miR-361-3p通過靶向S100A6抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的機(jī)制

姜巖松 趙志國 張冰心 楊強(qiáng) 白吉明

(承德市中心醫(yī)院 1檢驗(yàn)科,河北 承德 067000;2輸血科;3甲乳直腸外科)

甲狀腺癌是臨床上最常見的內(nèi)分泌腫瘤。調(diào)查顯示,甲狀腺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢,這可能與診斷技術(shù)的不斷發(fā)展有關(guān)〔1〕。大多數(shù)甲狀腺癌患者經(jīng)治療后均可痊愈,死亡率很低,但是間變性甲狀腺癌的死亡率高達(dá)90%〔2〕。間變性甲狀腺癌十分罕見,約占甲狀腺惡性腫瘤的2%。常見的甲狀腺惡性腫瘤為甲狀腺乳頭狀癌、濾泡狀癌,分別占79%、13%〔3〕。非編碼RNA是一種在基因合成過程中產(chǎn)生的長短不一的單鏈核酸片段,包括200 個核酸以上的長鏈非編碼RNA、18～22個核酸的短鏈微小RNA和環(huán)狀RNA等,其中微小(mi)RNA是最先發(fā)現(xiàn)腫瘤調(diào)控非編碼RNA〔4,5〕。如今,miRNA通過調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯過程參與調(diào)控多種癌癥的進(jìn)展作用已得到普遍認(rèn)可,但是仍有部分新發(fā)現(xiàn)的miRNA的功能仍有待進(jìn)一步探究。 miR-361-3p是甲狀腺癌中新發(fā)現(xiàn)的miRNA,其功能研究仍處于初步探索階段。

S100A6是S100鈣結(jié)合蛋白家族成員,位于人類染色體1q21,該染色體經(jīng)常發(fā)生異常,可導(dǎo)致人類的多種疾病(先天性智力低下、畸形、心臟病等)〔6～8〕。已有研究證明,S100A6促進(jìn)胃癌、肺癌、骨肉瘤和胰腺癌細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、增殖和遷移侵襲〔9,10〕。本研究旨在探究 miR-361-3p通過靶向S100A6抑制在甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 組織樣本來自承德市中心醫(yī)院2018年7月至2021年2月接收的30例甲狀腺癌切除術(shù)患者的癌組織及對應(yīng)的癌旁組織?；颊呒凹覍倬炇鹬橥鈺?。人甲狀腺正常細(xì)胞Nthy-ori 3-1、甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1、SW579和CAL-62均購自美國菌種保藏中心;逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)試劑盒購自北京康為世紀(jì);細(xì)胞計數(shù)試劑盒(CCK)8購自日本同仁;Transwell小室購自美國Corning;5-乙炔基-2'-脫氧尿苷(EDU)細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自上海碧云天。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自日本TaKaRa。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) Nthy-ori 3-1、TPC-1、SW579和CAL-62細(xì)胞均使用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,37 ℃、5%CO2的飽和濕度恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。隔天更換1次培養(yǎng)液。

1.3分組與轉(zhuǎn)染 將培養(yǎng)48 h的Nthy-ori 3-1、TPC-1、SW579和CAL-62細(xì)胞設(shè)為Nthy-ori 3-1、TPC-1、SW579和CAL-62組。取3倍量的脂質(zhì)體將miR-con組、 miR-361-3p組、si-con組、si-S100A6組、 miR-361-3p+pcDNA組、 miR-361-3p+pcDNA-S100A6組轉(zhuǎn)染至CAL-62細(xì)胞,轉(zhuǎn)染10 h后更換新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。RT-qPCR、Western印跡法檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.4RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 收集對數(shù)生長期細(xì)胞,Trizol液提取總RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cRNA,-20 ℃保存,作為qPCR模板。按照qPCR試劑盒說明要求操作,檢測其中 miR-361-3p、S100A6的表達(dá)。以U6、GAPDH為內(nèi)參,2-ΔΔCt法計算結(jié)果。 miR-361-3p(5′-3′)正向引物ATAAAGRGCRGACAGTGCAGATAGTG,反向TCAAGTACCCACAGTGCGGT;S100A6(5′-3′)正向引物AAGCTGCAGGATGCTGAAAT,反向CCCTTGAGGGCTTCATTGTA。U6(5′-3′)正向引物GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT,反向CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT;GAPDH(5′-3′)正向引物CGACCACTTTGTCAAGCTCA,反向ACTGAGTGTGGCAGGGACTC。循環(huán)條件為95 ℃下初始變性10 min,然后在95 ℃變性15 s,60 ℃退火1 min,進(jìn)行40次循環(huán)。

