重組亞胺還原酶工程菌快速高密度發酵研究

吳子鎣,李榮旭,白少鈺,胡浩軒,黃佳俊,盧宇靖

1(佛山市匯騰生物技術有限公司,廣東 佛山,528225)2(廣東工業大學 生物醫藥學院,廣東 廣州,510006)

亞胺還原酶(imine reductase,IRED)是一種立體選擇性極高、底物選擇性廣泛、轉化效率極高、反應條件溫和的氧化還原酶[1-2]。在輔酶NADPH參與下,可將前手性的亞胺不對稱合成為相應的手性胺,可用于手性伯胺、仲胺和叔胺產物的合成[3-4]。亞胺還原酶通過實現碳氮雙鍵間的不對稱加成反應,滿足許多藥物分子和農藥的關鍵中間體的生物合成[5-7]。通過分子生物學、基因工程技術等現代生物技術,異源表達獲得的亞胺還原酶,可催化多種環亞胺反應合成S型或R型的手性胺。

高密度發酵(high cell density cultivation,HCDC)指在一定培養條件下,應用一定的培養技術和設備,盡可能地提高菌體的生物量,獲得較高的外源蛋白產量。高密度發酵可以提高單位體積發酵液中菌體的生物量,提高產物的比生產率以相應的減少發酵罐的體積,縮短生產周期,降低生產成本,提高生產效率[8-13]。大腸桿菌的培養環境簡單、生長周期短、成本低,具有清晰的遺傳背景,是目前合成生物學領域中研究最成熟的表達系統之一[14-17],因此選用大腸桿菌作為重組亞胺還原酶的宿主有利于其工業化生產制備。

亞胺還原酶用于亞胺還原反應,該步驟離不開還原型輔酶的參與,而輔酶價格昂貴,導致工業化生產成本激增。實際上,工業化進行生物法亞胺還原反應往往會利用合成生物學手段構建能實現體內或者體外的輔酶再生系統以提供輔酶,而在構建體內輔酶再生系統時,除了要考慮亞胺還原酶本身的酶活力和產量外,還需要考慮再生系統的活力,因此,本研究綜合考慮酶活力和酶產量對高密度發酵進行“快速”探究,通過2 L發酵體系對自建菌株BL21(DE3)/pET-28a-IRED進行發酵種子液接種量和誘導條件優化,確定了不同的接種量、誘導時機、誘導劑濃度和誘導溫度對亞胺還原酶酶活力的影響,并在50 L發酵罐上進行20 L發酵體系放大,為酶促反應制備手性胺的工業化提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株BL21(DE3)/pET-28a-IRED由本公司構建和保藏。

酵母提取物,Oxoid;胰蛋白胨,生工生物工程(上海)股份有限公司;瓊脂,BioFroxx;硫酸銨、七水合硫酸鎂、一水合硫酸錳,西隴科學股份有限公司;NaCl、葡萄糖、KH2PO4,廣東光華科技股份有限公司;玉米漿干粉,北京鴻潤寶順科技有限公司;FeSO4·7H2O、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactoside,IPTG)和硫酸卡那霉素,上海麥克林生化科技股份有限公司。

LB培養基(g/L):酵母提取物5、胰蛋白胨10、NaCl 5,固體培養基加入20 g/L瓊脂,121 ℃滅菌15 min。

種子培養基(g/L):葡萄糖40、(NH4)2SO42、KH2PO42、MgSO4·7H2O 1、酵母提取物20、玉米漿干粉2、FeSO4·7H2O 0.08、MnSO4·H2O 0.08,115 ℃滅菌20 min,滅菌后冷卻加入終質量濃度為100 μg/mL的硫酸卡那霉素。

發酵培養基(g/L):葡萄糖40、(NH4)2SO41.8、KH2PO43、MgSO4·7H2O 2、酵母提取物1、玉米漿干粉2、FeSO4·7H2O 0.08、MnSO4·H2O 0.08,115 ℃滅菌20 min,滅菌后冷卻加入終質量濃度為100 μg/mL的硫酸卡那霉素。

1.2 儀器與設備

DGLS-35B立式蒸汽滅菌器,江蘇登冠醫療器械有限公司;5 L發酵罐、三聯5 L發酵罐、50 L發酵罐,上海保興生物設備工程有限公司;UV755B紫外可見光光度計,上海佑科儀器儀表有限公司;HP/Agilent 1100高效液相色譜儀,美國Agilent公司。其余儀器設備如超凈工作臺、培養箱、搖床等為常規微生物實驗儀器設備。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子液培養

