基于宏基因組技術分析自然發酵羊肉香腸中微生物多樣性及揮發性風味功能基因

牛 茵，吳雙慧，何濟坤，蔡自建，尤天棋，陳 娟

（西南民族大學食品科學與技術學院，四川 成都 610041）

自改革開放后，我國的羊肉產業得到了快速發展，羊肉產量大幅提高且長期穩居世界第一[1]。雖然我國肉羊產業具有較好的發展潛力，但也存在一些問題，例如對羊肉及其產品的深加工研究不夠，致使羊肉產品初級化、質量不高、品種單一等[2]。因此，羊肉的加工方式也應從傳統烹飪轉向腌制、鹵制、干制、香腸以及方便肉品等深加工方式。國內對于羊肉香腸的研究多集中于不同加工工藝、添加劑對香腸理化性質與風味的影響[3-4]，以及微生物多樣性與風味物質的關聯分析[5-6]，對于羊肉香腸發酵過程中風味形成的代謝通路與注釋到的微生物研究較少。目前，通過16S rRNA測序技術對微生物多樣性只能確定到屬水平，無法精確到種水平，且無法得到具體的代謝通路，對于風味形成與微生物關聯分析具有一定的局限性。宏基因組直接從環境樣品中提取全部微生物的DNA，制備成基因文庫后通過Illumina、Roche 454、PacBio、Oxford Nanopore等平臺進行測序[7-8]。與傳統的16S rRNA測序技術相比，宏基因組技術可準確將樣品中的微生物鑒定至種水平，并將研究深入至基因和功能層面[9]，從而對樣品中微生物菌群結構進行分析，挖掘出關鍵的功能基因。目前，宏基因組技術已廣泛用于各種發酵食品中，夏亞男等[10]發現了酸馬奶中26 個芳香族氨基酸轉氨酶編碼基因、40 個酮酸轉化酶編碼基因、51 個醇脫氫酶編碼基因、68 個醛脫氫酶編碼基因和34 個乙酰酯酶編碼基因。冼芳瑩等[11]對不同發酵時間的豆豉進行研究，結果表明代謝活動在發酵階段時最旺盛，相關基因占比超過50%，其中糖苷水解酶和糖苷轉移酶基因豐度最高。

宏基因組學技術在發酵香腸揮發性風味物質代謝方面的研究多集中于催化酶與風味物質的關聯分析，缺乏對于代謝途徑中編碼酶的功能基因與其注釋微生物分析。Ferrocino[12]與Franciosa[13]等利用宏基因組技術對意大利香腸中揮發性風味物質含量與其代謝途徑中催化酶編碼基因豐度的變化進行分析，發現兩者的變化具有一致性，即物質代謝相關酶的變化與代謝產物的含量變化具有一致的趨勢。Yang Peng等[14]對福沃特香腸進行研究，通過宏基因組技術與代謝組學技術關聯分析發現，木糖葡萄球菌、戊糖片球菌與半胱氨酸、蛋氨酸、脂肪酸等代謝途徑具有高度相關性。國內目前已有宏基因組技術應用于香腸中生物胺形成的研究[15-16]，但缺乏對于香腸揮發性風味物質代謝的分析，僅有劉英麗等[17]采用宏基因組技術對接種不同乳酸菌的薩拉米香腸進行研究，結果表明乳酸菌YL-1主要參與的是碳水化合物代謝途徑，同時也參與了3-甲基丁酸和苯丙氨酸代謝途徑。

目前，已有發酵香腸中微生物多樣性與揮發性風味形成的關聯分析，但是缺乏對于發酵過程中微生物種水平的變化與代謝通路的研究，對于功能基因與注釋到的微生物也研究較少。因此，本研究以自然發酵羊肉香腸不同發酵時間點的樣品作為實驗對象，采用宏基因組技術結合直系同源蛋白分組比對（Evolutionary Genealogy of Genes: Non-supervised Orthologous Groups，eggNOG）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）和碳水化合物活性酶（Carbohydrate-Active Enzymes，CAZy）數據庫對基因和酶的豐度與功能進行注釋，探究揮發性風味物質代謝通路與微生物和酶的關系，旨在為自然發酵羊肉香腸中風味物質代謝通路的揭示與風味功能基因的挖掘提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊肉 四川天地羊生物工程有限責任公司；豬腸衣成都市當地市場。

