乳酸菌發(fā)酵乳蛋白水解物對(duì)RAW264.7細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

候智興,李恒*,蔣敏,錢建瑛,閆建國,盧儉,許正宏,史勁松*

1(江南大學(xué) 生命科學(xué)與健康工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)2(寧夏塞尚乳業(yè)有限公司,寧夏 銀川,750001) 3(糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122)

乳蛋白是牛乳中占比最高的營養(yǎng)組分,是國民健康飲食的重要組成。乳蛋白中豐富的酪蛋白、乳清蛋白等蛋白,是天然功能蛋白的優(yōu)質(zhì)來源。研究表明,乳蛋白在抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、緩解疲勞、維持腸道健康[1-2]等方面均具有良好的生理作用。其中,抗氧化能力是各類生物活性的基礎(chǔ),長期的氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致各種威脅生命的病理狀況,例如衰老、心臟病、糖尿病、自身免疫性疾病、癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等,因此其活性分析可為功能物質(zhì)的挖掘與功能評(píng)價(jià)提供參考和遴選依據(jù)[3]。

采用生物加工的方法處理乳蛋白有利于功能蛋白/肽的挖掘。研究發(fā)現(xiàn),將蛋白酶酶解乳清分離蛋白添加到酸奶后,可促進(jìn)酸奶的發(fā)酵,提高酸奶的抗氧化活性[4]。除生物酶酶解方法外,采用乳酸菌發(fā)酵可促進(jìn)更高活性的生物活性肽的產(chǎn)生。CHANU等[5]用乳酸菌發(fā)酵水牛乳制備得到對(duì)革蘭氏陽性菌和陰性菌均有廣譜抗菌活性的抗菌肽;PADGHAN等[6]用發(fā)酵劑結(jié)合LactobacillusacidophilusNCDC-15發(fā)酵牛乳制備得到抗氧化性顯著高于單獨(dú)發(fā)酵劑組的抗氧化肽。乳酸菌發(fā)酵過程中分泌的多種蛋白酶可以彌補(bǔ)酶法水解中酶類單一的局限,但由于乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸的特性,往往造成蛋白的聚集而影響蛋白酶活性的發(fā)揮,蛋白水解并不充分。因此,綜合利用酶解與乳酸菌發(fā)酵聯(lián)合的方法有利于充分發(fā)揮乳酸菌水解蛋白的能力,并促進(jìn)功能物質(zhì)的產(chǎn)生以及活性的提升[7]。

本文采用蛋白酶水解聯(lián)合乳酸菌發(fā)酵的方法,依據(jù)體外抗氧化活性篩選可良好發(fā)酵乳蛋白水解物(milk protein hydrolysates,MPH)的乳酸菌,并在氧化損傷細(xì)胞模型上探討發(fā)酵MPH對(duì)氧化損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃縮牛乳蛋白由寧夏塞尚乳業(yè)有限公司提供。實(shí)驗(yàn)所用菌株與RAW264.7巨噬細(xì)胞均保藏于本實(shí)驗(yàn)室。

堿性蛋白酶,諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司;四甲基偶氮唑鹽、H2O2、三氟乙酸、乙醇、水楊酸、葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、NaCl、MnSO4、MgSO4、吐溫-80等,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;DPPH、ABTS,上海麥克林生化科技股份有限公司;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基,美國Gibco公司;One step qRT-PCR SYBR 試劑盒,諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

酶標(biāo)儀,美國Thermo公司;冷凍干燥機(jī),美國LABCONCO公司;Synergy超純水系統(tǒng),美國Millipore公司;RCT型磁力加熱攪拌器,德國IKA公司;YS100倒置顯微鏡,日本Nikon公司;CFX Connect實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,美國Bio-Rad公司;超濾濃縮儀,德國默克公司;超凈工作臺(tái),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;高壓蒸汽滅菌鍋,美國AUTOCLAVE Engineers公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MPH的制備

配制40 g/L的牛乳蛋白水溶液,按3 000 U/g酶底比加入堿性蛋白酶,55 ℃水解3 h,過程中用1 mol/L NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH值,使其維持在8.0。水解完畢后100 ℃加熱10 min。采用分子質(zhì)量3 000 Da的超濾膜在4 ℃ 下超濾,濾液凍干得到MPH備用。MPH中多肽含量采用雙縮脲法進(jìn)行測(cè)定,以水解后所得多肽質(zhì)量與初始牛乳蛋白質(zhì)量的比值計(jì)算MPH得率,為78.34%。