取20 ℃保藏的BL21(DE3)/pET28aIRED甘油菌在LB固體培養基上劃線,37 ℃倒置培養16 h;挑取單菌落于2 mL LB液體培養基中,37 ℃,200 r/min振蕩培養6 h,得到一級種子液。一級種子液按1%接種量接種至200 mL種子培養基中,37 ℃,200 r/min振蕩培養12 h,獲得二級種子液。

1.3.2 發酵培養

將二級種子液按10%接種量接種至5 L發酵罐(發酵體系為2 L),初始轉速為200 r/min,溫度為37 ℃,通氣量為4 L/min,罐壓為0.05 MPa,pH值為7,開啟pH自動調節、消泡劑自動感應、轉速自動控制和溫度自動控制,用14%(體積分數)氨水調節pH值。當溶氧下降到30%以下時,設置溶氧串級轉速,使溶氧值保持在30%～35%。當轉速達到800 r/min,溶氧回升時,開始向發酵體系中恒速流加800 g/L葡萄糖溶液,流加速度為10 mL/h。當OD600值達到12時,降溫至20 ℃,并加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG進行誘導。當OD600值下降10個單位時,結束發酵。

1.3.3 發酵條件優化

優化種子液接種量:種子液分別以4%、6%、8%、10%和12%的接種量接種到發酵體系中,其他條件保持不變,測定發酵結束時OD600值和酶活力。

優化誘導時機:發酵過程中,分別在OD600達到12、30、50時進行誘導,其他條件保持不變,測定發酵結束時OD600值和酶活力。

優化誘導劑使用量:誘導階段,IPTG終濃度分別為0.1、0.4、0.8 mmol/L,其他條件保持不變,測定發酵結束時OD600值和酶活力。

優化誘導溫度:誘導階段,設置誘導溫度分別為16、20、25、30、37 ℃,其他條件保持不變,測定發酵結束時OD600值和酶活力。

所有試驗設3個平行,所得數據為3個平行試驗的均值。所得數據利用Origin 9.0繪制。

1.3.4 檢測方法

菌體濃度測定:吸取適量菌液,稀釋后控制吸光度在0.2～0.8,用分光光度計測定該菌液在波長600 nm處的吸光值(OD600值)。

酶活力測定:亞胺還原酶活力單位定義為:在30 ℃、pH值為7.5條件下,每分鐘消耗1 μmol麥斯明所需的粗酶量為1個活力單位(U/g)。

亞胺還原酶活力反應體系(mg/mL):麥斯明0.5,葡萄糖0.925,亞胺還原酶全細胞25,GDH(商業用酶)0.005,NAD 0.022 5,0.1 mol/L磷酸鹽溶液作緩沖液,30 ℃,200 r/min,反應0.5 h。

液相檢測方法:采用高效液相色譜法測定麥斯明含量,色譜條件如下:流動相A為pH值9.5的0.15%(質量分數)乙酸氨,流動相B為100%乙腈,色譜柱為Xtimate C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),檢測波長:254 nm,流速1 mL/min;柱溫30 ℃;進樣量5 μL,梯度洗脫,梯度情況見表1。

表1 高效液相色譜法檢測麥斯明含量梯度洗脫流動相情況Table 1 Gradient elution conditions for the detection of myosmine content by high-performance liquid chromatography

1.3.5 擴大發酵體系至20 L

根據1.3.3節優化的發酵條件,其他條件不變,將發酵體系擴大至20 L,比較2 L發酵體系和20 L發酵體系的發酵情況,測定發酵結束時OD600值和酶活力。

2 結果與分析

2.1 發酵條件優化

2.1.1 接種量優化

發酵體系中接種量對BL21(DE3)/pET-28a-IRED菌體生物量和酶活力的影響,結果見圖1。菌體生物量隨著接種量增高而增高。有文獻表明,接種量較低時,菌體生長緩慢,在相同時間內菌體生物量的積累較低,導致酶產量降低,酶活力較低;接種量較高時,菌體對新環境的適應能力增強,菌體快速繁殖,產量高,酶活力較高[8],與本研究結果一致。雖然12%接種量的菌體生物量最高,但與10%接種量的酶活力差異不明顯,且考慮到繁殖速度過快,菌體會提早進入衰老,發生自溶而影響發酵效果[18],確定10%為最佳接種量。

圖1 接種量對IRED菌體生物量和酶活力的影響Fig.1 Effects of inoculation amount on the biomass and enzyme activity of IRED strains