白砂糖、食鹽（均為食品級）均為市售；亞硝酸鈉（食品級）四川金山制藥有限公司；抗壞血酸（食品級）盛達食品添加劑有限公司；硝酸鈉、葡萄糖（均為分析純）成都科隆化學品有限公司；DNA提取試劑盒（QIAamp?Fast DNA Stool Mini Kit）德國Qiagen公司；TruSeq Nano DNA LT Sample Prepararion Kit 試劑盒美國Illumina 公司；AgencourtAMPure XP（A63881）美國Beckman Coulter公司；KAPA Library Quantification Kits（KK4824）美國Kapa Biosystems公司。

1.2 儀器與設備

NanoDrop 2000分光光度計 美國Thermo公司；XHF-D 高速分散器 寧波新芝生物有限公司；5409HJ507060冷凍離心機、Centrifuge 5418R臺式離心機 德國Eppendorf公司；MyCycler聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；Covaris S220超聲打斷儀 香港Gene有限公司；LC 480定量PCR儀 瑞士Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 羊肉發酵香腸的制備與取樣

根據吳雙慧等[16]的方法，取羊肉按照肥瘦質量比4∶1攪成肉餡，每1 000 g羊肉中加入食鹽25 g、蔗糖和葡萄糖各5 g、硝酸鈉和亞硝酸鈉各70 mg、抗壞血酸500 mg，充分攪拌后在0～4 ℃條件下腌制24 h。將腌制好的肉餡灌入清洗好的腸衣中，晾曬于室外，自然發酵26 d。

在相同條件下分別發酵3 批羊肉香腸，在發酵0、5、14 d和26 d每批次各取1 份樣品，每個時間點共3 份樣品，貯藏于－80 ℃用于宏基因組技術分析，由于操作失誤，第14天丟失1 份樣品。

1.3.2 宏基因組技術分析

采用DNA提取試劑盒對樣品中微生物總DNA進行提取，并對提取DNA濃度與完整性進行分析。采用橋式PCR對DNA樣品進行擴增并用TruSeq Nano DNA LT Sample Prepararion Kit試劑盒進行文庫的構建。采用Illumina NovaSeq 6000測序平臺對文庫進行測序，用Trimmomatic和bowtie2軟件對其進行拆分、質量剪切、去除宿主污染等操作。使用MEGAHIT軟件進行宏基因組的拼接，使用prodigal軟件對拼接后的scaffold進行開放閱讀框預測，并將其翻譯為氨基酸序列。使用CDHIT與bowtie2軟件對所有樣本中預測出的基因進行非冗余基因集的構建，并統計基因在對應樣本中的豐度信息。最后使用DIAMOND、hmmscan軟件對基因集代表序列與KEGG、CAZy等數據庫進行比對注釋。同時得到各樣本中物種的相對豐度，接著進行樣本相似性聚類、排序檢驗以及差異統計比較等分析，使用R軟件完成統計分析和作圖。每個樣品的有效數據量分布在15.48～18.53 G。建庫測序及數據分析由上海歐易生物醫學科技有限公司完成。

1.4 數據統計分析

采用WPS Office軟件對揮發性風味物質的微生物代謝途徑進行分析繪圖，采用Origin 2022軟件對各組樣品CAZy數據庫注釋結果與代謝相關酶豐度結果進行分析作圖，利用R語言4.0對eggNOG與KEGG代謝通路進行分析作圖，采用SPSS Statistics 22軟件對酶豐度結果進行算術平均處理。

2 結果與分析

2.1 不同發酵時間羊肉香腸中微生物的菌群結構

宏基因組測序和去除低質量數據后，樣本中共得到67 377 條序列。對所得序列進行物種注釋，共鑒定出43 個門、60 個綱、112 個目、201 個科、465 個屬和2 156 個種的微生物。選取種水平上相對豐度前30的微生物繪制柱狀圖。

由圖1可以看出，第0天樣品中相對豐度前5的微生物為流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae，20.39%）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，18.75%）、酒類酒球菌（Oenococcus oeni，10.02%）、單核細胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes，5.24%）和斯氏弓形菌（Arcobacter trophiarum，5.19%）；第5天樣品中優勢菌屬為金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌、Vibriosp.SM1977、酒類酒球菌與Vibrio rumoiensis，相對豐度分別為16.53%、13.86%、9.68%、6.50%和3.79%；在第14天樣品中相對豐度前5的微生物有3 種是葡萄球菌，分別為腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus，16.52%）、馬胃葡萄球菌（Staphylococcus equorum，10.53%）與金黃色葡萄球菌（10.71%），其他兩種優勢菌為流感嗜血桿菌（11.73%）與酒類酒球菌（6.03%）；至第26天時，樣品中優勢菌屬又變為流感嗜血桿菌（18.62%）、金黃色葡萄球菌（16.11%）、酒類酒球菌（8.89%）、單核細胞性李斯特菌（4.70%）和斯氏弓形菌（4.65%）。