1.3.2 乳酸菌發(fā)酵MPH

將分離自泡菜的16株乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)3代,每代活化12 h,以2%接種量接種至含MPH的發(fā)酵培養(yǎng)基,37 ℃ 發(fā)酵48 h。發(fā)酵液6 000 r/min 離心20 min,上清液凍干得到不同乳酸菌發(fā)酵MPH用于篩選評(píng)價(jià)。其中,以篩選所得的乳酸菌發(fā)酵MPH所得產(chǎn)物命名為FPS。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):MPH 25、檸檬酸氫二胺2、葡萄糖10、K2HPO42、乙酸鈉3、MgSO40.58、MnSO40.25,100 ℃滅菌10 min。

1.3.3 MPH發(fā)酵前后抗氧化活性測(cè)定

將發(fā)酵前后的MPH樣品分別配制成2、4、6、8、10 mg/mL 溶液。分別測(cè)量各樣品對(duì)DPPH自由基、·OH、ABTS陽離子自由基的清除能力和鐵離子還原力,采用模糊綜合評(píng)價(jià)法評(píng)價(jià)抗氧化能力并依此篩選乳酸菌用于后續(xù)評(píng)價(jià)。以等量去離子水作為對(duì)照,每個(gè)測(cè)試樣品設(shè)置3組平行。

1.3.3.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

參考KILIC等[8]的方法。配制0.08 mg/mL的DPPH溶液,將該溶液與樣品溶液1∶1(體積比)渦旋混勻,避光孵育30 min后,在517 nm處測(cè)量吸光度。DPPH自由基清除率按照公式(1)計(jì)算:

式中:E,清除率;A0,對(duì)照組吸光值;Ai,待測(cè)樣品吸光值。

1.3.3.2 ·OH清除率的測(cè)定

參考ZHOU等[9]的方法。將0.2 mL不同濃度的樣品溶液依次與9 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 8.8 mmol/L H2O2混合,室溫反應(yīng)10 min后加入1 mL 9 mmol/L水楊酸乙醇溶液,37 ℃水浴反應(yīng)30 min后在510 nm處測(cè)定吸光值。參照公式(1)計(jì)算·OH清除率。

1.3.3.3 ABTS陽離子自由基清除率的測(cè)定

參考LI等[10]的方法。將7 mmol/L的ABTS溶液與2.45 mmol/L K2S2O8以1∶1體積比混合搖勻后室溫避光靜置12 h制得ABTS儲(chǔ)備液;用10 mmol/L pH 7.4的PBS稀釋ABTS儲(chǔ)備液,使其在734 nm下吸光度為0.70±0.05時(shí)制得ABTS工作液。取20 μL不同濃度樣品和200 μL ABTS工作液混合搖勻,室溫避光靜置10 min,于734 nm處測(cè)定吸光值。參照公式(1)計(jì)算ABTS陽離子自由基清除率。

1.3.3.4 鐵離子還原力的測(cè)定

參考CHEN等[11]的方法。取 1 mL 不同濃度樣品溶液與2 mL PBS(0.2 mol/L,pH 6.6)、2.5 mL 10 g/L鐵氰化鉀溶液混合,50 ℃反應(yīng)20 min,冷卻至室溫后加入2.5 mL三氯乙酸溶液(10%,質(zhì)量分?jǐn)?shù))混勻,3 000 r/min離心10 min后取2.5 mL上清液,加入2.5 mL去離子水和0.5 mL FeCl3溶液(0.1%,質(zhì)量分?jǐn)?shù))于37 ℃水浴30 min,于700 nm處測(cè)定吸光值。

1.3.3.5 抗氧化活性的綜合評(píng)價(jià)

采用模糊綜合評(píng)價(jià)法[12]計(jì)算和評(píng)價(jià)樣品抗氧化活性。根據(jù)極值標(biāo)準(zhǔn)化公式Zij=(Xij-Xij min)/(Xij max-Xij min),將各抗氧化指標(biāo)值無量綱化置于閉區(qū)間[0,1]中。其中,Xij為第i個(gè)菌株發(fā)酵MPH的第j個(gè)抗氧化指標(biāo)值,Xij max、Xij min分別為第i個(gè)菌株的第j個(gè)抗氧化指標(biāo)的最大值和最小值?？寡趸C合評(píng)價(jià)值Zi按照公式(2)計(jì)算并作為乳酸菌篩選依據(jù)。

Zi=Σ(Zij)(i=1,2,…,16;j=1, 2, 3, 4)

(2)

1.3.4 分子質(zhì)量分布的測(cè)定

采用凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography,GPC)測(cè)定樣品分子質(zhì)量分布。配制溶液V(水)∶V(乙腈)∶V(三氟乙酸)=60∶40∶0.1,加入待測(cè)樣本配制成20 mg/mL溶液,10 000 r/min離心10 min后過0.22 μm 濾膜用于測(cè)定。

