四種過(guò)氧化物酶體同工酶在畢赤酵母甲醇代謝中的作用研究

鄒瀟毅,王世杰,楊艷坤,3,白仲虎,3*

1(江南大學(xué) 糧食發(fā)酵與食品生物制造國(guó)家工程研究中心,江蘇 無(wú)錫,214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院, 江蘇 無(wú)錫,214122)3(江蘇省生物活性制品加工工程技術(shù)研究中心,江蘇 無(wú)錫,214122)

隨著化石燃料的日益減少和CO2的大量排放,世界各國(guó)都在尋求并開(kāi)發(fā)低污染、可再生的原料。甲醇是煤炭以及天然氣的副產(chǎn)品[1],價(jià)格便宜,到2017年為止,年產(chǎn)量超過(guò)1億t[2]。同時(shí),隨著科技的進(jìn)步,甲醇可以通過(guò)電催化[3]或者光催化[4]等綠色的方式獲得。因此,利用甲醇作為底物完成生物轉(zhuǎn)化成為專家學(xué)者關(guān)注的方向。研究人員在改造現(xiàn)有的模式生物為甲基營(yíng)養(yǎng)微生物中取得進(jìn)展[5],但合成甲基微生物距離工業(yè)化應(yīng)用尚存在技術(shù)難題,所以天然甲基微生物成為最佳研究對(duì)象。其中,嗜甲醇巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris,即Komagataellaphaffii)憑借其自身優(yōu)勢(shì)在一眾天然甲基微生物中脫穎而出。2009年,人們完成了畢赤酵母的全基因組測(cè)序[6],為該酵母的代謝工程研究奠定了基礎(chǔ)。因其完善的翻譯后修飾系統(tǒng)[7-8]以及生物安全性[9],畢赤酵母已被廣泛應(yīng)用于一系列重組蛋白的生產(chǎn)[10]。此外,畢赤酵母是Crabtree陰性酵母,適用于高密度發(fā)酵[11]。

盡管畢赤酵母已經(jīng)成功應(yīng)用于多種蛋白質(zhì)及化合物的工業(yè)化生產(chǎn),但以甲醇為唯一碳源進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)還面臨著甲醇生物轉(zhuǎn)化率低下的問(wèn)題,僅有30%～50%的甲醇被同化為生物量[12-13],這意味著需要通過(guò)兩步發(fā)酵法(先利用甘油等碳源迅速積累生物量,再用甲醇誘導(dǎo)目的基因表達(dá))的方式來(lái)完成工業(yè)生產(chǎn),這種發(fā)酵方式極大地增加了生產(chǎn)的時(shí)間成本以及物力成本[14]。因此,深入了解甲醇代謝機(jī)理,確定關(guān)鍵酶基因?qū)罄m(xù)甲醇利用途徑的改造與優(yōu)化有重大意義。

在最近的研究中,有團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)畢赤酵母的同化途徑發(fā)生在過(guò)氧化物酶體中(圖1),并從過(guò)氧化物酶體中分離出與細(xì)胞質(zhì)中D-核酮糖-5-磷酸-3-表異構(gòu)酶1(D-ribulose-5-phosphate 3-epimerase,Rpe1-1),核糖-5-磷酸異構(gòu)酶1(ribose-5-phosphate isomerase,Rki1-1),轉(zhuǎn)醛醇酶1(transaldolase,Tal1-1),果糖-1,6-二磷酸醛縮酶1(fructose-1,6-bisphosphate aldolase,Fba1-1)等酶對(duì)應(yīng)的同工酶:Rpe1-2,Rki1-2,Tal1-2,Fba1-2[15]。這些酶主要參與木酮糖-5-磷酸(xylulose 5-phosphate,XU5P)的再生,而XU5P作為甲醛受體,對(duì)于甲醇同化至關(guān)重要。因此本研究對(duì)這些過(guò)氧化物酶體同工酶進(jìn)行詳細(xì)分析,期望能從中找到甲醇同化的關(guān)鍵酶基因,以期為后續(xù)甲醇利用途徑的改造優(yōu)化提供靶標(biāo)。

