王佳琦，楊雪，趙汝楠，朱恂飛，劉闖，張爽，嚴雪瑞*

精氨酸對引起采后藍莓腐爛的鏈格孢靶標菌的抑制效果研究

王佳琦a,b，楊雪a,b，趙汝楠a,b，朱恂飛a,b，劉闖b，張爽b，嚴雪瑞a,b*

（沈陽農業大學 a.食品學院 b.設施園藝教育部重點實驗室，沈陽 110866）

旨在篩選引起藍莓采后腐爛的鏈格孢靶標菌株，并比較L-精氨酸和山梨酸鉀對其抑制效果，為藍莓采后鏈格孢腐爛病的防控提供前期基礎。通過組織分離法結合單孢分離法進行致腐菌的分離，采用ITS序列分析進行屬水平鑒定，采用ATP序列分析結合形態學觀察進行種水平鑒定，采用平板抑菌法比較L-精氨酸和山梨酸鉀的抑菌效果。本研究分離獲得的鏈格孢菌均有致病性，分別屬于3個不同種群，分別為細極鏈格孢（）互隔交鏈孢（）和云南鐵杉鏈格孢（）。以菌株B20190623E3（代表菌株）、菌株B20190623B1（代表菌株）、菌株B20190623C1（代表菌株）為靶標菌，發現L-精氨酸對供試3株靶標菌的EC50值均低于山梨酸鉀。供試鏈格菌株均有致病性，其中引起藍莓采后腐爛的優勢鏈格孢種群為細極鏈格孢。云南鐵杉鏈格孢為引起藍莓果實腐爛的新紀錄種。篩選獲得了3株鏈格孢代表靶標菌。L-精氨酸對引起藍莓采后腐爛的鏈格孢菌具有較好的抑制效果。

藍莓；鏈格孢種群；致病性；L-精氨酸；抑菌效果

藍莓，杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（）植物，口感酸甜，富含花青素等活性成分，抗氧化活性強[1]，具有較高的營養價值和經濟價值[2]。藍莓果實多成熟于高溫多雨的季節[3]，但是藍莓果實鮮嫩多汁、果皮較薄，采后不耐貯藏[4]，且易受到病原菌侵染造成果實腐爛，這些因素制約了藍莓產業的健康發展[5-7]。

鏈格孢屬真菌是常見真菌，廣泛分布于世界各地[8]。由鏈格孢屬真菌引起的采后腐爛是藍莓生產中面臨的重要問題之一[9-10]。因此在藍莓的貯運及包裝研究中，鏈格孢屬真菌是重要的靶標菌之一。病原菌不同種群對防治效果影響較大，因此本研究從種群鑒定入手，篩選具有代表性的靶標菌株，為后續相關研究提供基礎。

目前僅用ITS（Internal Transcribed Spacer）序列分析無法將鏈格孢屬真菌鑒定到種水平。相關研究表明OPA2-1基因分析可以對鏈格孢屬小孢子類群部分種進行區分，但該基因無法區分和[11]。張榮等[12-13]利用Histone-3基因對和進行了研究，結果表明部分的菌株被錯誤地劃分到，這表明Histone-3基因無法準確區分和。質膜三磷酸腺苷酶（The Plasma Membrane，ATPase）序列片段具有較高的變異性，ATPase序列能夠以較高的支持率將鏈格孢屬小孢子類群中、等種進行區分[14-18]。這一研究結果對后續進行鏈格孢屬小孢子種類群的鑒定提供了技術支撐。

L-精氨酸作為一種可食用的氨基酸，可允許添加至嬰幼兒奶粉當中，安全性高[19]，前期研究發現用L-精氨酸處理藍莓果實，可顯著提高貯藏期藍莓品質[5]。山梨酸鉀是食品常用的防腐劑之一，具有安全性高、無毒性的優點[20]。

本研究從病原菌分離、致病性測定及種水平鑒定進行研究，全面篩選引起藍莓采后腐爛的鏈格孢靶標菌株，為后續抑菌劑效果評價提供更具有代表性的靶標菌株。在此基礎上，本研究比較了L-精氨酸和山梨酸鉀對鏈格孢靶標菌株的抑菌效果，為后續開發藍莓采后抑菌保鮮劑提供研究基礎。

1 實驗

1.1 材料與試劑

病樣來源：藍莓果實主要采自沈陽、丹東、葫蘆島等產區，品種主要為藍豐和北陸，待其自然發病后對病果進行病原菌分離。

供試培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）、減量馬鈴薯胡蘿卜培養基（PCA），培養基配方參考劉闖[10]的研究。