2.1.2 誘導時機對IRED表達量的影響

誘導時機對BL21(DE3)/pET-28a-IRED菌體生物量和酶活力的影響,結果見表2。分別在OD600值達到12、30和50時加入0.4 mmol/L IPTG進行誘導,誘導溫度為20 ℃,誘導16 h后測定酶活力。結果表明,誘導時機較晚時,雖然獲得的菌體量大,但菌體過老,代謝緩慢,導致蛋白表達量下降,酶活力降低;而誘導時機較早時,雖然低溫誘導導致菌體生長遲緩,獲得的菌體量較低,但單位酶活性好,發酵時間短。綜合時間、用電等成本,以及達到快速高密度發酵的目的,最終確定最佳誘導時機為OD600值達到12 h。

表2 誘導時機對IRED菌體濃度和酶活力的影響Table 2 Effects of induction timing on the cell density and enzyme activity of IRED strains

2.1.3 誘導劑使用量對IRED表達量的影響

誘導劑IPTG的使用量對BL21(DE3)/pET28a-IRED菌體生物量和酶活力的影響,結果見表3。IPTG的終濃度與菌體生物量相關,IPTG使用量過低,誘導效果較差,蛋白表達不足,導致酶活力下降;而IPTG使用量過高時,對菌體有毒害作用,并且會增加異源蛋白錯誤折疊的概率,導致非可溶性蛋白增加,增加菌體生長負擔,進而使菌體生長緩慢,最終得到較低的生物量[19-21],因此確定最佳的誘導劑IPTG使用量為0.4 mmol/L。

表3 IPTG終濃度對IRED菌體生物量和酶活力的影響Table 3 Effects of final IPTG concentration on the biomass and enzyme activity of IRED strains

2.1.4 誘導溫度對IRED表達量的影響

誘導溫度對BL21(DE3)/pET28a-IRED菌體生物量和酶活力的影響,結果見表4。誘導溫度為20 ℃時IRED酶活力最高,16 ℃誘導酶活力次之。37 ℃誘導雖獲得最大的生物量,但酶活力較低,推測是溫度過高,雖有利于菌體生長,但菌體生長過快不利于蛋白表達,導致重組蛋白錯誤折疊,從而形成包涵體,酶活力下降,而且溫度過高也會導致菌體提早衰老[22-23]。而過低溫度誘導時菌體生物量降低,菌體生長緩慢,發酵結束時酶活力不高,這可能是因為低溫誘導延緩菌體生長,延長蛋白的表達時間,有利于增加外源蛋白的表達,同時低溫表達可以降低多肽的合成速度,提供充裕的時間用于肽鏈正確空間折疊,在一定程度上減少無生物活性的包涵體的形成[24-25]。因此,確定誘導溫度20 ℃為最佳誘導溫度。

表4 誘導溫度對IRED菌體濃度和酶活力的影響Table 4 Effects of induction temperature on the cell density and enzyme activity of IRED strains

2.2 擴大發酵體系至20 L

根據2 L發酵罐優化得到的發酵條件,進行20 L放大發酵培養,并比較2 L和20 L發酵體系的發酵結果。如圖2所示,20 L發酵體系在發酵12 h時(誘導3 h),酶活力隨著時間逐漸上升,并在發酵21 h時(誘導12 h)酶活力達到最高,為4.56 U/g;隨后在發酵22 h(誘導13 h)后酶活力開始下降,在發酵24 h(誘導15 h)時酶活力趨于穩定至發酵結束。20 L發酵體系發酵結果與2 L發酵體系基本一致,說明發酵體系放大成功,為進一步放大發酵體系以實現亞胺還原酶快速高產量制備的工業化生產提供數據基礎。

圖2 2 L/20 L發酵體系生長曲線和酶活力變化情況Fig.2 Growth curve and enzyme activity changes in 2 L/20 L fermentation system

3 結論與討論

亞胺還原酶可用于合成手性胺,手性胺廣泛存在于天然產物、農業化學品、臨床藥物和表面活性劑中,在醫藥領域,超過70%藥物是手性胺及其衍生物,在農業領域,存在手性胺結構單元的農用化學品約20%[26-27]。目前,未見有通過高密度發酵培養重組菌制備亞胺還原酶的報道。本研究先對2 L發酵體系制備亞胺還原酶進行接種量、誘導時機、誘導劑濃度和誘導溫度對重組菌的生物量和亞胺還原酶的酶活力進行研究,確定本研究自行構建的BL21(DE3)/pET-28a-IRED重組菌發酵最佳接種量為10%,最佳誘導條件為當OD600值達到12時,在20 ℃下加入終濃度為0.4 mmol/L IPTG,以此條件放大至20 L發酵體系進行發酵培養,發酵結束時(發酵21 h,誘導12 h)菌體生物量OD600值為74,酶活力為4.56 U/g。發酵條件的優化以及20 L擴發發酵的順利進行,為進一步放大發酵體系以實現亞胺還原酶快速高產量制備的工業化生產奠定基礎。