圖1 甲醇利用途徑示意圖Fig.1 The diagram of methanol utilization pathway

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)中所用的菌株及質(zhì)粒見(jiàn)表1。文中所需的引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成,并在電子版增強(qiáng)出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035425)中展示。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

續(xù)表1

1.2 主要培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

大腸桿菌使用LLB培養(yǎng)基(g/L)(蛋白胨10,酵母提取物5,NaCl 5)培養(yǎng),抗生素使用博來(lái)霉素,工作濃度為25 μg/mL,在37 ℃,220 r/min的搖床中培養(yǎng)。畢赤酵母在30 ℃,200 r/min搖床中培養(yǎng),使用YPD培養(yǎng)基(g/L)(酵母提取物10,蛋白胨20,葡萄糖20)擴(kuò)大培養(yǎng),使用YPM培養(yǎng)基(g/L)[酵母提取物10,蛋白胨20,甲醇1.5%(體積分?jǐn)?shù))]進(jìn)行熒光定位實(shí)驗(yàn)。抗生素使用博來(lái)霉素,工作濃度為75 μg/mL;當(dāng)測(cè)定生長(zhǎng)曲線時(shí),使用MMH培養(yǎng)基(g/L)(無(wú)氨基酵母氮源13.4,甲醇1.5%,組氨酸0.004),并且每24 h 補(bǔ)加0.5%(體積分?jǐn)?shù))甲醇。

1.3 質(zhì)粒的構(gòu)建

1.3.1 sgRNA質(zhì)粒的構(gòu)建

共構(gòu)建sgRNA-RPE1-2、sgRNA-RKI1-2、sgRNA-TAL1-2、sgRNA-FBA1-2、sgRNA-SHB175個(gè)sgRNA質(zhì)粒。以sgRNA-RPE1-2質(zhì)粒的構(gòu)建為例構(gòu)建其他4個(gè)質(zhì)粒sgRNA-RPE1-2的構(gòu)建:通過(guò)CHOPCHOP網(wǎng)站(http://chop-chop.cbu.uib.no/)在線設(shè)計(jì)sgRNA序列,將RPE1-2基因的DNA序列輸入網(wǎng)站并選擇菌種為Pichiapastoris,挑選打分較高的sgRNA序列用于構(gòu)建質(zhì)粒。根據(jù)對(duì)應(yīng)的sgRNA序列設(shè)計(jì)部分互補(bǔ)的引物對(duì),退火粘合,通過(guò)Golden Gate assembly連接至sgRNA-Cas9骨架質(zhì)粒的BsaI位點(diǎn),隨后轉(zhuǎn)化至E.coliXL10-Gold感受態(tài),通過(guò)sg-verify-F/R引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證并挑選陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng),提取質(zhì)粒進(jìn)行下步操作。

1.3.2 回補(bǔ)質(zhì)粒的構(gòu)建

1.3.2.1 過(guò)氧化物酶體同工酶回補(bǔ)質(zhì)粒的構(gòu)建

通過(guò)PCR從GS115菌株的基因組擴(kuò)增得到RPE1-2、RKI1-2、TAL1-2、FBA1-2等基因的完整表達(dá)框,然后通過(guò)Gibson assembly分別將各個(gè)基因的表達(dá)框組裝至ZH01質(zhì)粒(圖2)的位點(diǎn)1,得到回補(bǔ)質(zhì)粒hb-RPE1-2、hb-RKI1-2、hb-TAL1-2、hb-FBA1-2。