從發酵過程的菌相變化可以看出，流感嗜血桿菌經歷了從相對豐度20.39%下降至11.73%然后回升至18.62%的變化過程，可以看出其降低趨勢是由腐生葡萄球菌和馬胃葡萄球菌相對豐度的明顯上升引起。由此推測腐生葡萄球菌和馬胃葡萄球菌等凝固酶陰性葡萄球菌是四川羊肉香腸在自然發酵過程中外界環境賦予的微生物，在發酵14 d成為優勢菌群，但是凝固酶陰性葡萄球菌的競爭優勢無法保持，后期被流感嗜血桿菌、單核細胞性李斯特菌和斯氏弓形菌超過。金黃色葡萄球菌在第14天相對豐度降至最低后回升至16.11%，與流感嗜血桿菌的變化趨勢一致，推測原因是金黃色葡萄球菌與流感嗜血桿菌的“衛星現象”。酒類酒球菌在整個發酵過程中相對豐度比較穩定，保持在前5范圍內，是自然發酵羊肉香腸中競爭能力較強的內在微生物。單核細胞性李斯特菌和斯氏弓形菌在發酵第0天和第26天的相對豐度分別位居第4位和第5位，發酵過程中（第5天和第14天）它們的相對豐度下降，沒有進入前5范圍內。隨著發酵進行，弧菌的相對豐度不斷下降，發酵14 d后不在相對豐度前5范圍內。

由上述結果可以看出，在四川香腸傳統的自然發酵過程中菌群結構較為復雜，沒有特別優勢（相對豐度超過25%）的菌屬，在相對豐度前5的優勢菌屬中葡萄球菌、酒類酒球菌起著重要作用，眾多研究表明葡萄球菌屬是發酵肉制品中的常見優勢菌，更是決定肉制品風味的優勢微生物[18-19]，而酒類酒球菌目前主要應用于酒類的發酵[20]，暫未應用于香腸發酵中，可作為香腸潛在發酵劑進行研究。此外，發酵過程中存在有流感嗜血桿菌、單核細胞性李斯特菌、斯氏弓形菌和弧菌等致病菌，在第0天就具有較高的相對豐度，推測原因可能來源于原料肉。傳統自然發酵香腸中未添加發酵劑乳酸菌和凝固酶陰性葡萄球菌，對致病菌的抑制效果較差，安全性存在一定的問題，使用發酵劑是提高發酵肉制品安全性的重要手段。

2.2 數據庫注釋分析

2.2.1 eggNOG分析

由圖2可以看出，利用eggNOG數據庫注釋到11 份樣品中共計36 935 個基因，4 個階段樣品分別注釋到14 688、29 007、24 956 個和24 223 個基因，去除功能未知的R和S兩部分后，被注釋到最多的與代謝相關的3 個功能單元為氨基酸轉運和代謝（4 個階段樣品注釋基因數量和占比分別為1259 個，8.57%；2 538 個，8.75%；2313 個，9.27%；2209 個，9.12%）、碳水化合物轉運和代謝（869 個，5.92%；1 854 個，6.39%；1 725 個，6.91%；1 718 個，7.09%）與無機離子轉運和代謝（983 個，6.65%；1 840 個，6.34%；1 621 個，6.50%；1 579 個，6.52%）。可以看出，發酵5 d樣品不論是注釋基因總數還是功能單元基因數都是最多的，但是從占比來看發酵14 d樣品氨基酸轉運和代謝功能單元最高，發酵26 d樣品碳水化合物轉運和代謝功能單元最高。

圖2 不同發酵時間羊肉香腸eggNOG代謝通路統計Fig.2 Statistics of eggNOG metabolic pathways in fermented mutton sausage at different fermentation times

