桑寄生配方顆粒中槲皮苷近紅外定量分析模型的建立

籍瑞芳，劉會，史敏，林超

（濟南市食品藥品檢驗檢測中心，濟南 250102）

桑寄生配方顆粒是以中藥飲片桑寄生為原料，經水提、濃縮、干燥、制粒等現代生產工藝制成的新型中藥顆粒劑，經中醫臨床配方后，與其它配方顆粒一起沖服使用[1]。由于配方顆粒具有方便沖服、易于攜帶、安全衛生等特點，現已成為中藥飲片的重要替代品。特別是在2021年11月1日《關于結束中藥配方顆粒試點工作的公告》正式實施之后，中藥配方顆粒迎來了更加廣闊的發展空間[2]。目前臨床常用的飲片品種約為400 個，已頒布國家藥品標準的配方顆粒品種有248 個，已頒布山東省藥品標準的配方顆粒品種有366 個，可見60%以上的臨床常用飲片可以用配方顆粒代替。常規檢驗方法對配方顆粒市場可以起到監督和評價作用，但面對日益擴大的市場，這些方法往往耗時較長、操作復雜、對實驗環境要求較嚴格，難以應對快速增長的市場需求，因此需要建立一種能夠滿足大批量快速檢驗要求的方法。

近紅外光譜(NIRS)法是通過測定物質在近紅外光譜區的特征光譜，利用化學計量學方法提取相關信息，對物質進行定性和定量分析的光譜分析技術[3]。由于該方法具有對樣品無破壞、操作簡單、不產生毒害物質、高效便捷等優點，現已廣泛應用于農產品、中藥材、生物制品、化工產品等領域，而用于配方顆粒質量研究文獻報道較少。孫夏榮等[4]利用近紅外光譜對當歸配方顆粒進行了一致性檢驗；李軍山等[5]通過近紅外光譜建立了赤芍配方顆粒中芍藥苷和浸出物的含量測定模型，為配方顆粒的定性、定量分析開辟了新方法。由于近紅外光譜基頻振動弱，吸收峰重疊，需要利用化學計量學方法提取相關信息，目前研究的重點集中在探索更加準確的分析方法，建立穩定的分析模型。

桑寄生中的主要藥物活性成分為黃酮類化合物[6]，桑寄生配方顆粒的國家藥品標準的含量測定項下是以槲皮苷為指標物質。筆者將桑寄生配方顆粒通過高效液相色譜(HPLC)法測定的槲皮苷含量值與其近紅外光譜相關聯，利用偏最小二乘(PLS)法，建立桑寄生配方顆粒中槲皮苷的定量分析模型，并對模型進行了驗證，為快速測定桑寄生配方顆粒中槲皮苷的含量提供了參考方法，為實現對中藥配方顆粒的現場鑒定及提高藥品質量監管水平提供有力的技術支持。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1200 型，附有ChemStation工作站，美國安捷倫科技有限公司。

電子天平：(1) MS205DU 型，感量為0.01 mg；(2) MS204TS/02 型，感量為0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器公司。

數控超聲波清洗器：KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司。

傅里葉變換近紅外光譜儀：MATRIX-F 型，配漫反射光纖探頭和OPUS 5.0分析軟件，德國布魯克光譜儀器公司。

槲皮苷對照品：純度(質量分數)為93.5%，批號為111538-202007，中國食品藥品檢定研究院。

桑寄生配方顆粒樣品：共90批，市售。

乙腈：色譜純，安徽天地高純溶劑有限公司。

乙醇：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 高效液相色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱(50 mm×4.6 mm，1.8 μm，美國安捷倫科技有限公司)；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液，體積比為20∶80，流量為1.0 mL/min；檢測波長：350 nm；柱溫：30 ℃；進樣體積：2 μL。

1.2.2 槲皮苷對照品溶液制備

取槲皮苷對照品9.51 mg，置于100 mL 容量瓶中，加入稀乙醇溶解并稀釋至標線，搖勻，配制成槲皮苷質量濃度為88.92 μg/mL的槲皮苷對照品溶液。

1.2.3 桑寄生配方顆粒樣品溶液制備

取桑寄生配方顆粒，研細，精密稱取約0.2 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，稱定質量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，作為桑寄生配方顆粒樣品溶液。