供試藥劑：L-精氨酸（國藥集團化學試劑有限公司），有效成分含量98%；山梨酸鉀（天津市科密歐化學試劑有限公司），有效成分含量98%。

1.2 儀器與設備

主要儀器與設備：超靈敏多功能成像儀（UV版），美國GE公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業有限公司；DYY-10C型電泳儀，北京市六一儀器廠；ND-ONE，Thermo公司；TC-XP-D型XP基因擴增儀，杭州博日科技有限公司；HY-5A回旋振蕩器，國華電器有限公司；FYL-YS-138L型恒溫箱，北京福意電器有限公司；BX43光學顯微鏡，OLympus公司。

1.3 方法

1.3.1 病原菌分離、純化方法

參照《植病研究方法》[21]采用常規組織分離法分離發病果實上的病原菌，并經單孢分離純化獲得純培養菌株。

1.3.2 致病力測定方法

對所有分離菌株進行致病能力測定。采用孢子懸浮液接種健康藍莓果實測定致病能力。將待測菌株在PDA平板上進行培養，待其產孢后分別配置成1.0×105CFU/mL的孢子懸浮液備用。選用健康藍莓果實（橫徑為14 mm），用酒精（體積分數為75%）對果實進行表面消毒，無菌水清洗并晾干。在果蒂處用無菌針進行輕微刺傷，同時接種10 μL不同待測菌的孢子懸浮液，以接種無菌水作為對照。接種后的藍莓果實置于25 ℃下存放5 d，觀察果實發病情況，計算發病面積，進行待測菌株致病能力評價。

病斑面積按π2計算（為病斑直徑的一半）。藍莓果實總面積按4π2計算（為藍莓橫徑的一半）。

致病力等級劃分：按病斑面積占藍莓果實總面積的比值將致病力劃分為5個等級，其中病斑面積占藍莓果實總面積等于0%為0級、大于0%且小于等于5%為1級（弱）、大于5%且小于等于10%為2級（較弱）、大于10%且小于等于15%為3級（一般）、大于15%且小于等于20%為4級（較強）、大于20%為5級（強）。

1.3.3 鏈格孢屬真菌初篩方法

采用ITS序列比對進行分離菌株屬水平分析，從中篩選得到鏈格孢屬真菌。

DNA提取，DNA提取試劑盒（萬類生物科技有限公司）；DNA純度檢測，NanoDrop 2000。

PCR擴增及產物測序：25 μL PCR反應體系，2 × GoTaq Green Master Mix（美國 Promega公司）12.5 μL，正向引物和反向引物各1.0 μL（10 μmol/L），模板DNA 1.0 μL，ddH2O補足至25 μL。引物為ITS5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。PCR擴增產物經質量分數為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，送至上海生工生物有限公司測序。

1.3.4 鏈格孢屬真菌種水平鑒定方法

采用ATP系統發育分析法及形態學觀察共同來進行鏈格孢屬真菌種水平鑒定。ATP序列分析參照Lawrence等[16]、Zhu等[17]以及Elfar等[18]的方法。鏈格孢形態鑒定方法參照Simmons等[22]的方法。

ATP序列擴增引物為ATPDF1（5'-ATCGTCTC CATGACCGAGTTCG-3'）和ATPDR1（5'-TCCGAT GGAGTTCATGATAGCC-3'）。PCR擴增產物經質量分數為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，送至上海生工生物有限公司進行測序。相關文獻中涉及的參考菌株及外群菌株的ATP序列在Genebank中下載。將供試菌株與參考菌株的ATP基因進行對位排列（Clustal X 2.1軟件），采用MEGA X軟件構建系統發育樹。

代表菌株的形態學觀察以PDA平板上的菌落形態及PCA上的分生孢子鏈特性為主。以在PDA、溫度為28 ℃、黑暗條件下培養5 d的菌落作為觀察對象，對其大小、形態、顏色進行描述。PCA上觀察分生孢子鏈特性的方法：需將滅菌后的載玻片置于90 mm培養皿中；之后向培養皿內倒入一層薄薄的PCA培養基；再將代表菌株接種于含PCA的載玻片上，在溫度為28 ℃，光暗交替條件下培養至產孢后將載玻片取出；利用OLympus BX43光學顯微鏡觀察孢子成鏈特性進行觀察。