2.2.2 KEGG數據庫注釋分析

經KEGG數據庫注釋后，樣品中共有39 319 個基因。將4 個階段樣品中的8 205、15 925、14 157 個和13 566 個非冗余基因在KEGG數據庫中進行注釋，4 組樣品功能注釋基因主要歸屬為5大類代謝通路，主要功能基因二級代謝途徑均有33 類。由圖3可知，4 個階段樣品中代謝相關基因數量分別為4 890、10 047、8 944 個和8 625 個，注釋最多的6 條代謝通路包括碳水化合物代謝（4 個階段樣品注釋基因數量分別為1 044、2 126、1 884、1 861 個）、氨基酸代謝（931、1 839、1 664、1 598 個）、能量代謝（710、1 598、1 192、1 126 個）、輔酶因子與維生素代謝（619、1 232、1 111、1 071 個）、核苷酸代謝（535、1 124、1 005、970 個）與脂肪酸代謝（279、622、566、527 個）。上述結果表明，發酵過程中碳水化合物代謝與氨基酸代謝是被注釋到最多的兩條代謝途徑，是風味物質形成的重要途徑，發酵至5 d這兩條代謝途徑注釋到的基因數量最多。

圖3 羊肉香腸基因的KEGG代謝通路統計Fig.3 Statistics of KEGG metabolic pathways of genes in fermented mutton sausage

2.2.3 CAZy數據庫注釋分析

香腸基因序列與CAZy數據庫進行比對后，在樣品中共鑒定出901 個碳水化合物酶。將4 組樣品香腸基因序列與CAZy數據庫進行比對，結果如圖4所示。發酵0 d樣品中共注釋到基因357 個，糖苷水解酶與糖基轉移酶編碼基因數量最多，都是123 個，碳水化合物酯酶編碼基因最少，只有22 個；發酵5 d樣品檢出了755 個相關基因，糖基轉移酶編碼基因數量最多（311 個），輔助氧化還原酶編碼基因數量最少（28 個）；發酵14 d與26 d樣品分別注釋到562 個與586 個基因，發酵14 d樣品中糖基轉移酶編碼基因數量最多（216 個），糖苷水解酶編碼基因（219 個）是發酵26 d樣品中注釋最多的基因。可以看出糖苷水解酶與糖基轉移酶是發酵過程中與碳水化合物相關的主要酶，且發酵5 d樣品注釋到的基因數最多。

圖4 羊肉香腸基因的CAZy代謝通路統計Fig.4 Statistics of CAZy metabolic pathways of genes in fermented mutton sausage

2.3 羊肉香腸揮發性風味代謝途徑基因分析

風味是決定發酵香腸品質的指標之一，參照文獻[21-23]繪制發酵香腸的揮發性風味物質微生物代謝途徑，并將本研究中自然發酵羊肉香腸注釋到的氨基酸非氧化脫羧代謝途徑、脂肪酸β-氧化途徑與葡萄糖分解代謝途徑所需酶以及相應的微生物標注如圖5所示。發酵香腸最終風味是發酵和成熟過程中化學反應和微生物代謝反應共同作用的結果。香腸中的微生物可以利用碳水化合物、脂質、蛋白質及其他營養物質水解產生單糖、游離脂肪酸和游離氨基酸等風味前體物質，并進一步在微生物和酶的協同作用下代謝產生醛類、酮類、醇類、酯類等對風味具有貢獻作用的揮發性風味物質[24]。

圖5 發酵羊肉香腸揮發性風味物質微生物代謝途徑Fig.5 Microbial metabolic pathways of volatile flavors substances in fermented mutton sausage

2.3.1 氨基酸代謝分析

氨基酸代謝過程需要先經過轉氨酶的作用形成相對應的α-酮酸，再經過氧化或非氧化脫羧途徑形成相應的醛、醇、酸與酯類等重要的風味物質。大量研究表明支鏈氨基酸轉氨酶是支鏈氨基酸代謝形成風味物質支鏈醛、醇、酸途徑的關鍵酶[25-26]，同時也有部分研究認為谷氨酸脫氫酶也會影響支鏈氨基酸代謝途徑[27-28]。由表1可以看出，本實驗樣品中編碼支鏈氨基酸轉氨酶（EC 2.6.1.42）的ilvE基因簇共有15 個，注釋到的微生物為葡萄球菌屬、明串珠菌屬、假單胞菌屬與嗜冷桿菌屬，編碼芳香族氨基酸轉氨酶（EC 2.6.1.57）的tyrB基因有6 個，由嗜冷桿菌屬、發光桿菌屬與弧菌屬產生，未在樣品中檢出甲硫氨酸轉氨酶基因。共有34 個基因編碼了谷氨酸脫氫酶（EC 1.4.1.2、EC 1.4.1.3、EC 1.4.1.4），注釋到微生物為葡萄球菌屬、弧菌屬、嗜冷桿菌屬、假交替單胞菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬與海單胞菌屬。