色譜條件:色譜柱TSKgel G2000SWXL,柱溫30 ℃,紫外檢測(cè)波長220 nm,流動(dòng)相為V(水)∶V(乙腈)∶V(三氟乙酸)=60∶40∶0.1,流速0.5 mL/min、進(jìn)樣量10 μL。

1.3.5 游離氨基酸的測(cè)定

取樣品2.0 g,用50 g/L的三氯乙酸于50 mL容量瓶中定容,超聲1 h后抽濾,濾液在10 000 r/min離心30 min,上清液用0.22 μm濾膜過濾,采用HPLC分析游離氨基酸含量。

色譜條件:色譜柱Agilent Hypersil ODS,柱溫40 ℃,紫外檢測(cè)波長338 nm,流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(醋酸鈉)=1∶2∶2,流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量10 μL。

1.3.6 FPS對(duì)H2O2誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用評(píng)價(jià)

1.3.6.1 細(xì)胞存活率測(cè)定

RAW264.7細(xì)胞在含10%血清和1% 雙抗的DMEM培養(yǎng)基中,于37 ℃、5% CO2的濕潤環(huán)境培養(yǎng)。細(xì)胞(1×104個(gè)/孔)培養(yǎng)于96孔板中至完全貼壁后,添加不同濃度FPS的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h。再次吸去培養(yǎng)基并用pH 7.5的PBS淋洗3遍后,加入含有10% CCK-8溶液的等體積無血清培養(yǎng)基,避光孵育2 h后于450 nm波長下測(cè)量吸光值。以不加FPS培養(yǎng)孔作為對(duì)照,以無細(xì)胞的培養(yǎng)孔為空白組。每組5個(gè)平行,根據(jù)公式(3)計(jì)算細(xì)胞存活率。

式中:A1,對(duì)照組吸光值;Ai,實(shí)驗(yàn)組吸光值;A0,空白組吸光值。

1.3.6.2 FPS對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7氧化損傷的保護(hù)作用

取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞(1×104個(gè)/孔)在96孔板中培養(yǎng)24 h后,添加含不同濃度FPS的新鮮培養(yǎng)基。孵育24 h后用PBS洗滌3次,更換含有400 μmol/L H2O2的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后,加入含有10% CCK-8溶液的等體積無血清培養(yǎng)基,避光孵育2 h后于450 nm測(cè)量吸光值。參照公式(3)計(jì)算細(xì)胞存活率。以不加FPS的培養(yǎng)孔為對(duì)照組,無細(xì)胞的培養(yǎng)孔為空白組,每組5個(gè)平行。

1.3.6.3 FPS對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7抗氧化酶基因mRNA水平的影響

將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞按5×104個(gè)/孔接種于6孔板中至完全貼壁,加入不同濃度的FPS培養(yǎng)24 h,PBS洗滌3次。之后除空白組以外,更換為含有400 μmol/L H2O2的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)12 h后用PBS洗滌3次,棄去PBS后轉(zhuǎn)移至無RNA酶的離心管中,裂解細(xì)胞,提取RNA進(jìn)行PCR反轉(zhuǎn)錄,所用引物如表1所示。反應(yīng)體系:200 ng RNA,5 nmol/L上下游引物,1 μL One Step SYBR Green Enzyme Mix,10 μL 2× One Step SYBR Green Mix,并在95 ℃,10 s;60 ℃,30 s條件下運(yùn)行40個(gè)循環(huán)。通過RT-PCR系統(tǒng)測(cè)定靶基因上調(diào)核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)和谷胱甘肽過氧化酶1(glutathione peroxidase 1,GPX1)基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平,并用2-(△△CT)方法進(jìn)行分析。測(cè)定的目標(biāo)基因?yàn)槊拷M平行3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示和單向方差分析法分析,采用Graphpad Prism 9作圖。與對(duì)照組相比,#P<0.05,##P<0.01;與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌菌種的篩選

