熒光探幽：聚集誘導發光在體外診斷領域的應用

解巧麗 李亞偉 劉勇 王志明

聚集誘導發光（aggregation-induced emission， AIE）材料具有良好的生物安全性、優異的光學性質、出色的光敏性能、獨特的單分子多功能性以及易于合成和功能化修飾等特點，在環境監測、食品質量控制、健康診斷、生物成像、光電器件、光學診療等領域受到青睞?；贏IE材料的體外診斷產品，如即時檢測產品、化學發光檢測產品、分子檢測產品以及免疫組織化學產品已被逐步開發出來。

即時檢驗產品

即時檢驗（point-of-care testing， POCT），其特征是檢測時間短，占用空間小，對檢測操作者的要求低。POCT應用項目從最初的血糖檢測、妊娠檢測，擴展到免疫快速分析檢測、分子快速分析檢測以及血氣檢測。其中，免疫快速分析檢測是一種結合了免疫學原理和層析技術的創新性的方法。免疫標志物與疾病之間關系的不斷發現，快速推動了該方法學的發展。

免疫層析技術（immunochromatographic assay， ICA）是建立在層析技術和免疫學反應基礎上的一種快速免疫分析技術。免疫層析產品通常以硝酸纖維膜為特異性抗體（或抗原）固化載體，以結合墊為標記探針載體，通過毛細管作用使液體樣本在層析試紙條上移動，在載體上發生特異性抗原抗體反應，根據檢測線的信號情況來對樣本進行定性、半定量或定量分析。

標記材料的發展，決定了免疫層析技術的發展方向。第一代標記材料以膠體金、乳膠微球為代表，免疫層析產品則主要用來進行定性或半定量分析。而熒光標記材料作為第二代標記材料，實現了對待測物的定量分析，相比于耗時久的生化檢測方法及依賴大型儀器的質譜分析技術，更能滿足日益增長的即時檢測需求，早已成為快檢產品開發的首選材料之一。相比于傳統的膠體金免疫層析檢測技術，熒光免疫層析具有更高的靈敏度和準確度，并且便于與小型化儀器結合，實現精確的定量分析。

AIE熒光微球是將AIE熒光分子包裹在聚苯乙烯微球中而制備的高性能標記材料，具有量子產率高、光穩定性好、抗光漂白能力強等特點。利用材料性能的優勢，并將其轉變成產品優勢，AIE免疫層析產品具有高靈敏度、高準確性和高可靠性等特點。

以AIE標記材料開發的用于新冠病毒（SARS- CoV-2）抗體的免疫層析快速診斷方法，將AIE810nm分子包入聚苯乙烯微球中制成約300納米的熒光微球，然后在表面修飾上病毒蛋白抗原，利用智能手機的攝像頭就可看到其與血液樣本反應后在試紙條上的特定位置顯示出熒光條帶[1]。與膠體金相比，AIE標記材料對病毒抗體IgM和IgG的檢出限（即在樣品中能檢出的被測組分的最低濃度）更低，靈敏度也更高，能更早發現感染。

尿液中有許多可以反映疾病的成分，如尿微量白蛋白可用于早期慢性腎臟疾病的篩查，尿白細胞則可以反映身體局部有無感染或炎癥的發生。一種基于尿液樣本檢測開發的使用AIE標記材料的即時檢測方法[2]，利用尿微量白蛋白和白細胞疏水作用或靜電作用激活AIE探針的熒光特性，只需20分鐘左右，即可通過智能手機攝像裝置觀察到尿液中的尿微量白蛋白和白細胞。其原理是水分蒸發過程中，尿微量白蛋白擴散形成環形印跡，而白細胞大部分集中分布在中心區域，它們的分布顯現出“咖啡環效應”。該方法可結合儀器對尿微量白蛋白和白細胞進行定量分析，實現早期慢性腎臟疾病的篩查。

化學發光產品

化學發光技術具有全自動化、高靈敏度、無須外界激發光源等優點，已廣泛應用于生物檢測領域。由于化學發光是超微弱發光，所以一般通過化學發光共振能量轉移（chemiluminescence resonance energy transfer， CRET）來增強發光的強度，改變發射波長或者發光時間。熒光分子在吸收能量后，會躍遷到激發態，而被用作能量接受體。但傳統有機熒光分子都具有聚集誘導猝滅效應，在高濃度下發光效率受到一定限制。

