基于網絡藥理學探討茵黃解毒湯治療HBV相關肝衰竭的活性成分及其作用機制*

曾勝瀾，王 娜，張榮臻，王挺帥，吳 聰，毛德文△

1 廣西中醫藥大學第一附屬醫院，廣西 南寧 530023；2 湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410000；3 廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530023；

肝衰竭是由多種因素引起的嚴重肝臟損害，導致肝臟合成、解毒、代謝和生物轉化功能嚴重障礙或失代償，出現以黃疸、凝血功能障礙、肝腎綜合征、肝性腦病、腹水等為主要表現的一組臨床證候群，具有發病急、病情重、傳變快、病死率高等特點［1］。在我國，HBV 感染者高達7000 萬，HBV 是引起肝衰竭的主要病因［2］。目前，如何有效促進肝再生、拮抗肝細胞壞死、抑制HBV 復制、提高機體免疫、減輕內毒素血癥、抗感染等是肝衰竭防治的重點。

茵黃解毒湯是由茵陳蒿湯聯合黃連解毒湯組成，方中重用茵陳為君藥，苦瀉下降，善于清熱利濕，為黃疸之要藥；臣以黃芩瀉肺火于上焦，黃連瀉脾火于中焦，黃柏瀉腎火于下焦，梔子通利三焦，助茵陳引濕熱從小便而去；佐以大黃瀉熱逐瘀，通利大便，導瘀熱從大便而下，共奏清熱利濕、瀉火解毒之功。研究證實，茵陳蒿湯合黃連解毒湯具有護肝、抗HBV、降低內毒素、減輕促炎因子等作用［3-5］。

鑒于肝衰竭的機制復雜，單一的治療手段無法奏效，而中醫藥復方具有“多成分-多靶點-多途徑”的特性，遵從“君、臣、佐、使”的配伍原則。因此，支持及開展中藥復方防治肝衰竭的研究顯得尤為重要。微陣列等基因表達分析的高通量平臺是推斷生物相關性的重要工具，特別是在構建信息系統過程中的復雜網絡。目前，尚無對茵黃解毒湯治療HBV-LF的全基因組學研究。在本研究中，我們從基因表達總集（gene expression omnibus，GEO）得到了有文獻記載的原始數據，從中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP）得到了茵黃解毒湯的有效化合物及其相關靶點，進行生物功能注釋、PPI網絡、GO和KEGG等相關分析。利用生物信息學方法，可以對HBV 相關肝衰竭的作用機制進行進一步的研究，為中藥復方茵黃解毒湯的臨床應用和藥物靶點的發現提供潛在的生物學標志物。

1 資料與方法

1.1 基因芯片數據篩選運用GEO 數據庫，搜索關鍵詞“liver failure”“hepatic failure”“hepatitis B virus”或“HBV”，設置條件Homo sapiens、series、Expression profiling by array，得到符合條件的基因表達譜GSE38941和GSE62029。

1.2 DEGs 分析將上述兩組數據均分為正常組和HBV-LF 組，利用perl 合并兩組數據，R 語言中sva 進行批次矯正（batch normalization），limma用于識別兩個數據集中的差異基因（differentially expressed genes ，DEGs），閾值設為|log2FC|＞1，adjustPvalue＜0.05。R 包pheatmap繪制兩個數據的DEGs熱圖。

1.3 中藥靶點預測茵黃解毒湯共包含6 味中藥：茵陳、梔子、大黃、黃芩、黃連、黃柏。利用TCMSP 數據庫（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）搜索6 味中藥各自的有效化合物及其相關靶點，設置條件口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18。

1.4 疾病-中藥復方靶基因運用Venny 2.1.0（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）將從GEO獲取的HBV-LF靶點與中藥相關靶點進行交集對比，最終獲得茵陳蒿湯聯合黃連解毒湯治療HBV-LF的潛在作用靶點。