圖2 ZH01質(zhì)粒示意圖Fig.2 The diagram of ZH01 plasmid

1.3.2.2 細(xì)胞質(zhì)同工酶回補(bǔ)質(zhì)粒的構(gòu)建

通過(guò)PCR從GS115菌株的基因組擴(kuò)增得到RPE1-1、RKI1-1、TAL1-1、FBA1-1等基因的完整表達(dá)框,然后通過(guò)Gibson assembly將RPE1-1表達(dá)框組裝至ZH01質(zhì)粒的位點(diǎn)1,RKI1-1表達(dá)框組裝至位點(diǎn)2,TAL1-1表達(dá)框組裝至位點(diǎn)3,FBA1-1表達(dá)框組裝至位點(diǎn)4,得到hb-C4回補(bǔ)質(zhì)粒。

在hb-C4質(zhì)粒的基礎(chǔ)上,通過(guò)Gibson assembly在各個(gè)細(xì)胞質(zhì)同工酶基因的3’端添加過(guò)氧化物酶體定位信號(hào)1(peroxisome targeting signal type 1,PTS1)序列,即得到定位至過(guò)氧化物酶體的細(xì)胞質(zhì)同工酶回補(bǔ)質(zhì)粒hb-C4P。

1.4 菌株的構(gòu)建

1.4.1 基因編輯菌株的構(gòu)建

銀行作為整個(gè)供應(yīng)鏈條的金主，對(duì)于整個(gè)供應(yīng)鏈的作用是至關(guān)重大的。銀行可以以自身的地位，結(jié)合鏈上企業(yè)之間的差異，設(shè)立一些相關(guān)的激勵(lì)措施。供應(yīng)鏈中的企業(yè)信息明確，責(zé)任明確。加強(qiáng)企業(yè)之間的有效合作，建立信任。在激勵(lì)機(jī)制下表現(xiàn)的更加的真實(shí)。

使用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)(實(shí)驗(yàn)結(jié)果未發(fā)表)完成KO-RPE1-2,KO-RKI1-2,KO-TAL1-2,KO-FBA1-2,KO-4、KO-SHB17等菌株的構(gòu)建。KO-RKI1-2、KO-TAL1-2、KO-FBA1-2、KO-4、KO-SHB17等菌株的構(gòu)建方法請(qǐng)參考KO-RPE1-2的構(gòu)建。

KO-RPE1-2菌株的構(gòu)建:首先利用RPE1-2-HAUP-F/ RPE1-2-HAUP-R引物對(duì)和RPE1-2-HADN-F/RPE1-2-HADN-R引物對(duì)分別擴(kuò)增RPE1-2基因上下游各1 000 bp的同源臂片段,然后利用RPE1-2-HAUP-F/RPE1-2-HADN-R引物對(duì)將上下游同源臂片段進(jìn)行融合PCR,獲得2 000 bp的上下游同源臂融合片段。最后將1 μg上下游同源臂片段與1 μg sgRNA-RPE1-2質(zhì)粒混合轉(zhuǎn)化至GS115感受態(tài)細(xì)胞,待轉(zhuǎn)化板形成單克隆菌株后隨機(jī)挑取菌株進(jìn)行基因組PCR驗(yàn)證,選擇驗(yàn)證正確的菌株供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.4.2 回補(bǔ)菌株的構(gòu)建

1.4.2.1 過(guò)氧化物酶體同工酶回補(bǔ)菌株的構(gòu)建

利用BspE I限制性內(nèi)切酶線性化1.3.2.1節(jié)構(gòu)建的hb-RPE1-2、hb-RKI1-2、hb-TAL1-2、hb-FBA1-2等質(zhì)粒上的HIS4基因,分別電轉(zhuǎn)化至KO-4菌株的感受態(tài)細(xì)胞,得到HB-RPE1-2、HB-RKI1-2、HB-TAL1-2、HB-FBA1-2等回補(bǔ)菌株。