1.3.5 L-精氨酸和山梨酸鉀對不同鏈格孢代表菌株的抑制效果比較方法

采用平板抑菌法測定藥劑對菌株的抑制效果。參考劉闖[10]的方法，分別將不同濃度的L?精氨酸和不同濃度的山梨酸鉀混入PDA培養基，配成最終質量濃度分別為100、200、400、800、1 500、2 000 μg/mL含L?精氨酸的PDA平板和最終質量濃度分別為125、250、500、1 000、2 000、4 000、8 000 μg/mL含山梨酸鉀的PDA平板。對照組為不含藥劑的PDA平板。分別將靶標菌接種在供試平板上，每個處理3次重復，放置于25 ℃恒溫培養箱，5 d后測定菌落直徑。抑菌率（）計算公式：=（0?1）/（0?2）×100%。其中，0為對照組直徑，1為處理組直徑，2為菌餅直徑。用Excel繪制L-精氨酸和山梨酸鉀對供試菌株抑菌效果的回歸曲線圖，獲得毒力回歸方程、相關系數及EC50值，根據EC50值來評價待測藥劑對供試菌株的毒力大小。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離、致病力測定及鏈格孢屬真菌初篩結果

從腐爛藍莓果實中共分離獲得78個菌株。致病力測定結果表明，致病力2級及以下的菌株有10株，致病力3級的菌株有44株，致病力4級的有21株，致病力5級的有3株。由于鏈格孢為重要的產毒真菌，因此本研究對其進行了重點研究。采用ITS序列比對發現，78株菌中有34株鏈格孢屬真菌，其中致病力2級的有2株，致病力3級的有21株，致病力4級的有8株，致病力5級的有3株。

2.2 鏈格孢種水平鑒定結果

基于ATP序列構建供試鏈格孢菌株與參考菌株的系統發育樹（圖1），以作為外群。結果表明B20190623E3等23個菌株與細極鏈格孢（）處于同一分支；B20190623B1等7個菌株與互隔交鏈孢（）處于同一分支；B20190623C1等4個菌株與云南鐵杉鏈格孢（）處于同一分支。模式菌株信息詳見表1。

與屬于同一分支的23株菌中，致病力3級的有16株，致病力4級的有4株，致病力5級有1株；與屬于同一分支的7株菌中，致病力3級的有4株，致病力4級有3株；與屬于同一分支的4株菌中，致病力5級的有2株，致病力4級和3級的各1株。

因致病力3級和4級的占比較多，因此各分支代表菌株篩選時重點考慮致病力3級菌和4級菌?；谝陨显瓌t，菌株B20190623E3被挑選出作為的代表菌株，致病力3級；菌株B20190623B1作為的代表菌株，致病力3級；菌株B20190623C1作為的代表菌株，致病力4級，并對3株代表菌進行形態學觀察與鑒定。

表1 鏈格孢屬參考菌株相關信息

Tab.1 Information on reference strains of Alternaria

供試3株代表菌株在25 ℃下在PDA上生長速度較快，7 d后直徑約80 mm。其中B20190623E3（）菌落顏色呈淺灰色至暗青褐色，菌株B20190623B1（）顏色呈灰白色至暗青褐色，菌株B20190623C1（）菌落顏色呈灰黑色至暗青褐色。在PCA培養條件下，B20190623E3（）孢子鏈為長直鏈，多數分生孢子長鏈不分支，長鏈可超過10個孢子；B20190623B1（）和菌株B20190623C1（）孢子鏈為短支鏈，分生孢子單生或短鏈生，多支鏈，支鏈一般長1～5個孢子。利用在PCA培養基上的分生孢子鏈和分生孢子的形態特征可明顯區分為3個代表菌株。3株鏈格孢代表菌株的形態特征見圖2。

的分生孢子較小，約占分生孢子大小的一半。分生孢子呈倒棍棒形或長橢圓形，顏色呈淡褐色至中褐色，處于鏈基部的孢子，有時表面生明顯的疣突，成熟分生孢子具4～7個橫隔膜，1～4個縱或斜隔膜，1～4個主橫隔，且主橫隔因較粗而色深，更為醒目，孢身尺寸為（23.0～41.5）μm×（8.5～12.0）μm，假喙尺寸為（3.5～12.0）μm×（2.0～4.5）μm。分生孢子呈倒棍棒形、卵形、倒梨形或近橢圓形，顏色為淡褐色至褐色，表面光滑或具微刺，具有3～8個橫隔膜和1～4個縱、斜隔膜，孢身尺寸為（22.5～40.0）μm× （8.0～13.5）μm。分生孢子多數為卵形，具有1～3個橫隔和1個縱隔，孢身尺寸為（10～20）μm×（6～10）μm。