1.5 構建茵黃解毒湯治療HBV-LF 的調控網絡運用Cytoscape 構建茵陳蒿湯聯合黃連解毒湯治療HBV-LF 的調控網絡，插件Bisogenet 構建蛋白互作網絡（protein-protein interaction network，PPI），CytoNCA進行網絡拓撲學分析。Biso-Genet 是一個新的用于基因網絡構建、可視化和分析的插件，其特點是可以包含編碼關系來區分基因及其產物，存儲相互作用、分子絡合物和路徑的完整描述，以搜索所有已知的相互作用［6］。CytoNCA 是一種綜合計算、評價和可視化分析的多中心性插件，計算了PPI 網絡的拓撲結構和關系特征，包括：中間性中心性（betweenness centrality，BC）、度中心性（degree centrality，DC）等，適當的最小閾值由網絡節點和邊緣分布決定［7］。

1.6 GO 富集分析及KEGG 信號通路富集分析利用David 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）上傳潛在靶蛋白，進行GO 的生物學過程（biological process，BP）、細胞組成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）功能富集分析；同時利用KEGG 信號通路分析，綜合預測茵黃解毒湯治療HBV-LF 關鍵靶點的生物學特性及調控通路。

2 結果

2.1 DEGs分析GSE38941數據集包括27個樣本（正常樣本10 例，HBV-ALF 樣本17 例），GSE62029數據集包括23 個樣本（正常樣本10 例，HBV-ALF樣本13 例）。共得出差異基因2160 個，其中上調基因1172個、下調基因988個。見圖1—2。

圖1 HBV-ALF的DEGs火山圖

圖2 HBV-ALF的DEGs熱圖

2.2 中藥復方靶點茵黃連解毒湯包含6 味中藥，經過數據庫檢索及篩選，共得到化合物109個，包括beta-sitosterol、Genkwanin、Skrofulein、Isoarcapillin、Eupalitin、capillarisin、Demethoxycapillarisin、kaempferol、Stigmasterol、rhein 等，涉及相關靶點255 個，其中包含ESR1、CDK2、VEGF2、BAX、IL-6、JUN、IL-2、CXCL2 等。

2.3 疾病-中藥復方靶基因及相關網絡構建根據“2.1”項和“2.2”項所得結果，將GEO 數據庫中篩選出的DEGs 與茵黃連解毒湯的相關靶點進行對比分析，共得到31 個靶基因，涉及66 個小分子化合物，包括Quercetin、Kaempferol、Isocorypalmine、（S）-Canadine、baicalein、beta-sitosterol、（R）-Canadine、Cavidine、Stigmasterol、wogonin、（2R）-7-hydroxy-5-methoxy-2-phenylchroman-4-one、Berlambine、Fumarine、oroxylin a、acacetin、Dehydrotanshinone Ⅱ A、aloeemodin、crocetin、isorhamnetin、berberine、Genkwanin 等。利用Cytoscape 構建茵黃連解毒湯治療HBV-LF的調控網絡。見圖3。

圖3 茵黃解毒湯治療HBV-ALF的調控網絡（節點大小按Degree排列）

2.4 PPI 網絡及拓撲學分析運用Cytoscape 中插件Bisogenet 構建PPI 網絡，將“2.3”項中得到的31 個靶基因輸入Bisogenet，設置條件：Homo sapiens，protein protein interaction，數據來源為DIP、BIOGRID、HPRD、INTACT、MINT、BIND，最后得到相互作用的1927 個互作基因。運用CytoNCA進行網絡拓撲學分析，設置DC＞60，BC＞600，最后得到55個關鍵靶基因。見圖4—5，表1。