1.5Western印跡實(shí)驗(yàn)檢測 無菌研磨組織樣本,放射免疫沉淀(RIPA)裂解,提取總蛋白。對數(shù)生長期細(xì)胞用同樣的方法裂解,提取總蛋白。二喹啉甲酸(BCA)試劑盒定量,沸水浴變性。行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),轉(zhuǎn)膜儀濕轉(zhuǎn)蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。轉(zhuǎn)膜后,用2.0%脫脂奶粉的封閉液37 ℃處理2 h。滴加稀釋的一抗溶液(兔抗S100A6多抗,1∶1 000)4 ℃冰箱孵育過夜。再滴加稀釋的二抗溶液〔辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗,1∶500〕,37 ℃溫箱孵育2 h。滴加電化學(xué)發(fā)光(ECL)液,顯色,曝光。ImageJ分析條帶的灰度值,用目的蛋白灰度與內(nèi)參蛋白灰度的比值表示蛋白水平。

1.6CCK8實(shí)驗(yàn) 收集對數(shù)生長期miR-con組、 miR-361-3p組、si-con組、si-S100A6組、 miR-361-3p+pcDNA組、 miR-361-3p+pcDNA-S100A6組細(xì)胞,培養(yǎng)液調(diào)至0.5×105個/ml,取200 μl置于96孔板,分別培養(yǎng)12、24、48 h。取CCK8試劑盒中的CCK液20 μl,輕輕震蕩混勻,避光孵育15 min。490 nm波長下檢測細(xì)胞的吸光度(OD)值。

1.7EDU增殖檢測實(shí)驗(yàn) 收集對數(shù)生長期細(xì)胞,接種在24孔板,按照BeyoClickTMEDU-488細(xì)胞增殖檢測試劑盒要求操作,檢測分析細(xì)胞的增殖情況。用EDU(300 μl)與細(xì)胞孵育3 h,洗滌。多聚甲醛固定30 min,0.5%Triton X-100滲透脫色10 min,最后用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色細(xì)胞核30 min。熒光顯微鏡觀察EDU陽性染色細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞總數(shù)量,計算EDU陽性率。EDU陽性率(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.8劃痕實(shí)驗(yàn) 收集對數(shù)生長期細(xì)胞,接種至不含血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基的24孔板(24孔板的背面每劃5條平行直線)。常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞至融合度至80%左右,用200 μl的槍頭垂直孔底,平行板背面的直線劃線。沖洗脫落的細(xì)胞,五點(diǎn)法拍照。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,再次拍照。ImageJ軟件分析劃痕的愈合情況。劃痕愈合率(%)=(0 h寬度-24 h寬度)/0 h寬度×100%。

1.9Transwell實(shí)驗(yàn) 收集對數(shù)生長期細(xì)胞,更換無血清的培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)12 h。取200 μl均勻鋪在不含基質(zhì)膠的小室(遷移能力)上室表面,取600 μl含血清的培養(yǎng)基至下室,常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)12 h。用于細(xì)胞的甲醛固定,結(jié)晶紫染色,顯微鏡下計數(shù),結(jié)果取平均值。細(xì)胞侵襲力的檢測將小室更換為含有基質(zhì)膠的小室即可,其他操作同上。