1.4.2.2 細(xì)胞質(zhì)同工酶回補(bǔ)菌株的構(gòu)建

利用BspE I限制性內(nèi)切酶線性化1.3.2.2節(jié)構(gòu)建的hb-C4及hb-C4P質(zhì)粒上的HIS4基因,分別電轉(zhuǎn)化至KO-4菌株的感受態(tài)細(xì)胞,得到在KO-4菌株細(xì)胞質(zhì)中過(guò)表達(dá)4個(gè)細(xì)胞質(zhì)同工酶的HB-C4菌株以及在過(guò)氧化物酶體中回補(bǔ)4個(gè)細(xì)胞質(zhì)同工酶的HB-C4P菌株。

1.5 同工酶亞細(xì)胞定位驗(yàn)證

為了區(qū)分過(guò)氧化物酶體定位與細(xì)胞質(zhì)定位的不同,將表達(dá)GFP蛋白和表達(dá)GFP-PTS1(在GFP的C-端融合表達(dá)PTS1)蛋白的兩株畢赤酵母細(xì)胞分別在YPM培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h,并用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)洗滌兩次并重懸。取10 μL制片,用共聚焦激光掃描顯微鏡(TCS SP8,德國(guó)徠卡)在488 nm的波長(zhǎng)下觀察GFP蛋白細(xì)胞質(zhì)定位及過(guò)氧化物酶體定位的表型變化。隨后,將GFP蛋白分別融合到Rpe1-2、Rki1-2、Tal1-2、Fba1-2、Rpe1-1、Rki1-1、Tal1-1、Fba1-1等蛋白的N-端并在畢赤酵母中表達(dá),觀察熒光表型以確定同工酶的亞細(xì)胞定位。

1.6 畢赤酵母總RNA的提取和cDNA的合成

使用購(gòu)自北京康為世紀(jì)科技有限公司的超純RNA提取試劑盒提取畢赤酵母總RNA,隨后定量至1 μg并使用南京諾唯贊生物科技股份有限公司的HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)試劑盒完成逆轉(zhuǎn)錄,獲得cDNA片段。RNA提取步驟及cDNA合成步驟請(qǐng)參照相應(yīng)試劑公司的官方說(shuō)明書(shū)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time quantitative PCR,RT-qPCR)引物設(shè)計(jì)

使用NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)的Prime-BLAST功能設(shè)計(jì)各基因的RT-qPCR引物。將待測(cè)基因的開(kāi)放閱讀框輸入網(wǎng)頁(yè)中的“PCR Template”框,Tm值設(shè)為58～62 ℃,PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度設(shè)為80～120 bp,將“Organism”選項(xiàng)切換為“KomagataellapastorisGS115”,“Database”選項(xiàng)設(shè)置為“Refseq mRNA”,點(diǎn)擊“Get Primers”即可獲得合適的RT-qPCR引物片段。

1.8 甲醇含量的測(cè)定

將樣品在12 000 r/min下離心10 min,吸取上清液進(jìn)行HPLC測(cè)定。使用Aminex HPX-87H色譜柱(9 μm,1 300 mm×7.8 mm,美國(guó)伯樂(lè))進(jìn)行分析。以5 mmol/L H2SO4溶液為流動(dòng)相,流速設(shè)置為0.6 mL/min,柱溫設(shè)置為50 ℃運(yùn)行30 min,運(yùn)行期間HPLC信號(hào)采集使用示差檢測(cè)器(RID-10A, 日本島津)。