結合ATP系統發育分析結果及對比SIMMONS等[22]的形態學鑒定指導，供試鏈格孢菌可分為3個種群，分別為和。

2.3 L-精氨酸和山梨酸鉀對供試鏈格孢菌株的抑制效果

L-精氨酸與山梨酸鉀對鏈格孢3株代表菌的抑制結果見圖3、圖4、表2和表3。

L-精氨酸對、、的毒力回歸方程分別為=2.439 7?1.108 9（相關系數=0.891）、=2.661 3?1.693 8 （=0.915 3）、=2.897 9?2.994 8（=0.855 3）。山梨酸鉀對3株病原菌的毒力回歸方程分別為=3.225 1? 4.112（=0.955 9）、=1.933 8?0.683 5（=0.802 9）、= 2.302?1.615（=0.924 4）。L-精氨酸對3個代表菌株和的EC50值分別為319.080 3、327.491 5和573.852 1 μg/mL。而山梨酸鉀對供試菌株的EC50值分別為668.805 7、868.960 4、747.480 7 μg/mL。結果表明L-精氨酸對供試菌株的抑制效果好于山梨酸鉀對供試菌株的抑制效果。

圖2 鏈格孢3株代表菌株的形態特征

圖3 L-精氨酸對供試菌株的抑菌試驗

圖4 山梨酸鉀對供試菌株的抑菌試驗

表2 不同質量濃度的L-精氨酸對供試菌株的菌落直徑的影響（5 d）

Tab.2 Effect of different concentrations of L-arginine on colony growth of pathogens (5 d)

表3 不同濃度的山梨酸鉀對供試菌株的菌落直徑的影響（5 d）

Tab.3 Effect of different concentrations of potassium sorbate on colony growth of pathogens (5 d)

3 結語

鏈格孢屬真菌是引起采后藍莓腐爛的主要致腐病菌之一，同時作為一種產毒真菌，其威脅的不僅是采后藍莓果實的品質，帶毒原料進入加工領域還會威脅人和動物的健康。因此對藍莓致腐鏈格孢種群及相關特性的研究可為精準篩選靶標菌株提供依據。為后續藍莓采后抑菌劑的開發及效果評價提供更具代表性的靶標菌。

本研究分析了分離自藍莓病果的34株鏈格孢菌，所有菌株均有致病性，大部分菌株的致病力為3級，少數菌株具有較強致病能力，達到5級。供試34株菌分別屬于3個種群，分別為、和。其中.為優勢菌群，而為引起藍莓果實腐爛的新紀錄種。篩選出菌株B20190623E3（代表菌株）、菌株B20190623B1（代表菌株）、菌株B20190623C1（代表菌株）作為靶標菌，為今后采后藍莓抑菌劑的研發提供更具代表性的靶標菌株。

在此基礎上，本研究進一步對比了L-精氨酸與食品領域常用抑菌劑山梨酸鉀的抑制效果。結果表明，L-精氨酸對供試菌株的抑制效果強于山梨酸鉀，其對和的EC50值分別為319.080 3、327.491 5和573.852 1 μg/mL，明顯好于山梨酸鉀的抑制效果。該研究為后續采用L-精氨酸處理果實防治藍莓鏈格孢腐爛病提供了前期研究基礎。

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Effect of L-arginine on theTargets Causing Postharvest Blueberry Rot

WANG Jiaqia,b, YANG Xuea,b, ZHAO Runana,b, ZHU Xunfeia,b, LIU Chuangb, ZHANG Shuangb, YAN Xueruia,b*

(a. College of Food Science, b. Key Laboratory of Protected Horticulture, Ministry of Education, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

The work aims to screen out thetargets causing postharvest blueberries rot and compare the inhibition effects of L-arginine and potassium sorbate on thosetargets, so as to provide a preliminary basis for the prevention and control of postharvest blueberries rot caused bytargets. Tissue separation and single spore separation were used to isolate thetargets. ITS and ATP sequence analysis were adopted for the genus level identification and the species level identification, respectively. Plate inhibition method was used to compare the inhibition effects of L-arginine and potassium sorbate. Allisolates had pathogenicity and were distinguished to 3species, including,and. B20190623E3, B20190623B1 and B20190623C1 were selected out as targets for differentspecies. L-arginine had better inhibition effects than potassium sorbate ontargets. All the testedtargets are pathogenic, andis the dominant causing postharvest rot of blueberry.is a new record species causing blueberry rot. Three representative targets ofare screened. L-arginine has a good inhibition effect oncausing postharvest rot of blueberry.

blueberry;species; pathogenicity; L-arginine; inhibition effect

S608

A

1001-3563(2024)03-0091-08

10.19554/j.cnki.1001-3563.2024.03.011

2023-11-10

國家重點研發計劃（2022YFD1600500）；遼寧省興遼英才計劃資助項目（XLYC2002053）；遼寧省重點研發項目（2019JH2/10200009）