1.10雙熒光素酶報告基因檢測實(shí)驗(yàn) Targetscan在線預(yù)測軟件(http://www.targetscan.org/)發(fā)現(xiàn)S100A6是 miR-361-3p的一個靶基因。依據(jù)預(yù)測到的結(jié)合位點(diǎn)化學(xué)合成S100A6野生片段(含S100A6結(jié)合位點(diǎn))和S100A6突變片段(不含S100A6結(jié)合位點(diǎn))的核酸序列,插入熒光載體,構(gòu)建熒光素酶報告基因。將miR-con、 miR-361-3p、anti-miR-con、anti-miR-361-3p分別與熒光報告基因載體共轉(zhuǎn)染CAL-62細(xì)胞。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測、計算細(xì)胞的熒光活性。

1.11統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-361-3p 在甲狀腺癌中的表達(dá) 與癌旁組織(0.95±0.06)相比,癌組織中 miR-361-3p表達(dá)(0.68±0.13)顯著降低(t=14.968,P=0.000)。與Nthy-ori 3-1組(0.93±0.07)相比,TPC-1、SW579和CAL-62組 miR-361-3p表達(dá)(0.50±0.10、0.52±0.06、0.45±0.05)均顯著降低(均P<0.05)。CAL-62組細(xì)胞 miR-361-3p的降低幅度最大,對 miR-361-3p的敏感性最高,故選用CAL-62細(xì)胞用于后續(xù)研究。

2.2過表達(dá) miR-361-3p調(diào)控CAL-62增殖、凋亡 與miR-con組相比, miR-361-3p組細(xì)胞 miR-361-3p表達(dá)顯著升高,24、48、72 h細(xì)胞活性均顯著降低,EDU陽性率顯著降低(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 兩組甲狀腺癌細(xì)胞CAL-62增殖(EDU法,×100)

2.3過表達(dá) miR-361-3p調(diào)控CAL-62遷移侵襲 與miR-con組相比, miR-361-3p組細(xì)胞劃痕愈合率顯著升高,遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著降低(P<0.05)。見表1、圖2。

表1 過表達(dá) miR-361-3p抑制CAL-62增殖、凋亡、遷移和侵襲

圖2 過表達(dá) miR-361-3p的CAL-62細(xì)胞遷移、侵襲

2.4miR-361-3p靶向S100A6 targetscan在線預(yù)網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/)預(yù)測到S100A6與 miR-361-3p之間存在連續(xù)的互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn),見圖3。miR-con組相比, miR-361-3p組WT-S100A6細(xì)胞熒光活性顯著降低,MUT-S100A6細(xì)胞熒光活性變化不顯著,S100A6蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05);與anti-miR-con組相比,anti-miR-361-3p組WT-S100A6、MUT-S100A6細(xì)胞的熒光活性變化均不顯著,S100A6蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05),見圖4、表2。

圖3 S100A6與miR-361-3p存在連續(xù)互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)

2.5敲減S100A6 調(diào)控CAL-62增殖、遷移侵襲和凋亡 與si-con組相比,si-S100A6組細(xì)胞S100A6蛋白表達(dá)、24、48、72 h細(xì)胞活性、EDU陽性率、細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)量均顯著降低,劃痕愈合率顯著升高(P<0.05)。見圖4、表3。

1～10:miR-con組、miR-361-3p組、anti-miR-con組、anti-miR-361-3p組、癌旁組織、癌組織、si-con組、si-100A6組、miR-361-3p+pcDNA組、miR-361-3p+pcDNA-S100A6組圖4 各組S100A6蛋白表達(dá)

2.6過表達(dá)S100A6和 miR-361-3p影響甲狀腺癌細(xì)胞CAL-62增殖、遷移、侵襲 與 miR-361-3p+pcDNA組相比, miR-361-3p+pcDNA-S100A6組細(xì)胞S100A6蛋白表達(dá)顯著升高,24、48、72 h細(xì)胞活性、EDU陽性率、細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)量顯著升高,劃痕愈合率顯著降低(P<0.05),見圖4、表4。

表2 雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)