2 結(jié)果與分析

2.1 同工酶定位驗(yàn)證

通過(guò)觀察細(xì)胞內(nèi)無(wú)定位信號(hào)的GFP蛋白與定位在過(guò)氧化物酶體的GFP-PTS1蛋白的熒光分布,可以發(fā)現(xiàn),無(wú)定位信號(hào)的GFP蛋白熒光彌散在整個(gè)胞質(zhì)中,而加有PTS1定位信號(hào)的GFP蛋白呈點(diǎn)狀聚集在過(guò)氧化物酶體中(圖3)。隨后將GFP-Rpe1-1、GFP-Rki1-1、GFP-Tal1-1、GFP-Fba1-1、GFP-Rpe1-2、GFP-Rki1-2、GFP-Tal1-2、GFP-Fba1-2等融合蛋白在畢赤酵母中表達(dá)。如圖3所示,GFP-Rpe1-1、GFP-Rki1-1、GFP-Tal1-1、GFP-Fba1-1等蛋白的熒光分布在整個(gè)細(xì)胞質(zhì)中,而GFP-Rpe1-2、GFP-Rki1-2、GFP-Tal1-2、GFP-Fba1-2等蛋白的熒光呈點(diǎn)狀聚集在過(guò)氧化物酶體中。因此,Rpe1-1、Rki1-1、Tal1-1、Fba1-1屬于細(xì)胞質(zhì)同工酶,而Rpe1-2、Rki1-2、Tal1-2、Fba1-2屬于過(guò)氧化物酶體同工酶。

圖3 同工酶的定位觀察Fig.3 Observation of isozymes location 注:“+”表示相應(yīng)蛋白所定位的細(xì)胞器,“-”表示相應(yīng) 蛋白未定位的細(xì)胞器。

2.2 過(guò)氧化物酶體同工酶參與甲醇代謝的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證過(guò)氧化物酶體同工酶參與甲醇代謝,分別測(cè)定RPE1-1、RKI1-1、TAL1-1、FBA1-1、RPE1-2、RKI1-2、TAL1-2、FBA1-2在YPD及YPM培養(yǎng)基下的轉(zhuǎn)錄水平變化,如圖4所示,4個(gè)細(xì)胞質(zhì)同工酶基因在YPD培養(yǎng)基和YPM培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)錄水平均無(wú)顯著性變化,而過(guò)氧化物酶體同工酶基因在YPM培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于其在YPD培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)錄水平,該結(jié)果說(shuō)明過(guò)氧化物酶體同工酶響應(yīng)甲醇并參與甲醇代謝。值得注意的是,FBA1-2基因在甲醇培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)錄水平提升最為顯著,這意味著Fba1-2可能在甲醇代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

圖4 同工酶基因在YPD及YPM培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)錄水平變化Fig.4 Transcriptional changes of isozyme genes in YPD and YPM medium 注:**表示差異顯著(0.000 1≤P<0.001),***表示差異 極顯著(P<0.000 1)

2.3 過(guò)氧化物酶體同工酶的敲除與回補(bǔ)對(duì)甲醇代謝的影響

將1.4.1節(jié)構(gòu)建的5株過(guò)氧化物酶體同工酶敲除菌在MMH培養(yǎng)基中培養(yǎng)。如圖5-a,圖5-b所示,RPE1-2、RKI1-2、TAL1-2等基因的敲除對(duì)畢赤酵母在甲醇培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有影響,而FBA1-2的敲除會(huì)造成輕微的生長(zhǎng)抑制,并且其甲醇利用速率也略有減緩,這可能是由于Fba1-2參與了同化途徑的兩步反應(yīng)(圖1),因此它在整個(gè)甲醇代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用。值得注意的是,雖然4個(gè)過(guò)氧化物酶體同工酶的單獨(dú)敲除對(duì)畢赤酵母的甲醇生長(zhǎng)影響不大,但將4個(gè)同工酶同時(shí)敲除會(huì)造成細(xì)胞在甲醇培養(yǎng)基中的生物量急劇下降(圖5-a),該結(jié)果進(jìn)一步反映了同化途徑的過(guò)氧化物酶體區(qū)室化對(duì)于甲醇代謝的重要性。