AIE材料被發現后，其在聚集狀態的優異發光特點受到了廣泛關注和研究。例如，研究人員通過將AIE熒光分子作為CRET受體，以化學發光體系“過氧草酸酯-過氧化氫”為能量供體，構建了高效的CRET體系[3]，并提出了一種陽離子AIE表面活性劑介導魯米諾發光體系的策略[4]，構建了高強度、長壽命的輝光型化學發光體系。該體系通過制備具有AIE性質的陽離子表面活性劑分子C8-TPE-C4TAB，誘導魯米諾發光體系產生高強度、長壽命的輝光（持續時間超過1小時）。其化學發光強度增敏主要源自兩方面：一是膠束表面靜電作用誘導反應物富集，提高反應效率；二是AIE熒光受體與激發態魯米諾距離短，具有超高的CRET效率。而長壽命化學發光特性則主要是因為中性環境下極低的過氧化陰離子摩爾分數延長了化學反應時間，且AIE膠束增加了溶液黏度，有助于減慢擴散速度。

AIE材料的獨特性質給化學發光產品帶來了新的突破，給更高效、更穩定的化學發光產品奠定了基礎，進而為未來的科技應用提供更多可能性。

分子檢測產品

分子檢測實驗主要用于檢測基因、蛋白質和其他生物分子的表達和功能，在生物醫學研究中有重要作用。實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR， RT-qPCR）是指在PCR（polymerase chain reaction，聚合酶鏈式反應）體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對模板進行定量分析的方法。常用的定量PCR方法有染料法和探針法。

染料法（常用熒光染料SYBR GreenⅠ，這是一種具有綠色激發波長的染料） 在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，該染料特異性地摻入DNA雙鏈后發射熒光信號，而沒有摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。

探針法（常用TaqMan探針，這是一種熒光標記的水解探針） TaqMan探針具有“啞鈴”型結構，其報告基團發射的熒光信號會被猝滅基團吸收；當發生PCR擴增時，Taq酶會將TaqMan探針酶切降解，使熒光報告基團和猝滅基團分離，熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物的形成基本同步。

商業雙鏈DNA（double stranded DNA， dsDNA）結合染料（如SYBR GreenⅠ）在自由狀態下發光較弱，但插入dsDNA序列后發光增強。它們的發光強度隨著DNA的指數擴增而定量增加。然而，短斯托克斯位移（<30納米，斯托克斯位移是指熒光光譜較相應的吸收光譜紅移的現象）使得吸收和發射光譜之間有很大的重疊，從而導致自吸收或內濾效應，降低了信噪比和檢測靈敏度。與SYBR Green熒光染料相比，AIE熒光材料具有更大的斯托克斯位移（>100納米），從而防止了光譜重疊或內濾效應以及聚集引起的猝滅，提高了靈敏度。

基于聚集誘導發光分子（AIEgen）的探針在核酸檢測中有重要應用[5]。探針由兩部分組成，產生熒光信號的AIE活性基團和與DNA結合的靶向基團。與SYBR Green類似，基于AIEgen的DNA探針在自由狀態下發光較弱，但與dsDNA結合后發光增強。研究人員基于AIE原理，利用銥配合物開發了一種簡單的單步熒光檢測SARS-CoV-2 RNA的方法：巧妙設計的銥探針在有SARS-CoV-2 RNA的情況下“開啟”熒光，并在室溫下10分鐘內給出準確結果，檢測限低至1.84個基因拷貝[6]。研究人員還測試了20例臨床樣本，該方法的敏感度和特異度分別為90%和80%。

利用AIE材料的性能，分子檢測可以實現更高的靈敏度，推動了技術水平的提升，也將為醫學診斷等領域提供更加創新和可靠的解決方案。

免疫組織化學產品

免疫組織化學（immunohistochemistry， IHC）是利用抗原抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體（或抗原）的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色以確定組織、細胞內抗原（或抗體）的所在位置及其性質，并可利用熒光定量技術計算其含量，以此對組織切片或細胞標本中的該抗原（或抗體）組分進行定位、定性或定量的一種原位檢測技術。IHC能為研究人員提供目標物質在細胞和組織中的功能及分布，以及腫瘤等其他疾病的進行程度、藥物療效等信息。

研究人員[7]將具有AIE特性的分子作為發光基元與疏水基團和生物相容性好的親水基團偶聯，制成具有AIE特性的新型納米粒子NDSA@SALL4，并在表面修飾上SALL4（一種調控胚胎腹部運動神經元發育的重要轉錄因子）蛋白抗體。該納米粒子在水中發射較強的橙色熒光，當利用它對癌組織及匹配的癌旁組織標本進行免疫熒光染色，它可以特異性地靶向肝癌細胞及肝癌組織，并富集在細胞核中，發出明亮的橙黃色熒光。該方法對原發性肝癌組織免疫熒光染色的靈敏度和特異度優于IHC染色，為早期檢測肝癌細胞提供了一種新方式。

