脂質體提高輔酶Q10穩定性與生物可接受率研究

方素瓊,陳文榮,王培建,昝勝杰

(仙樂健康科技股份有限公司,廣東 汕頭,515041)

輔酶Q10(coenzyme Q10,CoQ10)因具有抗氧化、緩解體力疲勞、提高人體免疫力、輔助降血脂等多種功能活性而被廣泛報道[1-3]。然而,作為一種高分子質量化合物,CoQ10在水中溶解性差,小腸直接吸收水平低,導致其直接口服生物利用率低;同時CoQ10的穩定性還受到光、熱等環境因素的挑戰,這限制了CoQ10作為膳食補充劑在保健食品中的應用[2]。目前,運用制劑新技術開發高含量、高穩定的CoQ10保健食品已成為研究熱點。

基于脂質基質的載體遞送技術在提高脂溶性活性成分的溶解性,保護其免受環境因素導致的降解,防止與其他食品成分的相互作用,提高其口服生物可接受率上成效顯著[4]。脂質體為具有兩親性分子(磷脂)雙層結構的球狀囊泡,可同時包裹親水性與親脂性活性成分,是最具有代表性的一類脂質遞送系統[5]。脂質體已廣泛應用于活性成分,如姜黃素[6-7]和β-胡蘿卜素[8-9]等的包封。

目前,脂質體的制備工藝大多遵循使磷脂分子暴露于水相環境從而自組裝形成雙層囊泡結構的思路。為了實現目標,常用的方法有2種:其一是薄膜分散法(溶劑蒸發法),即先將磷脂分子制備成薄脂質片,再暴露于水相環境制備脂質體;其二為乙醇注入法(溶劑分散法),即在水性環境中以受控方式引入磷脂乙醇溶液以形成脂質體[10]。然而此類方法制備的脂質體多以微米級的多層囊泡形式存在,過大的粒徑和過高的多分散系數對脂質體的穩定性和活性成分遞送效果均產生不利影響,因此有必要采用粒徑控制技術將脂質體的粒徑控制在亞微米級別[10]。以高壓均質、超聲波和微射流為代表的新型物理加工技術是減小脂質體粒徑,降低其多分散系數的有效策略,且同時兼具成熟、安全和高效的優勢,在脂質體生產中具有充足潛力[10-11]。

本研究擬制備脂質體來提高CoQ10的穩定性和生物可接受率,并探究高壓均質處理對脂質體的粒徑、電位、包封率和微觀形態等特征參數的影響。進一步考察所制備脂質體儲藏穩定性以及模擬體外消化中CoQ10生物可接受率的差異,闡明高壓均質技術作為CoQ10脂質體制備新技術的潛力,為CoQ10膳食補充劑相關產品開發提供理論參考與技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CoQ10、中鏈酸甘油酯(medium chain triglycerides,MCT)、大豆磷脂, 浙江天草生物科技股份有限公司;維生素E,豐益油脂科技有限公司;95%乙醇,南昌卓耀實業有限公司;胃蛋白酶、胰酶,美國Sigma公司;乙腈、異丙醇、正己烷、鹽酸等,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

AH-Pilot高壓均質機,安拓思納米技術(蘇州)有限公司;Nano-ZS90納米粒度儀,英國Malvern Instruments公司;JEM-1230透射電子顯微鏡,日本電子株式會社;Agilent 1260高效液相色譜儀,美國Agilent公司;FE20型pH計,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 CoQ10脂質體的制備

采用乙醇注入法結合高壓均質技術制備。在50 ℃水浴條件下將20 g CoQ10溶于10 g MCT中,制成CoQ10油溶液。將油溶液滴入到溶解有98.3 g大豆磷脂和0.7 g維生素E的300 g乙醇溶液中,在50 ℃水浴攪拌至澄清,作為制備脂質體的乙醇相。將乙醇相緩慢注入870 g水中形成乳化液。乳化液在流速40 L/h、預設固定壓力(0/50/100 MPa)條件下進行1次高壓均質處理,再于45 ℃下減壓蒸發除去乙醇相,得到CoQ10脂質體混懸液。將脂質體混懸液再于相同條件下高壓均質處理2個循環,并灌裝于棕色玻璃瓶,經85 ℃水浴殺菌30 min,即得CoQ10脂質體樣品。脂質體樣品根據均質壓力差異進行命名,分別為0 MPa:CoQ10-LP-Ⅰ、50 MPa:CoQ10-LP-Ⅱ、100 MPa:CoQ10-LP-Ⅲ。

1.3.2 粒徑、電位與微觀結構

稱取10 mg脂質體樣品,用4 mL去離子水稀釋,于室溫 (25 ℃)下平衡30 min后,使用激光粒度儀測量其粒徑、多分散指數和電位,使用透射電鏡觀察其微觀結構。