表1 網絡拓撲學分析

圖4 PPI蛋白互作網絡圖

圖5 CytoNCA網絡拓撲學分析

2.5 GO 和KEGG 富集分析利用David 數據庫對55個關鍵靶基因進行GO分析，共涉及細胞組分構成或來源（cellular component organization or biogenesis）、對刺激的反應（response to stimulus）、免疫過程（immune system process）、正/負調節的生物過程（positive/negative regulation of biological process）、細胞死亡（cell killing）、細胞增殖（cell proliferation）等24 個生物學過程（biological process，BP）；催化活性（catalytic activity）、結合（binding）、轉錄調節（transcription regulator activity）等10 種分子功能（molecular function，MF）；細胞（cell）、胞外區（extracellular region）、細胞器（organelle）等16 個細胞組分（cellular component，CC）。見圖6。

圖6 GO富集分析

圖7 KEGG富集分析（前20）

通過KEGG分析，共得到175條信號通路，見圖7（top 20），去除與HBV-LF 無關的信號通路，并且靶基因富集數＞3，共篩選出27 條信號通路，包括PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway、Cell cycle、Hepatitis B、Apoptosis、Cellular senescence、FoxO signaling pathway、Ras signaling pathway、IL-17 signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway、Wnt signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway等信號通路等。見表2

表2 KEGG信號通路分析

3 討論

全基因組分析（genome-wide analysis，GWAS）是一項系統的、有力的、公正的研究，探討了常見序列及其變異與疾病易感性之間的關系［8］。鑒于目前肝衰竭的發病機制尚未完全明確，GWAS 在揭示肝衰竭的病機方面發揮著重要的作用。網絡藥理學將現有的“一靶一藥”的研究范式更新為新的“網絡靶點-多組分”的研究范式，分析生物網絡中的化合物、靶點和疾病之間的關系［9］。利用GWAS并與中醫藥、疾病相聯系構建中醫藥網絡藥理學調控網絡，將從系統角度和分子水平上進一步揭示“藥物-基因-疾病”共模塊關聯，篩選中藥復方中的協同多化合物，解釋中藥方劑的組合規律、網絡調節效應及疾病防治的相關機制。

茵黃解毒湯由6 味中藥構成，涉及的小分子化合物及其藥物靶點眾多，通過GEO數據庫、TCMSP數據庫及一系列比對分析，最終篩選得到的小分子化合物及其作用靶點可能是茵黃解毒湯拮抗HBV-LF的關鍵物質基礎。研究發現，槲皮素（quercetin）可通過降低肝臟丙二醛（malondialdehyde，MDA）、增強超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的活性、提高B細胞淋巴瘤因子2（B cell leukemia 2，Bcl-2）的表達、減弱Bcl-2相關x蛋白（Bcl-2 associated x protein，Bax）的表達，從而起到保護肝臟的作用［10］。研究證實，槲皮素能顯著降低HBsAg/HBeAg 分泌和HBV-DNA 水平，這可能與熱休克蛋白水平和病毒轉錄水平的下降有關［11］。除此之外，槲皮素還有抗氧化、清除自由基、抗炎、提高機體免疫等作用［10，12］。研究發現，山柰酚（kaempferol）可通過抑制肝細胞凋亡，降低D- 氨基半乳糖（D-galactosamine，D-GalN）/內毒素（lipopolysaccharide，LPS），從而誘導ALF 小鼠的死亡率［13］。黃芩素（baicalein）可抑制D-Galn/LPS 誘導的ALF 大鼠細胞凋亡，其機制可能與減輕炎癥損傷、調節MAPK 與NF-κB 信號通路有關［14-15］。蘆薈大黃素（aloe-emodin）具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、改善肝臟脂質過氧化等作用，可干預肝纖維化、肝硬化、非酒精性脂肪肝、肝衰竭等疾病的進展［16-18］。黃連素可降低百草枯誘導的肝細胞損傷中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的形成和乳酸鹽脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）的釋放，抑制肝細胞中谷胱甘肽的消耗［19］。本研究顯示，槲皮素、山柰酚、黃芩素、蘆薈大黃素、黃連素、異鼠李素、大黃酸等作為重要的小分子化合物參與了茵黃解毒湯拮抗HBV-LF 的過程，說明本研究準確性較高。