為了明確4個(gè)過(guò)氧化物酶體同工酶中的關(guān)鍵酶,將Rpe1-2、Rki1-2、Tal1-2、Fba1-2單獨(dú)回補(bǔ)到KO-4菌株中,如圖5-c,圖5-d所示,Fba1-2的回補(bǔ)能夠最大程度恢復(fù)四敲菌株在甲醇培養(yǎng)基中的生物量以及甲醇利用速率,該結(jié)果說(shuō)明Fba1-2屬于甲醇代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶,它可以成為后續(xù)酶改造等優(yōu)化的靶標(biāo)。

a-過(guò)氧化物酶體同工酶敲除對(duì)生長(zhǎng)的影響;b-過(guò)氧化物酶體同工酶敲除對(duì)甲醇利用的影響;c-四敲除菌中回補(bǔ)過(guò)氧化物酶體 同工酶敲除對(duì)生長(zhǎng)的影響;d-四敲除菌中回補(bǔ)過(guò)氧化物酶體同工酶敲除對(duì)甲醇利用的影響圖5 過(guò)氧化物酶體同工酶的敲除及回補(bǔ)對(duì)表型的影響Fig.5 Effects of peroxisomal isoenzyme knockout and complement on phenotype

2.4 XU5P主要再生途徑的確認(rèn)

Tal1-2是XU5P再生途徑中非氧化磷酸戊糖途徑支路的關(guān)鍵酶,其缺失應(yīng)對(duì)甲醇利用造成較大影響。但在結(jié)果2.3節(jié)中,Tal1-2的缺失和回補(bǔ)對(duì)于畢赤酵母的甲醇生長(zhǎng)幾乎沒(méi)有影響。該結(jié)果表明非氧化磷酸戊糖途徑可能不是XU5P再生的主要途徑。為了驗(yàn)證這一猜測(cè),本研究又敲除了另一條推測(cè)的XU5P再生途徑中的關(guān)鍵酶基因,即更改的卡爾文循環(huán)中的SHB17基因。如圖6所示,SHB17的敲除會(huì)造成較嚴(yán)重的生物量下降以及甲醇利用率減緩。這意味著在畢赤酵母中,非氧化磷酸戊糖途徑和更改的卡爾文循環(huán)是兩條互補(bǔ)的XU5P再生途徑,其中更改的卡爾文循環(huán)為主要途徑。

a-TAL1-2或SHB17缺失對(duì)生長(zhǎng)的影響; b-TAL1-2或SHB17缺失對(duì)甲醇利用的影響圖6 TAL1-2或SHB17缺失對(duì)表型的影響Fig.6 Effects of TAL1-2 or SHB17 deletion on phenotype

2.5 四敲除菌中細(xì)胞質(zhì)同工酶的回補(bǔ)

由于同時(shí)敲除4個(gè)過(guò)氧化物酶體同工酶后,畢赤酵母仍然能在甲醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng),根據(jù)該結(jié)果可推測(cè)細(xì)胞質(zhì)同工酶可能在過(guò)氧化物酶體同工酶缺失后替代其作用。于是,分別在4敲除菌的細(xì)胞質(zhì)及過(guò)氧化物酶體中過(guò)表達(dá)4個(gè)細(xì)胞質(zhì)同工酶,得HB-C4和HB-C4P菌株,如圖7-a所示,HB-C4菌株的4個(gè)細(xì)胞質(zhì)同工酶均定位在細(xì)胞質(zhì),而HB-C4P菌株中4個(gè)加有PTS1定位信號(hào)的細(xì)胞質(zhì)同工酶呈點(diǎn)狀聚集在過(guò)氧化物酶體。隨后測(cè)定這些菌株在MMH培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)同工酶無(wú)論定位在細(xì)胞質(zhì)還是定位在過(guò)氧化物酶體,均無(wú)法改善四敲除菌的生長(zhǎng)缺陷(圖7-b)。該結(jié)果說(shuō)明細(xì)胞質(zhì)同工酶在甲醇代謝過(guò)程中起到的作用有限,不能完全替代過(guò)氧化物酶體同工酶的功能。上述結(jié)果也進(jìn)一步反映了過(guò)氧化物酶體同工酶在進(jìn)化過(guò)程中的獨(dú)特性以及同化途徑的過(guò)氧化物酶體區(qū)室化對(duì)甲醇代謝的重要性。

a-同工酶定位驗(yàn)證;b-細(xì)胞質(zhì)同工酶的過(guò)表達(dá) 對(duì)四敲除菌生長(zhǎng)的影響圖7 細(xì)胞質(zhì)同工酶的過(guò)表達(dá)Fig.7 Overexpression of cytoplasmic isoenzymes

