氨基酸含量；r為1～2 歲兒童的必需氨基酸需求量；n為氨基酸數量（取苯丙氨酸＋酪氨酸、甲硫氨酸＋半胱氨酸為1）。

1.3.7 脂肪酸的測定

將研磨后魚糜制品（20.0 g）與氯仿-甲醇（50 mL，2∶1，V/V）的混合物以11 000 r/min均質60 s，隨后繼續加入25 mL氯仿，以相同速率均質30 s，通過沃特曼4號濾紙進行過濾。氯仿相使用旋轉蒸發器在30 ℃進行蒸發，并使用氮氣吹干去除殘留溶劑。采用氣相色譜法測定魚糜制品中的游離脂肪酸[16]。色譜柱：HP-88毛細管柱（100 m×0.25 mm，0.20 μm）；升溫程序：初溫60 ℃，保持2 min，以28 ℃/min的速率增加到180 ℃，然后以2 ℃/min的速率增加到248 ℃，保持10 min；進樣口和檢測溫度分別設置為250 ℃和300 ℃。

1.3.8 感官評價

發酵魚糜制品的色澤、組織狀態、氣味和總體接受度由5 名男生和5 名女生組成的感官鑒評小組采用九點快感標度法進行感官評定[17]。

1.4 數據處理

除質構特性測定外，實驗樣本平行測量3 次，采用Origin 2021和GraphPad軟件進行顯著性差異分析與作圖。采用R軟件（4.2.2版），通過dplyr、linkET和ggplot2軟件包進行Mantel檢驗，分析感官特征與品質指標之間的相關性，并使用qcorrplot指令進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中魚糜pH值和總酸的變化

如圖1所示，魚糜在發酵過程中pH值逐漸下降，發酵48 h后，接種發酵組pH值從6.40降至4.97。與pH值下降的趨勢相反，總酸含量隨發酵時間的延長而上升，發酵完成時接種發酵組的總酸含量比自然發酵組增加了52.29%。自然發酵組pH值的下降可能是由于魚死后內源酶或自身攜帶的微生物酶的作用引起三磷酸和糖原分解，導致乳酸、磷酸和其他酸含量的增加[18-19]。接種發酵組在發酵過程中，由于戊糖片球菌能夠有效分解碳水化合物而產生酸類物質，從而進一步快速降低pH值[20]。李培瑜等[21]在探究鲅魚糜發酵過程中理化特性的變化規律時，同樣發現由于戊糖片球菌的生長繁殖而產生大量有機酸，導致pH值在發酵36 h后大幅降低。低pH值在對食品感官評價產生影響的同時，形成的酸化環境會對致病菌和堿性腐敗菌的生長進行抑制，從而提升食品安全性[22]。

圖1 發酵過程中魚糜pH值和總酸含量的變化Fig.1 Changes in pH and total acid content of surimi samples during fermentation

2.2 發酵過程中魚糜TVB-N值的變化

魚肉中的TVB-N值反映了酶和微生物對蛋白質進行分解而產生氨和堿性含氮物質的作用程度，是肉制品新鮮度重要的評價指標之一[23]。隨著發酵時間的延長，自然發酵組和接種發酵組的TVB-N值均呈增加趨勢（圖2）。雖然兩組樣品在發酵48 h后的TVB-N值未超過GB 10136—2015規定的上限值（30 mg/100 g）[24]，但是自然發酵組比接種發酵組增加了14.61%，接種發酵組的TVB-N值增長速率受到顯著抑制。Zhang Yulong等[22]同樣發現使用戊糖片球菌發酵可以延緩肉制品中TVB-N值的增加，進一步提升肉類產品的新鮮度。戊糖片球菌在發酵過程中產生的乳酸可以中和肉制品中的揮發性堿性氮，從而減少TVB-N的積累[25-26]。

圖2 發酵過程中魚糜TVB-N值的變化Fig.2 Changes in TVB-N content of surimi samples during fermentation

2.3 發酵過程中魚糜的色差變化

色差參數反映了肉制品的光學特性，魚糜發酵過程中的L*、a*和b*值的變化如圖3所示。發酵魚糜的L*值呈現增加趨勢，發酵48 h后，接種發酵組L*值顯著高于自然發酵組。這是由于在戊糖片球菌發酵過程中，隨著總酸含量的增加，魚糜及其蛋白凝膠的pH值下降，在酸性條件下血紅素蛋白發生變性并產生滲出物，最終導致接種發酵組具有更高的L*值[27-28]。發酵過程中a*值和b*值同樣增加，但是在接種發酵組與自然發酵組之間均無顯著區別。Zhao Changcheng等[29]在鰩魚肉發酵48 h后發現a*值增加，認為這與肌紅蛋白的氧化和氧性肌紅蛋白的形成有關。b*值的增加則是磷脂頭基中胺或蛋白質中胺發生脂質氧化造成的結果[30]。