通過Bisogenet和CytoNCA構建PPI網絡及進行拓撲學分析，最后得到茵黃解毒湯-HBV相關肝衰竭的關鍵節點55 個，包括TP53、NTRK1、HSP90AA1、ESR1、CUL3、MCM2、CDK2、HSP90AB1、YWHAZ、NPM1、EGFR、HSPA8、VCP、FN1、BRCA1、HSPA5、COPS5、EP300等，提示茵黃解毒湯可能通過優效小分子化合物與篩選出的關鍵靶點相互作用，從而對HBV 相關肝衰竭起到治療作用。TP53 是重要的抑癌基因，在誘導細胞周期阻滯、DNA 修復、衰老和凋亡方面發揮重要作用［20］；同時，也有研究發現TP53 可通過p53 途徑在肝衰竭的進展和恢復階段調節細胞凋亡［21］。研究發現，ESR1 是肝再生過程中膽紅素水平下降的重要介質，而CYP2A6 是膽紅素水平下降過程中雌激素信號的重要介質，ESR1-CYP2A6軸可能參與肝細胞的成熟和恢復，通過增加肝細胞數量和肝祖細胞成熟以促進肝再生［22］。ESR1甲基化可作為一個獨立的危險因素，對預測HBV相關肝衰竭28 天死亡率具有較高的價值［23］。Cul3和NPM1可調節細胞周期、促進細胞增殖及抑制細胞凋亡等［24-25］。Cul3介導的原代成纖維細胞周期蛋白E 降解途徑是調節細胞周期蛋白E 穩態的主要機制［24］。EGFR 及其相關信號通路對肝細胞的正常功能和肝再生都至關重要，EGF/EGFR 信號通路是人體被切除2/3 肝臟后最早被激活的信號通路之一［26］。

GO 富集分析提示BP 主要涉及細胞組分構成或來源、對刺激的反應、免疫過程、正/負調節的生物過程、細胞死亡、細胞增殖等。KEGG 通路分析提示PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、Cell cycle、Hepatitis B、自噬、FoxO 信號通路、Ras 信號通路、IL-17 信號通路、NOD 樣受體信號通路、HIF-1 信號通路、NF-κB 信號通路、Wnt 信號通路、Jak-STAT 信號通路等信號通路與本研究密切相關。PI3K-Akt 信號通路一直被認為是促進細胞增殖和防止細胞凋亡的重要途徑，磷酸化Akt 作用于下游靶點，參與調控細胞增殖和凋亡的蛋白表達［27］。研究發現，在Akt 基因敲除的小鼠中，由于肝細胞增殖能力受損，肝再生嚴重受損，死亡率增加［28］。MAPKs 信號通路是細胞抵抗損傷的重要途徑，它整合了包括生長、炎癥、代謝和凋亡等多種途徑［29］。肝臟內發生的自噬主要具有維持肝組織正常的結構和功能、調節肝臟三大營養物質代謝、調控肝臟免疫和炎癥反應的生物學作用，對急性肝衰竭具有保護作用［30］。IL-17 主要是由活化的CD4+T細胞產生的促炎細胞因子，在介導炎癥反應、免疫性疾病、腫瘤、移植排斥反應等過程中發揮重要作用［31］。說明茵黃解毒湯可通過調節細胞周期，影響細胞增殖和凋亡，調節機體免疫，抑制HBV病毒復制等方面發揮拮抗HBV-LF的作用。

綜上所述，本研究借助網絡藥理學揭示了茵黃解毒湯防治HBV-LF 的作用機制，對篩選出的優效小分子化合物、優效靶點、優效途徑進行了初步的探索。體現了中藥復方具備“多成分-多靶點-多通路”的特點，揭示了其拮抗肝衰竭的作用機制。探討茵黃解毒湯防治HBV-LF 的研究，進一步挖掘了中藥復方優效的單體成分，為新藥的開發提供基礎，并為中醫藥現代化提供堅實的證據和實驗支撐。