聚集誘導發光材料由于熒光信號強度高且不易猝滅，還可以應用于多重免疫組織化學/免疫熒光（multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence， mIHC/IF），在檢測低豐度樣品時，可大幅提高檢測靈敏度。mIHC在一張組織切片上最多可以對7個生物標志物進行免疫熒光染色，對組織內細胞的組成、定位、功能等信息進行定量評估，并對細胞間原位空間等信息進行全景式描繪。AIE材料助力mIHC技術，對患者腫瘤標志物的檢測分析、腫瘤免疫分型、精準篩查等具有重要應用價值。

醫藥及光學診療領域中的應用

近年來，AIE材料亦在生物領域大放光彩，并取得了突破性進展。同時，AIE聚合物也有著優異的表現，如結構多樣性、功能可調及優異的光動力/光熱性能，使其在藥物/基因遞送、疾病治療等應用中擁有良好的發展前景。

利用聚集誘導發光效應可以跟蹤細胞內藥物載體的動態軌跡。而熒光共振能量轉移（fluorescence resonance energy transfer， FRET）可用于監測成像系統可視化動態過程，利用藥物載體與藥物之間的FRET效應可以研究載體在細胞內的釋放過程[8]。研究人員研制出一種同時具有AIE效應和FRET效應的超分子藥物載體HG/CD（負載抗癌藥物阿霉素），進行藥物載體的動態軌跡和藥物釋放過程的監測，研究結果表明該體系對癌癥有良好的治療作用[9]。

光動力治療（photodynamic therapy， PDT）是利用特定波長的光激發光敏劑產生強氧化性的活性氧（reactive oxygen species， ROS），從而氧化破壞組織和細胞中的各類生物大分子，使病變部位的細胞發生不可逆損傷甚至死亡的一種新技術。光敏劑是PDT的關鍵，其ROS產生效率的高低直接影響PDT效果。不同于傳統光敏劑，AIE聚合物不僅具有良好的光照敏化產生ROS的能力，并且光敏性能會隨著聚集體的生成而不斷增強，目前已經應用于診療一體化中。研究人員基于不同微生物細胞壁結構的差異，設計制備了一系列AIE聚合物。經細菌實驗表明，該AIE聚合物具有良好的光敏化產生ROS的能力，并能高效殺滅所結合的微生物，且沒有產生耐藥性[10]。

AIE作為發光領域的“奇兵”，其自生的發光行為在很大程度上可以滿足體外診斷領域的信號輸出需求。不論是市場普遍需求的免疫層析產品，還是具有前沿創新的新型POCT產品、開拓性的化學發光增強劑、分子診斷探針，用于病理檢測的免疫組化產品，以及可診療一體化的多功能產品，AIE都已凸顯出了應用潛質，證明了其作為新材料發展核心驅動力的價值。當然，AIE材料作為底層技術的創新及發展，雖然獲得了諸多實驗室研究的認可，并且在商品化方面邁出了第一步，但是想要引領未來產業發展，還須克服許多市場化的困難。作為真正的“中國原創”科學理論和體系，AIE材料及技術未來的產業轉化道路將持續創新，實現原創技術的高質量發展。

[1]Chen R， Ren C， Liu M， et al. Early detection of SARS-CoV-2 seroconversion in humans with aggregation-induced near-infrared emission nano-particle-labeled lateral flow immunoassay. ACS Nano， 2021， 15（5）： 8996-9004.

[2]Guan S， Fu Q， Wang D， et al. Point-of-care urinalysis with one drop of sample using an aggregation-induced emission luminogen under the coffee-ring effect. ACS Sensors， 2022， 7（11）： 3481-3490.

[3]呂超. 聚集誘導發光在化學發光共振能量轉移中的應用. 中國化學會第十三屆全國分析化學年會論文集（二），2018.

[4]Yu Y， Yuan Z， Lu C. Long-lasting chemiluminescence by aggregation-induced emission surfactant with ultralow critical micelle concentration. Aggregate， 2023： e349.

[5]Liu Z， Meng T， Tang X， et al. The promise of aggregation-induced emission luminogens for detecting COVID-19. Frontiers in Immunology， 2021， 12： 635558.

[6]Gupta A， Adarsh T， Manchanda V， et al. COVID-19 detection using AIE-active iridium complexes. Dalton Transactions， 2023， 52（5）： 1188-1192.

[7]邵玥明. SALL4在原發性肝癌中的表達及其納米熒光檢測體系的構建. 長春： 吉林大學， 2021.

[8]Yuan Y， Liu B. Visualization of drug delivery processes using AIEgens. Chemical Science， 2017， 8（4）： 2537-2546.

[9]Dong Z， Bi Y， Cui H， et al. AIE supramolecular assembly with FRET effect for visualizing drug delivery. ACS Applied Materials& Interfaces， 2019， 11（27）： 23840-23847.

[10]Qi G， Hu F， Kenry， et al. Bacterium-templated polymer for self‐selective ablation of multidrug-resistant bacteria. Advanced Functional Materials， 2020， 30（31）： 2001338.

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