下調miR-146a對肺部細菌感染大鼠干預及作用機制

向仕菊 潘渝 陳金 王霞

(貴州省人民醫院重癥監護科,貴州 貴陽 550002)

肺部細菌感染在治療后還會存在較為嚴重的氣道黏膜損傷、氣道反應性升高,其臨床表現常見于咳嗽癥狀遷延不愈等,最終會轉變為慢性持續性感染疾病〔1,2〕。miRNAs是當下感染疾病領域的研究中的熱點,研究顯示,miR-146a在人體肺泡上皮細胞中會發揮重要調控作用,其常參與各種肺部疾病的發生發展〔3,4〕。本研究探究下調miR-146a對肺部細菌感染大鼠的干預效果及作用機制。

1 材料與方法

1.1研究動物 選取4～6周齡SPF健康雌性大鼠40只,平均體質量(114.83±10.60)g,由廣西醫科大學實驗動物中心提供,動物許可證號:SCXK(桂)2021-0002。將大鼠置于專門實驗飼養室中,保證室內光線充足,溫度(23.07±2.13)℃,通風良好,晝夜節律為12 h,環境濕度保持在50%～60%,定期消毒、清掃鼠籠,及時更換墊料,保持1 w適應性飼養時間。主要試劑:流感嗜血桿菌1709菌株由解放軍第960醫院呼吸科臨床分離,經VITEK系統鑒定;Ham F-12K培養基由美國Sigma Aldrich公司提供,胎牛血清(FBS)購自美國HyClone公司、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒均購自日本TaKaRa公司;miR-146a引物由上海源葉生物科技有限公司合成;全自動酶免分析儀購自美國Bio-Rad公司;酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自福州邁新公司。

1.2分組及模型構建 將40只大鼠依照隨機分為假手術組、模型組、空白組、miR-146a轉染組,每組各10只,將假手術組、模型組及miR-146a轉染組大鼠以45 ml/kg 3%戊巴比妥腹腔麻醉,成功后取大鼠仰臥位固定于固定板中,用專用電動剃毛器將胸部、頸部脫毛。消毒后適度拉伸大鼠頸部,暴露大鼠喉頭,在大鼠頸部正中切2～3 cm切口,分離大鼠前肌,暴露其氣管并進行固定,于環甲軟骨處剪V形切口,置入硅膠管,向大鼠氣管右側緩慢、傾斜注入流感嗜血桿菌瓊脂小珠100 μl,完成后將大鼠直立10～20 s,使菌液最大可能分布于大鼠肺部。上述大鼠成功建模的只數分別為10、8、9只。miR-146a轉染組:通過敲低miR-146a實現miR-146a下調,100 nmol/L轉染miRNA抑制劑轉染miR-146a,分為miR-146a轉染組,模型組、假手術組、空白組使用100 nmol/L轉染miRNA抑制劑轉染無意義序列。

1.3樣本采集 24 h后,將大鼠禁食禁水12 h,使用1%戊巴比妥鈉溶液依照40 mg/kg的比例注射進大鼠腹腔,使其麻醉,靜待,成功后,取其主動脈血5 ml,然后于3 000 r/min條件下,離心15 min,分離血清后分裝于-70 ℃冰箱保存。處死大鼠,取出其肺組織,使用生理鹽水進行沖洗,最后將其固定在比例為4%的多聚甲醛溶液中。

1.4病理組織學觀察 將肺組織固定后進行常規脫水、包埋、切片、HE染色,觀察其病理形態變化,光鏡下肺部感染情況。

1.5miR-146a相對表達 實時熒光定量-聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測肺組織中miR-146a表達水平,采用Trizol法提取樣本RNA,使用TaKaRa逆轉錄試劑盒行逆轉錄處理后獲得總cDNA,采用Primer5.0軟件設計引物序列,啟動PCR儀,反應體系:0.4 μl上下游引物、1 μl cDNA模板、10 μl SYB Green,加蒸餾水至20 μl。反應條件:95 ℃預變性1 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 31 s,共進行40個循環,采用2-△△Ct方法計算出miR-146a相對表達。miR-146a上游引物:5'-CGTAGCATCCTTAGAACTCAGC-3′,下游5′-CCGCTCGAGGAA-CTATTGTTGAACGGCACT-3′。內參上游:5′-CATTGCC-GACAGGATGCA-3′,下游5′-GCCGATCCACACGGAGTACT-3′。

1.6白細胞介素(IL)-4、IL-1β、干擾素(IFN)-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α、轉化生長因子(TGF)-β、糖鏈抗原(KL)-6、水性表面活性蛋白(SP)-D水平 采用ELISA檢測。提前稀釋好將提前稀釋好100 μl標本,將其置入微孔板標準孔,樣品孔只加樣品稀釋液,混合均勻,在37 ℃下處理90 min,甩去孔內液體,吸干水分;將準備好的抗體加入樣品孔、標準孔中0.1 ml,在37 ℃下處理60 min,甩去孔內液體,每孔中加滿0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS),浸泡2 min后甩干孔內液體;每孔加入90 μl TMS,置于避光處20 min;每孔中加入90 μl TMS終止液。于波長450 mm處分析IL-4、IL-1β、IFN-γ、TNF-α、TGF-β、KL-6、SP-D水平。