表3 敲減S100A6 抑制甲狀腺癌細(xì)胞CAL-62增殖、遷移和侵襲

2.7miR-361-3pt S100A6 mRNA相關(guān)性 與癌旁組織(1.05±0.12、0.36±0.07)相比,癌組織中S100A6 mRNA和蛋白表達(dá)(4.45±0.35、0.76±0.13)均顯著升高(t=72.937、21.503;均P<0.05)。癌組織中 miR-361-3p相對表達(dá)與S100A6相對表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見圖4、圖5。

表4 過表達(dá) miR-361-3p和S100A6 調(diào)控CAL-62增殖、遷移侵襲和凋亡

圖5 miR-361-3p和S100A6 mRNA相關(guān)性

3 討 論

miR-361被證明在乳腺癌、肺癌、胃癌等實(shí)體腫瘤中的表達(dá)受到抑制〔11〕。Xia等〔12〕研究報道,miR-361-3p作為Hsa_circ_0011385的靶向因子參與甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、細(xì)胞周期阻滯和凋亡過程,揭示Hsa_Circ0011385通過靶向miR-361-3p促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移,抑制甲狀腺癌細(xì)胞周期阻滯和凋亡,提示Hsa_Circ0011385/miR-361-3p通路可能是甲狀腺癌的一個有希望的治療靶點(diǎn)。Li等〔13〕報道,miR-361-5p過度表達(dá)可在體外顯著抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲,在體內(nèi)抑制腫瘤的生長。本研究發(fā)現(xiàn),miR-361-3p在甲狀腺癌組織和癌細(xì)胞中的表達(dá)水平均發(fā)生明顯下調(diào)。過表達(dá)miR-361-3p明顯的抑制了癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力,增強(qiáng)了癌細(xì)胞的凋亡能力,說明miR-361-3p在甲狀腺癌的治療中具有成為潛在治療靶點(diǎn)的價值。miR-361-3p具有靶向負(fù)調(diào)控S100A6的功能,推測這可能與miR-361-3p在甲狀腺癌中調(diào)控甲狀腺癌細(xì)胞表型變化的潛在機(jī)制有關(guān)。

有研究〔14〕表明,S100A6在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)顯著升高,腫瘤的免疫組化分析顯示,乳頭狀甲狀腺癌患者的胞質(zhì)染色明顯強(qiáng)于濾泡性甲狀腺癌,且染色的細(xì)胞核比例更大,說明S100A6在甲狀腺癌中具有促進(jìn)作用,并可能有助于區(qū)分濾泡性甲狀腺癌和乳頭狀甲狀腺癌〔14〕。Nipp等〔15〕研究發(fā)現(xiàn),S100-A10、S100-A10在轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌中的表達(dá)明顯升高,并與淋巴轉(zhuǎn)移的程度高度相關(guān),此外,其還與轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β依賴性上皮間質(zhì)化途徑密切相關(guān),提示S100-A10、S100-A10可能在轉(zhuǎn)移性甲狀腺癌的診斷中具有生物價值。Li等〔16〕研究發(fā)現(xiàn),S100A2/4/6/10/14/16在胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)組織中的表達(dá)水平顯著高于正常胰腺組織,而S100A2/4/6/10/14/16在PDAC中的啟動子甲基化水平低于正常組織,它們的表達(dá)與PDAC患者的生存率呈負(fù)相關(guān),表明S100A2/4/6/10/14/16可作為PDAC患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。由此可見,S100A6在內(nèi)分泌腫瘤中發(fā)揮致癌功能,但是其發(fā)揮作用的機(jī)制仍有待繼續(xù)研究。本研究發(fā)現(xiàn),敲減S100A6明顯抑制了甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲,促進(jìn)凋亡,說明S100A6的抑制具有抗甲狀腺癌作用,再次證實(shí)了前S100A6在甲狀腺癌中的致癌功能。此外,過表達(dá)S100A6后還能夠部分逆轉(zhuǎn)過表達(dá) miR-361-3p對甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲抑制和凋亡促進(jìn)作用。

綜上, miR-361-3p在甲狀腺癌組織、癌細(xì)胞中表達(dá)降低,具有抑制癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲,促進(jìn)凋亡的作用,其機(jī)制與靶向抑制S100A6表達(dá)相關(guān)。