圖3 發酵過程中魚糜的色差變化Fig.3 Changes in color difference of surimi samples during fermentation

2.4 發酵過程中魚糜的質構特性變化

如圖4所示，與自然發酵組的硬度在發酵過程中持續下降不同，接種發酵組的硬度在前24 h增加，這是由于接種發酵組中更高的總酸含量導致魚糜蛋白產生酸誘導凝膠；此外形成的低pH值環境導致蛋白質發生變性、肌原纖維收縮而引起硬度增加[27,31]。在隨后的24 h發酵過程中，硬度的下降是由于內源性組織蛋白酶和微生物對蛋白質進行降解，降低了肌肉間細胞結合力，導致魚糜肌肉結構松弛[32-33]。但發酵結束時，接種發酵組的硬度仍然高于自然發酵組。接種發酵組的附著性絕對值在發酵結束時同樣高于自然發酵組。Zhou Xuxia等[34]認為魚糜附著性在發酵過程中持續增加的原因是由于魚糜蛋白不斷被水解以及其他大分子降解為小分子。發酵48 h后，接種發酵組的彈性和內聚性比自然發酵組分別降低了14.46%和39.06%。這是由于接種微生物、內源蛋白酶和pH值降低等因素導致了肌蛋白質的水解而進一步降低產品的彈性[35]。由于魚糜蛋白質在戊糖片球菌發酵過程中被大量水解，破壞了蛋白質分子之間、蛋白質與脂肪之間的凝膠網絡結構[36]，最終導致接種發酵組的內聚性低于自然發酵組。

圖4 發酵過程中魚糜的質構特性變化Fig.4 Changes in texture property of surimi samples during fermentation

2.5 發酵過程中魚糜的氨基酸變化

由表1可知，總必需氨基酸質量分數在接種戊糖片球菌發酵后提高了1.28%，且必需氨基酸中的蘇氨酸、賴氨酸和異亮氨酸的含量顯著提高（P＜0.05）。游離氨基酸中的總必需氨基酸含量在接種發酵后同樣顯著增加，其中賴氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸＋酪氨酸、異亮氨酸、亮氨酸以及甲硫氨酸＋半胱氨酸含量顯著提高（P＜0.05），而色氨酸含量顯著降低（P＜0.05）。除丙氨酸、組氨酸和精氨酸含量未有顯著變化，游離氨基酸中的其余非必需氨基酸含量在接種發酵后增加（P＜0.05）。接種發酵對甜味氨基酸和苦味氨基酸含量沒有顯著影響，但是鮮味氨基酸含量顯著增加（P＜0.05）。肌肉蛋白質的初始分解主要是由于內源性蛋白酶的作用，隨后微生物肽酶將蛋白質片段進一步降解為小肽和游離氨基酸，進而影響最終的質地和風味。Li Chunsheng等[11]發現采用戊糖片球菌發酵30 h的羅非魚腸的游離氨基酸含量達到最高值，此外鮮味氨基酸的濃度也顯著提高。Nie Xiaohua等[12]發現接種戊糖片球菌GY23的草魚香腸中發生了由內源酶和微生物酶引起的蛋白質水解作用，其中微生物酶主要是參與小分子蛋白質和多肽的二次水解，此外由于戊糖片球菌GY23具有更多的外肽酶，可以從肌肉蛋白質和多肽的N-氨基端產生游離氨基酸。采用聯合國糧食及農業組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）1～2 歲兒童的必需氨基酸需求量作為參照進行評價[37]，與未發酵魚糜相比，蘇氨酸、賴氨酸和異亮氨酸的化學評分均顯著提高（P＜0.05）。此外，必需氨基酸指數從73.9提高到74.8，表明戊糖片球菌接種發酵可以有效提高魚糜蛋白質的營養價值。

表1 接種發酵魚糜總氨基酸和游離氨基酸組成Table 1 Total and free amino acid composition of fermented surimi inoculated with P.pentosaceus