表1 羊肉香腸基因組中氨基酸代謝主要相關基因和酶Table 1 Amino acid metabolism-related enzymes and genes in the genome of fermented mutton sausage

氨基酸經轉氨反應后形成的α-酮酸可經酮酸轉化酶催化形成相應的醛、醇、酸。酮酸轉化可分為氧化與非氧化脫羧兩種途徑，α-酮酸經α-酮酸脫羧酶可直接形成支鏈醛被稱為非氧化脫羧途徑[29]，在本實驗樣品中未發現編碼α-酮酸脫羧酶的基因。氧化脫羧途徑指α-酮酸經α-酮酸脫氫酶復合體、乙酸激酶與磷酸乙酰轉移酶共同作用催化形成支鏈酸，再經醛脫氫酶與醇脫氫酶氧化形成醛與醇[30]，本實驗樣品中共有14 個基因編碼了α-酮酸脫氫酶，脫氫酶E1和E2復合體共同注釋到的微生物為葡萄球菌屬，乙酸激酶編碼基因12 個，由葡萄球菌屬、明串珠菌屬、嗜冷桿菌屬等產生，磷酸乙酰轉移酶基因17 個，注釋微生物有葡萄球菌屬、明串珠菌屬和假單胞菌屬等。樣品中共有41 個乙醇脫氫酶編碼基因，28 個醛脫氫酶基因，主要是由葡萄球菌屬、乳酸桿菌屬、明串珠菌屬、假單胞菌屬、嗜冷桿菌屬等產生。

由圖6可以看出，樣品發酵至14 d氨基酸代謝相關酶豐度最高，乙醇脫氫酶（EC 1.1.1.1）與醛脫氫酶（NAD＋）（EC 1.2.1.3）是所有酶中豐度最高的，谷氨酸脫氫酶（NAD（P）＋）（EC 1.4.1.3）僅在發酵0 d與5 d組有微量注釋（豐度小于0.001），NAD依賴性醛脫氫酶（EC 1.2.1.54）僅在發酵0 d有注釋。

圖6 氨基酸代謝相關酶豐度Fig.6 Abundance of enzymes associated with amino acid metabolism

2.3.2 脂肪酸代謝分析

脂肪的自動氧化反應常被認為是發酵香腸中最重要的化學反應，特別是多不飽和脂肪酸的氧化反應。脂肪經自動氧化產生大量的氫過氧化物，氫過氧化物會進一步分解為風味前體物質[31]。除自氧化外，不飽和脂肪酸可經β-氧化途徑產生4或5-羥基酸再環化形成內酯類化合物，游離的飽和脂肪酸可經不完全β-氧化途徑生成β-酮酸，后經脫羧形成少1 個碳原子的甲基酮。不完全β-氧化是指在原有β-氧化途徑的基礎上，中間產物β-酮脂酰-CoA不經硫解酶降解形成少2 個碳原子的脂肪酸與乙酰-CoA，而是在硫酯酶的作用下降解為β-酮酸再經脫羧形成甲基酮[32-33]。

由表2可以看出，本實驗樣品中參與脂肪酸β-氧化的微生物有葡萄球菌屬、不動桿菌屬、嗜冷桿菌屬、假單胞菌屬等，編碼硫酯酶基因的微生物為葡萄球菌、明串珠菌屬、嗜冷桿菌屬與弧菌屬等，未見編碼環化酶的基因與微生物。脂肪酸代謝所需酶編碼基因共92 個，其中不完全β-氧化所需硫酯酶編碼基因共39 個。

由圖7可以看出，除酰基-CoA脫氫酶（EC 1.3.99.-）與硫酯酶I（EC 3.1.1.5）外，其余與脂肪酸代謝相關酶的豐度均在發酵至14 d達到最大值，羥脂酰-CoA脫氫酶（EC 1.1.1.35）與硫酯酶（EC 3.1.2.-）是豐度最高的兩種酶，乙酰-CoA氧化酶（EC 1.3.3.6）僅在發酵5 d中有檢出，豐度為0.001 34，烯脂酰-CoA水合酶（EC 4.2.1.17）僅在發酵0 d與26 d中有檢出，且豐度均低于0.001 3。