1.3.3 包封率

精密稱取0.2 g脂質體樣品,加入2 mL正己烷振蕩萃取未包封的CoQ10,10 000 r/min離心10 min,吸取上層正己烷定容至10 mL,測量CoQ10的含量。CoQ10脂質體樣品的包封率(encapsulation efficiency,EE)按公式(1)計算:

式中:minitial,初始添加的CoQ10總質量,mg;munloaded,未包封CoQ10的質量,mg。

CoQ10含量的測定采用HPLC進行,色譜柱選擇C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),流動相由乙腈和異丙醇(65∶10,體積比)組成,流速1.0 mL/min,檢測波長275 nm,進樣量20 μL,柱溫35 ℃。

1.3.4 貯藏穩定性

將 CoQ10脂質體樣品置于40 ℃條件下貯藏30 d,每10 d記錄其粒徑、CoQ10保留率、酸價和過氧化值。

CoQ10保留率(retention rate,RR)按公式(2)計算:

式中:EEt,特定時間CoQ10-LP樣品的包封率,%;EEinitial,CoQ10-LP樣品的初始包封率,%。

酸價和過氧化值的測定分別參照GB 5009.229—2016《食品安全國家標準 食品中酸價的測定》和GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》的方法進行。

1.3.5 體外消化特性

取新鮮制備的CoQ10脂質體樣品進行模擬體外消化實驗,并以等含量的CoQ10粉末作為對照。取7.5 mL脂質體與7.5 mL人工唾液混合,調節pH值至6.8,在37 ℃下孵育2 min后,加入2 mL含有15.3 mg/L胃蛋白酶的模擬胃液,用鹽酸將混合物調節至pH 2.5,在37 ℃下孵育2 h以模擬胃消化過程。收集30 mL胃消化食糜,加入1.5 mL模擬腸液和3.5 mL膽鹽溶液,將pH值調節至7.0,加入2.5 mL胰酶溶液(36 mg /mL)在37 ℃下孵育2 h以模擬小腸消化。

在小腸消化的特定時間間隔,取適量消化食糜,于15 000 r/min離心30 min,分離并吸取上清液0.1 mL,加入0.1 mL乙醇振蕩均勻,用1 mL正己烷萃取,10 000 r/min離心10 min分離正己烷,用前述HPLC方法測量CoQ10的量。根據公式(3)計算CoQ10的生物可接受率:

式中:mmicelle,膠束中CoQ10的質量,mg;minitial,樣品中CoQ10的質量,mg。

1.4 數據統計與分析

所有數據均以3個獨立實驗的平均值±標準差表示,利用Origin進行繪圖,利用SPSS 17.0對數據進行Duncan差異顯著性分析,P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 CoQ10脂質體的表征

如圖1-a所示,所制備的脂質體樣品均為具有半透明外觀的液體制劑,且隨均質壓力的提高,樣品的透明度有所提升,這與脂質體粒徑隨均質壓力下降,從而引起的懸浮液中大顆粒光散射現象減弱有關[12]。CoQ10-LP-Ⅰ粒徑為(538.26±11.25) nm,多分散指數0.247±0.044;CoQ10-LP-Ⅱ的粒徑為(240.21±7.23) nm,多分散指數為0.138±0.027;對于CoQ10-LP-Ⅲ,粒徑則進一步下降為(130.17±3.13) nm,多分散指數0.096±0.011。多分散指數是脂質體粒徑分布集中程度的度量[12]。隨著樣品制備過程均質壓力的增加,粒徑和多分散指數呈下降的趨勢,說明在更高的均質壓力條件下,微通道中強大的剪切力、沖擊力和空化力使脂質體分散成更小且更均勻的顆粒[13-14]。磷脂分子構成的雙層球狀囊泡為親脂性活性成分提供了嵌入空間和吸附位點[15]。如圖1-b所示,所有脂質體樣品的包封率均為96%左右,代表脂質體有效改善了CoQ10溶解性,實現較高水平包封。同時,各脂質體樣品電位值(約-30 mV)無顯著差異(P>0.05),這不同于CHUNG等[16]所報道的脂質體電位絕對值和包封率隨均質壓力和次數增大而降低的規律,其原因可能是后者所選擇的更大的均質壓力梯度和樣品材料性質差異。

a-外觀、粒徑與多分散指數;b-電位與包封率圖1 脂質體的表征Fig.1 Characterization of liposomes 注:相同顏色柱子上不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)。

如圖2所示,無壓力條件(0 MPa)下制備的脂質體樣品CoQ10-LP-Ⅰ具有最大的囊泡結構,且形狀規整度較差,表面粗糙程度更高。相比之下,壓力條件(50和100 MPa)下的CoQ10-LP-Ⅱ和CoQ10-LP-Ⅲ樣品均為表面光滑、形狀近圓的較小囊泡,這與粒徑測量結果相一致。

a-CoQ10-LP-Ⅰ;b-CoQ10-LP-Ⅱ;c-CoQ10-LP-Ⅲ圖2 CoQ10脂質體的微觀結構Fig.2 Microstructure of CoQ10 liposomes