從泡菜樣本中分離篩選獲得16株乳酸菌,包括5株副干酪乳酪桿菌(Lacticaseibacillusparacasei)、3株植物乳植桿菌(Lactiplantibacillusplantarum)、2株發(fā)酵黏液乳桿菌(Limosilactobacillusfermentum)、2株鼠李糖乳酪桿菌(Lacticaseibacillusrhamnosous)、2株谷糠乳桿菌(Lactobacillusfarraginis)、1株瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)和1株嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)。進(jìn)而對(duì)這些菌株發(fā)酵MPH的抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過測(cè)定發(fā)酵前后不同樣本對(duì)DPPH自由基、·OH、ABTS陽離子自由基清除率及鐵離子還原力,并依據(jù)模糊綜合評(píng)價(jià)法分析計(jì)算,結(jié)果如表2所示。綜合來看,16株乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)不同自由基清除能力和抗氧化能力有明顯差異,其中,鼠李糖乳酪桿菌(Lacticaseibacillusrhamnosous)ST(LST)發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性最強(qiáng),綜合評(píng)價(jià)值達(dá)到3.12,顯著高于其他菌株。因此選定菌株LST發(fā)酵產(chǎn)物FPS作為后續(xù)評(píng)價(jià)對(duì)象。

表2 乳酸菌發(fā)酵MPH的抗氧化能力Table 2 Antioxidant activities of MPH fermented with lactic acid bacteria

2.2 LST發(fā)酵產(chǎn)物FPS的抗氧化活性

進(jìn)一步評(píng)估FPS的體外抗氧化能力。如圖1所示,隨著濃度增加,FPS對(duì)3種自由基清除率和鐵離子還原力逐漸增加,有良好的劑量依賴關(guān)系。與發(fā)酵前相比,當(dāng)FPS質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí),DPPH自由基、·OH和ABTS陽離子自由基的清除率分別提高了19.28%、19.21%、20.87%,鐵離子還原力提高了34.38%,均有顯著差異,說明MPH經(jīng)LST發(fā)酵后顯著提高了抗氧化活性。

a-DPPH自由基清除率;b-·OH清除率;c-ABTS陽離子自由基清除率;d-鐵離子還原能力圖1 不同濃度MPH與FPS抗氧化能力的比較Fig.1 Comparison of antioxidant activities of MPH and FPS at different concentrations 注:不同小寫字母表示同一濃度下,MPH與FPS的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。

2.3 MPH與FPS游離氨基酸含量分析

比較MPH與FPS游離氨基酸含量,結(jié)果如表3所示。發(fā)酵后,游離氨基酸總量由32.6 mg/g 上升至52.7 mg/g;含量最高的Leu由11.1 mg/g增加到16.3 mg/g;Met、Asp和Ala濃度顯著升高,約是發(fā)酵前的4～6倍。Trp、Tyr、Met、Asp等是具有較強(qiáng)抗氧化活性的氨基酸種類[13],且大多數(shù)抗氧化肽的末端或兩端均含有疏水氨基酸,其含量的增加有利于抗氧化活性的提高[14]。研究發(fā)現(xiàn),給高脂大鼠飼喂Leu可顯著提高大鼠抗氧化能力[15],在酶解南瓜子中發(fā)現(xiàn)Trp增加并提高了水解物的抗氧化活性[16];Met對(duì)活性氧敏感,通過與活性氧結(jié)合使其失活并促進(jìn)谷胱甘肽的合成發(fā)揮抗氧化作用[17]。由此推測(cè),FPS抗氧化性的增加與LST水解乳蛋白釋放游離氨基酸的組成、疏水性以及位置有關(guān),有待進(jìn)一步分析。

表3 MPH與FPS的游離氨基酸含量 單位:mg/g

2.4 MPH與FPS分子質(zhì)量變化

如圖2所示,MPH經(jīng)發(fā)酵后,FSP重均分子質(zhì)量由發(fā)酵前425 Da下降至396 Da。具體分析不同分子質(zhì)量大小的組分分布發(fā)現(xiàn)(表4),1 000～180 Da組分比例顯著下降,其中,分子質(zhì)量500～180 Da的組分減少最為顯著,為7.43%,分子質(zhì)量<180 Da的組分增加了8.66%。說明LST發(fā)酵過程中可將分子質(zhì)量較小的多肽進(jìn)一步水解,這也與游離氨基酸含量的增加相吻合。

圖2 MPH與FPS的GPC圖譜Fig.2 GPC profiles of MPH and FPS

表4 MPH與FPS的分子質(zhì)量分布情況Table 4 Molecular weight distribution of MPH and FPS

2.5 FPS對(duì)H2O2誘導(dǎo)RAW 264.7 巨噬細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

2.5.1 FPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

巨噬細(xì)胞在宿主免疫過程中發(fā)揮重要作用,是多種氧化劑和親電試劑的靶細(xì)胞[18],并對(duì)活性氧反應(yīng)敏感[19]。研究采用巨噬細(xì)胞RAW264.7建立氧化損傷模型,首先考查FPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響。如圖3所示,在質(zhì)量濃度為50～400 μg/mL時(shí),FPS對(duì)細(xì)胞活力無顯著影響。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)即在此濃度范圍內(nèi)考查FPS對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響。

