液相色譜儀計量性能期間核查

李大偉，許誠，張利明，王春民，夏瑜

（1.蘇州市疾病預防控制中心，江蘇蘇州 215004； 2.蘇州市計量測試院，江蘇蘇州 215100）

液相色譜儀是化學分析檢測實驗室最常用的一種設備，在食品檢測領域，主要用于食品營養成分檢測[1]、食品添加劑檢測[2-4]、農藥殘留檢測[5-8]、微生物代謝物檢測[9-11]等；此外，在水環境監測領域，主要用于陰離子檢測[12]、有機物質檢測[13-14]、污染物質檢測[15-16]等。分析檢測實驗室的最終產品就是檢測報告，然而檢測數據的準確性和有效性會直接影響到所出具的檢測報告的正確性和法律效力[17-18]。為了保證實驗室檢測數據的準確性，除了外部的能力驗證、計量比對以外，實驗室內部的儀器設備期間核查也是一個重要的核查手段。期間核查是檢查被核查對象是否保持原校準/檢定的狀態，維持其最佳溯源/測量能力，以便及時發現被核查對象的失準程度，以保證檢測數據的準確可靠[19-20]。

實驗室對液相色譜儀的期間核查，可根據使用需求的具體情況而采取相應的核查方法，如用咖啡因標準品帶入儀器檢測，計算示值誤差，與判定標準進行比較；然而很少有人對液相色譜儀計量性能做過系統的期間核查。筆者參照JJG 705—2014《液相色譜儀》并結合自身的工作經驗，對液相色譜儀計量性能的期間核查進行了探討。該方法的實驗數據可為實驗室液相色譜儀管理者提供儀器評價依據，同時也為食品、藥品企業驗證液相色譜儀計量性能提供參照依據。

1 期間核查的準備

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：Waters 2695 型，配備二極管陣列檢測器(2996 PAD)，美國沃特世公司。

液相色譜液體流量計：5025000 型，英國GJC Instruments公司。

超純水儀：Milli-Q型，美國密理博公司。

丙酮、異丙醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

紫外分光光度計校準用標準溶液：編號為GBW(E) 130066，中國計量科學研究院。

萘的甲醇標準溶液：(1) 1.00×10-4g/mL，編號為GBW (E) 130167；(2) 1.00×10-7g/mL，編號為GBW(E) 130168。中國計量科學研究院。

甲醇：色譜純，德國默克公司。

1.2 溶液配制

丙酮溶液：丙酮體積分數為0.1%，準確量取1 mL丙酮，轉移至1 000 mL容量瓶中，加入超純水定容至標線?，F配現用。

異丙醇溶液：異丙醇體積分數為2%，準確量取20 mL異丙醇，轉移至1 000 mL容量瓶中，加入超純水定容至標線。

丙酮-2%異丙醇系列混合溶液：先配制1.0%丙酮-2%異丙醇水溶液，再以此為母液進行稀釋。準確量取1 mL丙酮，轉移至100 mL容量瓶中，加入異丙醇溶液定容至標線，即為1.0%丙酮-2%異丙醇水溶液；再分別量取1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 mL母液，用2%異丙醇溶液定容于10 mL容量瓶中，得丙酮體積分數分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%的丙酮-2%異丙醇系列混合溶液?，F用現配。

2 期間核查的實施

2.1 泵流量設定值誤差SS和流量穩定性SR核查

JJG 705—2014中采用容量瓶收集流動相、秒表計時、天平稱量的方法來進行測定。該方法的準確度受較多因素影響，如容量瓶準確度等級、溫度對容量瓶容量準確度的影響，以及流動相的揮發性、秒表的誤差、天平的誤差、天平室的溫濕度的影響等，且該法操作繁瑣。變更方法：在流動相出口處采用兩通連接液體流量計，在液相色譜儀液晶面板或者工作站上設定流量分別為0.5、1.0、1.2 mL/min，從液體流量計上讀取流量測定值，測量數據見表1。測量相對誤差SS和穩定性SR分別按式(1)、式(2)計算：

表1 流量設定值、實測值、相對誤差、穩定性Tab.1 Set value, measured value, relative error and stability of flow

FS——流量設定值，mL/min；

Fmax——流量3次測量值的最大值，mL/min；

Fmin——流量3次測量值的最小值，mL/min。

2.2 梯度誤差核查

參照JJG 705—2014設置色譜條件。流動相：A通道為超純水，B通道為0.1%(體積分數)丙酮溶液，流量為2 mL/min；分析波長：254 nm。用兩通代替色譜柱。

開機后，以A通道(超純水)沖洗系統，待基線平穩后執行梯度洗脫程序，JJG 705—2014中未給出梯度洗脫程序的時間，筆者給出了如表2 所示的梯度洗脫程序。執行梯度洗脫程序時，利用色譜工作站軟件設置空針進樣，并記錄色譜圖，即梯度變化曲線如圖1所示。

圖1 流動相B不同體積分數時的信號值Fig.1 Signal values of different volume fraction mobile phase B