3 結(jié)論與討論

與RU?MAYER等[15]研究一致,本研究發(fā)現(xiàn)Rpe1-2、Rki1-2、Tal1-2、Fba1-2等同工酶存在于過(guò)氧化物酶體,且參與甲醇代謝。為了進(jìn)一步明確甲醇代謝機(jī)理以及甲醇同化途徑的關(guān)鍵酶基因,本研究對(duì)4個(gè)過(guò)氧化物酶體同工酶進(jìn)行了系統(tǒng)性的研究。

通過(guò)對(duì)4個(gè)過(guò)氧化物酶體同工酶進(jìn)行單敲除、多敲除以及回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):RPE1-2、RKI1-2、TAL1-2等基因的缺失對(duì)畢赤酵母的甲醇代謝幾乎沒(méi)有影響。而與之前的研究結(jié)果一致[16],FBA1-2基因的敲除會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)與甲醇利用率產(chǎn)生輕微的影響,這意味著FBA1-2可能是重要的同化基因。在之后的過(guò)氧化物酶體同工酶回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)中,這一猜測(cè)得到驗(yàn)證。本研究還發(fā)現(xiàn),雖然各個(gè)過(guò)氧化物酶體同工酶的單敲除對(duì)畢赤酵母在甲醇中的生長(zhǎng)影響都不大,但如果這4個(gè)同工酶同時(shí)缺失將會(huì)對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生巨大的抑制作用,這一結(jié)果反映了同化途徑的過(guò)氧化物酶體區(qū)室化對(duì)畢赤酵母甲醇利用的重要性。先前的研究推測(cè),Tal1-2酶所在的非氧化磷酸戊糖途徑對(duì)XU5P的再生只起到了補(bǔ)充作用[17]。本研究通過(guò)比較KO-TAL1-2菌株與KO-SHB17菌株的生長(zhǎng)水平發(fā)現(xiàn),Tal1-2的缺失對(duì)菌株的生長(zhǎng)不會(huì)產(chǎn)生可見(jiàn)的影響,而Shb17的缺失卻會(huì)造成嚴(yán)重的生長(zhǎng)缺陷,該結(jié)果表明Shb17酶所在的更改的卡爾文循環(huán)是同化過(guò)程中甲醛受體(XU5P)的主要再生途徑。最后,本研究根據(jù)在4敲除菌株中過(guò)表達(dá)細(xì)胞質(zhì)同工酶的結(jié)果得出結(jié)論:畢赤酵母在長(zhǎng)久的進(jìn)化過(guò)程中獲得的過(guò)氧化物酶體同工酶具有其獨(dú)特性,對(duì)于甲醇代謝扮演著舉足輕重的作用。

綜上所述,本研究通過(guò)對(duì)過(guò)氧化物酶體同工酶的系統(tǒng)性研究,進(jìn)一步明確了同化途徑過(guò)氧化物酶體區(qū)室化的重要性,確定了甲醇同化過(guò)程中的關(guān)鍵酶基因FBA1-2以及XU5P的主要再生途徑為更改的卡爾文循環(huán)。菌株的優(yōu)化是發(fā)酵工業(yè)的重要一環(huán),本研究可為后續(xù)優(yōu)化天然/非天然甲基微生物甲醇利用效率提供理論依據(jù),有助于合成生物學(xué)與發(fā)酵工業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展。