1.2.4 槲皮苷含量測定

分別精密吸取槲皮苷對照品溶液和桑寄生配方顆粒樣品溶液，按1.2.1 色譜條件進樣測定，采用色譜峰面積外標法計算90 批桑寄生配方顆粒樣品中槲皮苷的含量。

1.2.5 近紅外光譜的采集

取桑寄生配方顆粒樣品，研細，裝入塑料袋中，將光纖探頭在塑料袋外，對準顆粒直接進行光譜測定，采集近紅外光譜。采集光譜范圍為4 000～12 000 cm-1，分辨率為8 cm-1，掃描次數為32次。每份樣品測定3 次，取其平均光譜數據用于建立定量分析模型。

1.2.6 定量分析模型建立

通過主成分分析(PCA)法結合HotellingT2方法[7]剔除異常紅外光譜樣本，優選出最佳的樣本劃分方法，將HPLC 法測得的桑寄生配方顆粒樣品中的槲皮苷含量與其近紅外光譜相結合，采用PLS法，用校正集樣本建立桑寄生配方顆粒中槲皮苷的定量分析模型，并用驗證集樣本對該模型進行驗證。在近紅外定量分析模型中，交叉檢驗均方根誤差(RMSECV)、預測均方根誤差(RMSEP)和決定系數(R2)是衡量模型的重要依據。其中RMSECV 和RMSEP 值越小，表明模型結構越合理，預測值與參考值的差異越小；R2越接近100%，證明模型的預測值與樣品參考值的相關性越好，模型的準確性越高[8]。

2 結果與討論

2.1 樣品中槲皮苷含量HPLC法測定值

槲皮苷的含量測定方法采用國家藥品標準YBZ-PFKL-2021107 中桑寄生配方顆粒含量測定方法。槲皮苷的質量分數為3.768 2～7.199 7 mg/g。槲皮苷對照品溶液和樣品溶液的色譜圖如圖1 所示。HPLC法測定的含量值是建立定量分析模型的一級數據，也是判斷預測值是否準確的重要參考。

圖1 槲皮苷對照品溶液和桑寄生配方顆粒樣品溶液色譜圖Fig.1 Chromatograms of quercitrin reference solution（a） and Taxilli herba formula granule sample solution（b）

2.2 近紅外光譜圖

桑寄生配方顆粒樣品的近紅外光譜圖如圖2所示。90 批桑寄生配方顆粒樣品的近紅外光譜除吸收強度不同之外，峰形基本一致。

圖2 桑寄生配方顆粒的近紅外光譜圖Fig.2 Near-infrared spectrum of Taxilli herba formula granule

2.3 異常光譜剔除

在近紅外光譜采集過程中，由于環境溫度和濕度的變化、檢驗人員的操作失誤，以及樣品的厚度不均勻等因素，會導致異常光譜的出現，對模型精確度產生影響[9]，因此在建立模型之前，應當對異常光譜進行識別和剔除。

利用PCA法結合HotellingT2方法對90批桑寄生配方顆粒樣品的近紅外光譜進行異常樣本檢測，結果如圖3 所示。圖中18#樣本位于99%置信期間之外，為異常樣本，剔除18#樣本后得到89 份樣本，將其數據用于定量分析模型的建立。

圖3 桑寄生配方顆粒樣品近紅外光譜Hotelling T 2檢驗結果Fig.3 Hotelling T 2 test result of near-infrared spectrum of Taxilli herba formula granule

2.4 校正集與驗證集劃分

劃分校正集和驗證集的常用方法有隨機(RS)法、Kennard-Stone (KS)法和X-Y 聯合距離的樣本集劃分(SPXY)法。RS法即隨機選取一定量的樣本組成校正集和驗證集；KS法是通過計算光譜樣本間的歐氏距離，使在規定的樣本集內，樣本按照空間距離分布均勻，盡可能包含多樣的樣本信息；SPXY法以KS法為基礎，綜合考慮參考值變量，使樣本在光譜空間和參考值空間權重相同，從而使樣本集的分布更加均勻，改善模型的預測能力[10]。