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution program

重復測量2次，記錄每一段階梯對應的Y軸響應信號值，第一次測量的6 段階梯信號值L1i分別為0.000 03、0.037 92、0.076 00、0.114 05、0.151 85、0.189 88，用后一個測定值減去前一個測定值得到5組數據，即(L1i-L1(i-1))的值；同理得出第二次測量的6段階梯信號值L2i和(L2i-L2(i-1))數據，利用式(3)～式(5)分別計算第i段階梯響應信號值的平均值■Li、5段階梯響應信號值的總平均值■Li及某段階梯的梯度誤差Gi。

梯度誤差測量值及計算結果見表3。

表3 梯度誤差測量值及計算結果Tab.3 Measured values and calculated results of gradient error

2.3 波長示值誤差和重復性核查

JJG 705—2014中，用注射器將紫外分光光度計校準用標準溶液從檢測器入口注入樣品池中，采用直接注入法，標準溶液用量大且容易造成檢測器污染，故對方法進行如下變更：流動相：A 通道，100%超純水，流量為1 mL/min；掃描波長：210～400 nm；用兩通代替色譜柱。進樣10 μL紫外分光光度計校準用標準溶液時的光譜掃描圖如圖2所示。

圖2中，波峰(或波谷)對應的波長與參考波長之差為波長示值誤差。每個波長重復測量3 次，其中最大值與最小值之差為波長重復性，測量結果見表4。

表4 波長示值誤差與波長重復性核查結果Tab.4 Verification result of wavelength indication error and wavelength repeatability

2.4 基線噪聲、基線漂移和最小檢測濃度核查

參照JJG 705—2014，在液相色譜儀工作站上測量出基線噪聲、30 min 內基線漂移分別為1.6×10-4、8×10-4，選用C18色譜柱，以100%甲醇為流動相，流量設為1.0 mL/min，檢測器波長設置為254 nm，進樣1.00×10-7g/mL 萘的甲醇標準溶液10 μL，記錄萘-甲醇色譜峰高，按照公式(6)計算最小檢測質量濃度：

式中：ρL——最小檢測質量濃度，g/mL；

Nd——基線噪聲；

ρ——萘的甲醇標準溶液質量濃度，g/mL；

V——進樣體積，V=10 μL；

H——萘-甲醇色譜峰高；

20——標準進樣體積，μL。

實驗測得1.00×10-7g/mL 的萘-甲醇標準溶液色譜峰高為725×10-6，代入式(6)，計算得ρL為2.2×10-8g/mL。

2.5 線性范圍核查

JJG 705—2014中，用注射器直接向檢測池中注射丙酮-2%異丙醇溶液，手動注入的速度難以保持恒定一致，結果重現性較差，并且手動注入容易造成檢測器污染。變更方法如下：流動相：2%異丙醇溶液，流量為1 mL/min；分析波長：254 nm；用兩通代替色譜柱。

選擇丙酮-2%異丙醇系列混合溶液(丙酮體積分數分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%)分別進樣測定，進樣體積均為10 μL，色譜圖如圖3 所示，得到的線性范圍數據如表5所示。

圖3 丙酮-2%異丙醇水溶液的色譜圖Fig.3 Chromatogram of acetone-2% isopropyl alcohol aqueous solution

表5 線性范圍核查試驗結果Tab.5 Verification result of linear range

表5 中，以丙酮體積分數分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和對應的色譜峰面積平均值進行線性回歸，得標準曲線線性方程y=1 246.8x-7.24，利用線性方程計算丙酮體積分數大于0.5%各濃度點的色譜峰面積，并與對應的色譜峰面積測量平均值比較，計算出相對誤差，以相對誤差大于5%所對應的丙酮體積分數作為檢測上限φH，由表5可知φH為0.6%。參照文獻[21]，將低濃度(丙酮體積分數為0.1%)丙酮-2%異丙醇溶液稀釋至100倍體積后進樣(10 μL)測定，測得色譜峰高為159×10-6，基線噪聲為6×10-5，按照式(7)計算的φL為3.8×10-6，根據JJG 705—2014，以φH/φL作為線性范圍，計算結果為1 578.9。

式中：φL——丙酮最小檢測體積分數，%；

Nd——基線噪聲；

φ——丙酮-2%異丙醇溶液稀釋后丙酮的體積分數，φ=1.0×10-5；

V——進樣體積，V=10 μL；

H——萘-甲醇色譜峰高；

20——標準進樣體積，μL。

2.6 定性、定量重復性核查

按照2.4 色譜條件，連續進樣質量濃度為1.00×10-4g/mL的萘-甲醇溶液6次，記錄色譜峰面積和保留時間，計算對應的相對標準偏差，結果列于表6。定性重復性用色譜保留時間的相對標準偏差表示；定量重復性用色譜峰面積的相對標準偏差表示。由表6可知，定性重復性為0.5%，定量重復性為0.8%。

表6 定性、定量重復性核查試驗結果Tab.6 Verification result of qualitative and quantitative repeatability

3 核查結果判定

綜合泵流量設定值誤差、流量穩定性、梯度誤差、波長示值誤差、波長重復性、基線噪聲、基線漂移、最小檢測質量濃度、線性范圍、定性重復性、定量重復性11 個方面的核查數據，結果表明，以上11 個方面的核查結果均符合JJG 705—2014 中對液相色譜儀計量性能的要求(表7)。

表7 液相色譜儀計量性能技術要求Tab.7 Technical requirements for metrological performance of liquid chromatography