1.7血氣分析 構建模型24 h后,取腹主動脈血行血氣分析送檢做血氣分析。

1.8統計學處理 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組病理組織 空白組肺泡形態均勻、結構完整,且上皮細胞形態正常,肺泡腔內未發現滲出的纖維蛋白,肺間質未發現炎性細胞、水腫及紅細胞浸潤;假手術組與空白組差異性并不明顯,肺泡間隔正常,肺泡腔及肺泡結構較為完整,無明顯肺組織損傷狀況,但由于受實驗操作的影響,假手術組肺部結構及形態稍有改變。模型組肺泡間隔出現明顯增寬,微血管有充血、擴張現象,肺間質周圍有明顯炎性細胞浸潤,且肺組織損傷較為嚴重。miR-146a轉染組肺泡結構雖然不完整,但較模型組狀況要好,肺組織損傷也較輕,肺泡及其周圍炎性細胞逐漸減少,且肺泡間隔變窄,肺部結構趨于恢復正常。見圖1。

圖1 各組肺泡病理(HE染色,×200)

2.2各組miR-146a相對表達比較 miR-146a轉染組miR-146a相對表達明顯低于模型組、空白組,明顯高于假手術組(P<0.05);模型組、空白組miR-146a相對表達明顯高于假手術組(P<0.05);模型組、空白組miR-146a相對表達比較無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.3各組炎癥因子水平比較 miR-146a轉染組IL-4、IL-1β、IFN-γ、TNF-α水平明顯低于模型組,明顯高于空白組、假手術組(P<0.05);空白組以上指標明顯低于模型組(P<0.05),與假手術組無顯著差異(P>0.05);模型組以上指標明顯高于假手術組(P<0.05)。見表1。

表1 各組miR-146a表達、炎癥因子水平比較

2.4各組血氣指標比較 miR-146a轉染組動脈血氧分壓(PaO2)、PaO2/吸入氣氧濃度(FiO2)明顯低于假手術組、空白組,明顯高于模型組(P<0.05);空白組以上指標明顯高于模型組(P<0.05),與假手術組無顯著差異(P>0.05);模型組以上指標明顯低于假手術組(P<0.05)。見表2。

2.5各組肺泡灌洗液TGF-β、KL-6、SP-D水平比較 miR-146a轉染組TGF-β、KL-6、SP-D水平明顯低于模型組,明顯高于空白組、假手術組(P<0.05);空白組以上指標明顯低于模型組,與假手術組無顯著差異(P>0.05);模型組以上指標明顯高于假手術組(P<0.05)。見表2。

表2 各組PaO2、PaO2/FiO2、TGF-β、KL-6、SP-D水平比較

3 討 論

肺部細菌感染在重癥患者群體中較為多發,是造成重癥死亡的關鍵〔5,6〕,主要是由于機體遭受常見致病菌的入侵而引發的肺部疾病〔7,8〕。當肺部感染后,肺泡中毛細血管上皮細胞會被破壞,進而引發肺部炎癥及氣體交換功能障礙。臨床治療肺部感染的常規手段之一是抗菌治療,抑制相關病原菌感染,降低病原菌引發的肺損傷,但由于抗菌藥物使用過于廣泛,加上部分侵入性診斷、治療手段的實施,令諸多病原菌的耐藥性不斷升高。

miR-146a作為內源性非編碼RNA分子的一種,具有高度保守性,其屬于miRNA與相關蛋白分子結合形成的復合物之一〔9,10〕。研究顯示,沉默后miR-146a會抑制炎癥相關基因表達,促進靶基因降解,同時miR-146a也會參與機體固有免疫反,在調控感染性疾病中起至關重要作用〔11,12〕。本研究結果提示,下調miR-146a會降低肺部細菌大鼠炎癥水平,發揮抗炎作用,同時可以調節肺部感染大鼠血氣水平,促進氣體交換功能的改善。TGF-β是纖維細胞、肺泡巨噬細胞、氣管平滑肌、內皮細胞等多種肺泡相關細胞的表達生長因子,其有引發氣道組織肥厚、誘導血管內皮細胞生長因子產生與釋放〔13,14〕。KL-6、SP-D屬于肺泡表面的常見活性蛋白,其會發揮促進組織細胞修復及抑制病菌生長的作用〔15～17〕。既往研究發現,TGF-β、KL-6、SP-D在肺部細菌感染中會呈顯著升高狀態,且多項顯示證實,它們會參與多種炎癥介質的釋放〔18～20〕。推測下調miR-146a會抑制肺部細菌感染的病理活動過程。當肺部受致病菌感染后,大量炎癥因子相關基因的轉錄被啟動,而miR-146a的靶基因是相關炎癥因子通路中的重要接頭蛋白編碼基因,miR-146a下調后會抑制炎癥因子及促炎因子釋放,有助于改善肺組織感染狀況,減輕肺損傷,有利于平滑肌重塑及呼吸功能的改善。雖然本文初步證實了,下調miR-146a可能是靶向調控治療肺部細菌大鼠有效方案,但后續研究還需進一步理清該作用機制中路徑。