2.2 穩定性分析

如圖3所示,粒徑分析表明,脂質體在貯藏期間粒徑呈增大趨勢,這與貯藏期間脂質體聚集、絮凝、聚結和顆粒融合,導致形成較大的囊泡有關[17-18]。在貯藏終點,CoQ10-LP-Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ粒徑分別增大至(650.12±18.30)、(351.02±18.12)、(331.64±15.53) nm,其中CoQ10-LP-Ⅲ粒徑增幅最大。對此可能的原因是更高的均質壓力在將脂質體破碎成更小粒徑顆粒的同時,增大了比表面積,從而導致界面厚度下降,脂質體物理穩定性降低[19]。此外,脂質體在貯藏期間的聚集、絮凝和融合對脂質體的酸價和過氧化值均造成了不利影響。CoQ10-LP-Ⅰ的酸價和過氧化值均高于其余脂質體樣品,說明50 MPa和100 MPa條件的高壓均質處理在一定程度上改善了脂質體的貯藏穩定性。此外,相較于CoQ10-LP-Ⅱ,100 MPa處理的CoQ10-LP-Ⅲ具有更高的酸價和過氧化值[分別為(38.27±2.63) mg/g和(1.33±0.02) g/100 g]?？赡苁莾煞矫嬖驅е?其一是囊泡融合過程中發生的脂質氧化;其二則是過度加工,即過高均質壓力導致的更高頻率碰撞和更高壓力閥門溫度對脂質氧化穩定性的潛在破壞[19-20],這說明過高壓力的均質處理對脂質體的貯藏穩定性具有負面作用。

值得注意的是,CoQ10在貯藏過程中保留率的變化并未顯示出與均質壓力的關聯趨勢,且貯藏終點各樣品保留率均維持在較高水平(>85%),證明脂質體是CoQ10穩態化遞送的有效手段。

a-粒徑;b-酸價;c-過氧化值;d-CoQ10保留率圖3 CoQ10脂質體貯藏穩定性的變化Fig.3 Changes in storage stability of CoQ10 liposomes

2.3 模擬體外消化特性

脂質載體在消化過程中伴隨著油脂消化釋放出的游離脂肪酸在膽鹽作用下膠束重組,為親脂性活性成分提供增溶的疏水區域,從而提高其生物可接受率[21]。研究考察了模擬腸道消化實驗終點的膠束相外觀圖像,并根據膠束中CoQ10含量計算其生物可接受率。如圖4-a所示,CoQ10原料對照組的膠束相外觀為澄清透明狀,幾乎無顏色,絕大部分CoQ10經離心而沉淀到離心管底部,說明絕大部分未被有效利用。相比之下,脂質體組膠束相均呈淡黃色,代表其所包封的CoQ10在在消化過程中被轉移至膠束相,能夠被生物體所吸收利用。生物可接受率的測算從數值層面展示了脂質體包封對CoQ10生物利用的提高程度(圖4-b),其中原料對照組生物可接受率數值趨近于0,幾乎不能被生物利用,這與其直接口服生物利用率極低相對應[22]。脂質體包封后,CoQ10-LP-Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ生物可接受率分別提升為(20.86±1.26)%、(31.97±1.62)%和(31.61±2.72)%,說明脂質體包封對CoQ10生物可接受率提升顯著。此外,50、100 MPa壓力均質處理的脂質體膠束相顏色更深,生物可接受率更高,說明高壓均質處理對CoQ10脂質體生物可接受率的改善具有積極意義。

a-消化終點膠束相外觀;b-CoQ10生物可接受率圖4 CoQ10脂質體的模擬體外消化特性Fig.4 In vitro digestion properties of CoQ10 liposomes

3 結語

本研究使用脂質體包封的方式改善CoQ10的穩定性和生物可接受率,并研究了均質處理條件對脂質體理化特性、穩定性和消化特性的影響。表征結果表明,均質處理有效降低了脂質體的粒徑和多分散指數,對脂質體的電位和包封率幾乎未造成影響。穩定性分析顯示,均質處理對脂質體的貯藏穩定性有一定程度的改善,但過高的均質壓力可能對脂質體的酸價和過氧化值造成不利影響。模擬體外消化實驗表明,脂質體包封對CoQ10生物可接受率提升顯著,同時均質處理對生物可接受率也具有積極意義。綜上,使用高壓均質手段構建脂質體是實現CoQ10高穩定、高生物可接受率遞送的有效手段,對開發CoQ10營養保健產品具有重要參考意義。