圖7 脂肪酸代謝相關酶豐度Fig.7 Abundance of enzymes associated with fatty acid metabolism

2.3.3 碳水化合物代謝分析

香腸發酵過程中，微生物可以代謝碳水化合物形成有機酸，例如乳酸、乙酸等，是影響香腸風味的重要物質。同時，碳水化合物發酵也會生成一些其他的重要風味物質如雙乙酰、乙偶姻等[34]。葡萄糖經糖酵解后形成丙酮酸，丙酮酸是碳水化合物分解代謝的中間產物，也是風味前體物質。其能經丙酮酸甲酸裂解酶或是丙酮酸脫氫酶復合體催化生成甲酸與乙酰-CoA。乙酰-CoA可直接進入三羧酸循環，也可經磷酸酰基轉移酶與乙酸激酶代謝形成乙酸，或是在α-乙酰乳酸合成酶的作用下形成雙乙酰、α-乙酰乳酸[35-36]。由表3可以看出，本實驗樣品中碳水化合物代謝途徑共有217 個編碼基因，其中138 個編碼脫氫酶的基因主要由葡萄球菌屬、明串珠菌屬、弧菌屬等微生物產生；編碼乙酰乳酸合酶的基因共42 個，主要注釋微生物為葡萄球菌屬、明串珠菌屬、弧菌屬等；檢出8 個乙酰脫羧酶基因，對應葡萄球菌屬、明串珠菌屬、發光桿菌屬3 種微生物；磷酸乙酰轉移酶與乙酸激酶同時也參與了氨基酸代謝，與氨基酸代謝的結果相印證，樣品中未見乙偶姻還原酶的編碼基因。

表3 羊肉香腸基因組中碳水化合物代謝主要相關基因和酶Table 3 Carbohydrate metabolism-related enzymes and genes in the genome of fermented mutton sausage

由圖8可以看出，樣品發酵至14 d碳水化合物代謝相關酶的豐度達到最大值，丙酮酸脫氫酶E1復合體（EC 1.2.4.1）與乙醇脫氫酶（EC 1.1.1.1）是豐度最高的兩種酶，NAD依賴性醛脫氫酶（EC 1.2.1.54）僅在發酵0 d中有注釋，豐度為0.001 31。

圖8 碳水化合物代謝相關酶豐度Fig.8 Abundance of enzymes associated with carbohydrate metabolism

3 結論

本研究結果表明自然發酵羊肉香腸中微生物多樣性豐富，流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、酒類酒球菌是發酵過程中的優勢菌種，發酵至14 d時腐生葡萄球菌與馬胃葡萄球菌的豐度升至最大值，達到27.05%。通過與eggNOG、KEGG、CAZy 3 個數據庫進行比對，樣品中注釋到的基因數分別為36 935、39 319、901 個，發酵至5 d樣品被注釋到的基因數最多，碳水化合物代謝和氨基酸代謝是eggNOG和KEGG數據庫中注釋最多的代謝途徑，糖苷水解酶與糖基轉移酶是CAZy數據庫中注釋最多的碳水化合物酶。通過對KEGG代謝通路的分析，發現共有167 個編碼基因參與氨基酸代謝，其中關鍵的支鏈氨基酸轉氨酶、芳香族氨基酸轉氨酶、谷氨酸脫氫酶與α-酮酸脫氫酶復合體分別被15、6、34、14 個基因所編碼，注釋到的微生物主要為葡萄球菌、假單胞菌、嗜冷桿菌與弧菌等；脂肪酸代謝所需酶編碼基因共有92 個，注釋到的微生物為葡萄球菌、不動桿菌與嗜冷桿菌，不完全β-氧化所需硫酯酶共有39 個編碼基因，主要由葡萄球菌與明串珠菌產生；碳水化合物代謝途徑共有217 個編碼基因，注釋微生物為葡萄球菌、明串珠菌、弧菌、嗜冷桿菌等。3 條風味代謝途徑中大部分酶的豐度在發酵至14 d達到最大值，與發酵過程中注釋微生物腐生葡萄球菌和馬胃葡萄球菌的相對豐度在14 d達到最大值的趨勢相同，在一定程度上證實了發酵過程中凝固酶陰性葡萄球菌對發酵香腸風味形成的重要作用。本研究揭示了羊肉香腸發酵過程中微生物的多樣性、風味物質代謝途徑及關聯的酶以及注釋微生物的關系，明確了自然發酵羊肉香腸中揮發性風味物質形成的途徑，挖掘了代謝過程中的關鍵酶與功能基因，對于解析羊肉香腸中微生物的動態變化以及揮發性風味物質的形成具有一定的參考價值。