2.6 發酵過程中魚糜的脂肪酸成分變化

對脂肪酸在接種發酵組和自然發酵組之間的差異使用熱圖進行分析（圖5），顏色表示脂肪酸成分的相對豐度。隨著發酵時間的延長，飽和脂肪酸含量在自然發酵組中增加，而在接種發酵組中降低。與單不飽和脂肪酸在自然發酵組和接種發酵組中均呈降低趨勢不同，n-6多不飽和脂肪酸和n-3多不飽和脂肪酸含量在發酵過程中增加。多不飽和脂肪酸不僅是重要的營養物質，在生物系統中也具有廣泛的生物學功能。n-6多不飽和脂肪酸通過降低血脂表現出抗動脈粥樣硬化作用，n-3多不飽和脂肪酸則可以抑制血小板的聚集而作為抗凝血劑，同時降低膽固醇和磷脂[38]。脂肪氧化是導致肉制品和魚糜貯藏過程中品質下降的主要原因[39]。發酵完成時，接種發酵組多不飽和脂肪酸含量高于自然發酵組，這是由于戊糖片球菌在發酵過程中可以抑制不飽和脂肪酸的生物氫化或脂質過氧化而導致的降解[40-41]。其中，對人體健康至關重要的二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸在發酵后含量增加，提高了發酵魚糜的營養品質[42-43]。發酵過程中的微生物代謝可以產生由異構酶和水解酶引起的脂肪酸相互轉換，同時可以將多不飽和脂肪酸水解成其他低分子質量的脂肪酸，進而促進發酵產品中特征香氣化合物和內酯的形成[44]。上述結果表明，接種發酵對魚糜脂肪酸組成有重要影響，在降低飽和脂肪酸含量的同時，增加了多不飽和脂肪酸含量，提升了營養價值。

圖5 魚糜發酵過程中的脂肪酸成分變化熱圖Fig.5 Heatmap showing changes in fatty acid composition in surimi samples during fermentation

2.7 發酵魚糜的感官評價與Mantel檢驗

通過對食品的組織狀態、氣味、色澤、總體接受度等感官特征進行評價，可以直觀地反映評價者的接受程度和喜好。發酵開始時，接種發酵組的4 種感官特征的評分均與自然發酵組無顯著區別（圖6）。發酵48 h后，接種發酵組的氣味、色澤和總體接受度評分均高于自然發酵組，但是魚糜組織狀態評分在兩組之間沒有顯著差別。圖7中，對4 項感官特征與17 項品質指標進行了Pearson相關性分析和Mantel檢驗。用顏色梯度表示品質指標的兩兩比較，藍色表示正相關，紅色表示負相關，顏色越深，相關性越強。此外，連接感官特征與品質指標的線顏色和寬度分別代表統計學顯著性和Mantel檢驗的r統計量[45]。Mantel檢驗結果表明，氣味與n-3多不飽和脂肪酸、n-6多不飽和脂肪酸、pH值、TVB-N值和鮮味氨基酸之間存在明顯的相關性（0.2＜r＜0.4或者r≥0.4，P＜0.01）。戊糖片球菌發酵過程中產生的活性酶對蛋白質和脂類物質進行水解，產生氨基酸、多肽、脂肪酸等風味前體物質，最終通過微生物碳水化合物代謝和非酶褐變反應形成其特有風味[40,46]。此外，發酵產酸不僅使魚糜具有獨特的乳酸風味，同時可以掩蓋或抑制魚腥味。發酵過程中pH值與氣味和色澤指標均具有明顯的相關性（Mantel’sr≥0.4，P＜0.01）。Pearson相關性分析表明L*與a*、b*呈負相關關系，接種發酵雖然促進了L*值的進一步提高，但是與L*相比，a*、b*與色澤和總體接受度具有更顯著的相關性（Mantel’sr≥0.4，P＜0.01）。硬度與附著性、彈性、內聚性具有正相關關系，然而與硬度指標相比，附著性、彈性、內聚性與總體接受度具有更加顯著的相關性（Mantel’sr≥0.4，P＜0.01）。綜上所述，戊糖片球菌發酵魚糜的理化性質與感官特征中的色澤、氣味和總體接受度存在顯著統計學相關性，接種發酵對魚糜的感官品質有重要影響。

圖6 魚糜發酵過程中的感官評分變化Fig.6 Changes in sensory scores of surimi samples during fermentation

圖7 感官特性與品質指標之間的Pearson相關性分析和Mantel檢驗Fig.7 Pearson correlation analysis and Mantel tests between organoleptic characteristics and quality indicators

3 結論

將戊糖片球菌接種到烏鱧魚糜中，探究在35 ℃發酵時其對魚糜品質特性的影響。接種發酵組的pH值顯著下降，在總酸含量增加的同時，抑制了TVB-N的形成，進而提升了魚糜的新鮮度。發酵可以提升魚糜的亮度，Pearson相關性分析和Mantel檢驗表明感官指標中的色澤和總體接受度評分在接種發酵后的提高與a*和b*具有明顯的相關性。接種發酵并未對組織狀態評分產生顯著影響，Mantel檢驗同樣表明組織狀態與品質指標均無顯著相關性。戊糖片球菌發酵過程中對蛋白質進一步水解，提高了魚糜蛋白質的營養價值。接種發酵提高了多不飽和脂肪酸含量，這對于風味的形成和氣味指標評分的提高起到了促進作用。本研究可以為發酵烏鱧產品的開發和品質改善提供理論參考。