圖3 不同濃度FPS對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活力的影響Fig.3 Effect of FPS concentration on the viability of RAW264.7 cell

2.5.2 FPS對(duì)氧化損傷RAW 264.7細(xì)胞存活率的影響

進(jìn)一步在氧化損傷模型中考查FPS對(duì)細(xì)胞存活率的影響。采用H2O2誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7建立氧化損傷模型。如圖4所示,經(jīng)H2O2處理后,模型組細(xì)胞存活率為65.79%;給藥FPS后,與模型組相比,細(xì)胞存活率隨FPS濃度的增加而增加,并具有良好的劑量依賴性;當(dāng)FPS質(zhì)量濃度為400 μg/mL時(shí),細(xì)胞存活率上升了31.48%,且與對(duì)照組無顯著差異。由此說明,FPS對(duì)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有良好的保護(hù)作用。

圖4 不同濃度 FPS 對(duì)氧化損傷RAW 264.7 細(xì)胞活力的影響Fig.4 Effect of the concentration of FPS solution on the viability of oxidative-damaged RAW 264.7 cells 注:與對(duì)照組相比,#P<0.05,##P<0.01; 與模型組相比,*P<0.05,**P<0.01(下同)。

2.5.3 FPS對(duì)Nrf2、SOD1、HO-1、GPX1基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

在氧化應(yīng)激下,抗氧化防御系統(tǒng)被激活以清除活性氧。Nrf2是抗氧化防御的重要內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子,當(dāng)Nrf2轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中,它會(huì)結(jié)合到抗氧化反應(yīng)元件并上調(diào)一系列抗氧化酶的表達(dá),包括SOD1、HO-1、GPX1等[20-21]。如圖5所示,在H2O2誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞氧化損傷模型中,Nrf2、SOD1、HO-1、GPX1基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著下降;給藥FPS后,隨劑量的增加,FPS均明顯提高如上抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄水平,當(dāng)質(zhì)量濃度為100～400 μg/mL時(shí)有顯著差異,且呈劑量依賴關(guān)系。結(jié)果說明,FPS可顯著促進(jìn)氧化損傷細(xì)胞中抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄,改善氧化應(yīng)激并發(fā)揮保護(hù)作用。

a-Nrf2;b-SOD1;c-HO-1;d-GPX1圖5 FPS對(duì)氧化損傷RAW 264.7細(xì)胞中氧化應(yīng)激相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.5 Effects of FPS on the transcriptional level of the genes for oxidative stress in oxidative-damaged RAW 264.7 cells

3 結(jié)論

采用生物酶水解聯(lián)合乳酸菌發(fā)酵的生物加工方法有助于乳蛋白的進(jìn)一步水解,促進(jìn)抗氧化等活性的提升。本研究在利用蛋白酶水解獲得MPH的基礎(chǔ)上,從發(fā)酵食品中分離篩選獲得16株乳酸菌,通過綜合評(píng)價(jià)分析不同乳酸菌發(fā)酵MPH產(chǎn)物的體外多種自由基清除能力及鐵離子還原能力,從中篩選獲得一株抗氧化活性較強(qiáng)的鼠李糖乳酪桿菌LST。與發(fā)酵前相比,LST發(fā)酵MPH所得產(chǎn)物上清液FPS在質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí),對(duì)DPPH自由基、·OH和ABTS陽離子自由基的清除率分別提高了19.28%、19.21%、20.87%,鐵離子還原力提高了34.38%,具有良好的抗氧化活性。進(jìn)一步分析FPS的游離氨基酸含量與分子質(zhì)量分布,發(fā)酵后分子質(zhì)量進(jìn)一步下降,500～180 Da組分減少7.43%,分子質(zhì)量<180 Da的組分增加了8.66%,說明LST具有良好的發(fā)酵MPH能力,產(chǎn)生的游離氨基酸中,Leu、Met、Asp、Ala、Trp、Tyr等抗氧化與疏水性氨基酸的量顯著增加。FSP不影響RAW264.7細(xì)胞增殖,在H2O2誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞氧化損傷模型中,同時(shí)促進(jìn)Nrf2、SOD1、GPX1、HO-1等抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄,劑量依賴關(guān)系良好,從而對(duì)細(xì)胞氧化損傷進(jìn)行保護(hù)。綜上所述, LST具有良好發(fā)酵MPH的能力,且可產(chǎn)生更高的抗氧化活性。后續(xù)研究將進(jìn)一步探討發(fā)酵產(chǎn)生的抗氧化乳肽等功能物質(zhì),分析其緩解氧化損傷的機(jī)理。