將89 個樣本中的3/4 (67 個)作為校正集，1/4(22 個)作為驗證集，分別采用RS 法、KS 法和SPXY法進行劃分，在對光譜無預處理和全光譜條件下，對三種劃分方法進行評價，結果見表1。由表1數據可知，三種方法中，SPXY 法的RMSECV 值最小，R2值更接近100%，說明該方法劃分出的校正集和驗證集更加合理。67 個校正集樣本中槲皮苷的質量分數范圍為3.768 2～7.199 7 mg/g，包含了槲皮苷的最大值、最小值，其余22個樣本為驗證集，其槲皮苷的含量范圍均被校正集范圍包含，可用于判斷模型的預測能力。

表1 三種樣本劃分方法的結果Tab.1 Three sample partitioning methods results

2.5 光譜預處理方法選擇

光譜預處理能有效提取光譜中的有效信息，消除在采集過程中由于噪聲、背景、雜散光等因素產生的干擾信息，提高光譜模型的預測效果[11]。常用的光譜處理方法有原始光譜(NONE)法、線性補償差減(COE)法、直線差減(SLS)法、矢量歸一化(VN)法、最小-最大歸一(M-MN)法、多元散射校正(MSC)法、一階導數(FD)法、二階導數(SD)法等。在全光譜條件下，對上述幾種方法進行試驗，結果列于表2。由表2可知，VN法的RMSECV值最小，R2值最大，VN法可以消除光程變化導致的基線平移[12]。

表2 十二種光譜預處理方法的結果Tab.2 Results of twelve spectral pretreatment methods

2.6 光譜區間選擇

采用VN 法預處理光譜，選擇12 000～4 000 cm-1(全光譜)，7 502～4 597.6 cm-1(軟件自動優化功能選出的光譜區)以及7 256～6 817 cm-1、5 736～5 052 cm-1(槲皮苷的光譜疊加敏感區[13])分別進行試驗，結果列于表3。由表3 數據可知，最佳光譜區為7 502～4 597.6 cm-1。

表3 三種光譜區間的結果Tab.3 Results of three spectral intervals

2.7 主因子數選擇

定量分析模型的質量取決于所需因子的數量，主因子數太少會因擬合不足導致模型不能解釋全部特性，但主因子數太多會導致過度擬合而增加噪聲，降低模型的質量即預測能力[14]。

圖4 是在經VN 法預處理光譜，選用7 502～4 597.6 cm-1光譜區間條件下RMSECV 與主因子數的關系圖，當主因子數大于11 之后，RMSECV 值變化幅度變緩，所以最佳主因子數為11。

圖4 交叉檢驗均方根誤差與主因子數的相關圖Fig.4 Correlation graph of the root mean square error of cross validation with the number of principal components

2.8 定量分析模型建立

測定桑寄生配方顆粒樣品中槲皮苷含量的定量分析模型參數總結于表4。

表4 定量分析模型的參數Tab.4 Parameters of the quantitative analysis model

2.9 定量分析模型驗證

按照上述定量分析模型，對驗證集樣本中的槲皮苷含量進行預測，圖5 為HPLC 法測得桑寄生配方顆粒樣品中槲皮苷含量值與預測值的相關圖，模型的RMSEP 為0.132，R2為98.68%，剩余預測偏差(RPD)為8.98。如果RPD 大于10，說明所建模型可以準確預測所測成分的含量值；RPD在5～10之間，說明模型可以用于質量控制；RPD 在2.5～5 之間，說明模型只能對所測成分的含量值進行高低判斷[15]。

圖5 驗證集樣品預測值與高效液相色譜法測定值相關圖Fig.5 Correlation graph of the predicted value of the validation set sample and the determined value by HPLC

將預測值與HPLC測定值進行樣品配對t檢驗，設置信水平為95%，雙尾P值為0.191，大于0.05，表明使用HPLC法測得的槲皮苷含量值與用近紅外光譜法預測的含量值差異不明顯，所建立的近紅外定量分析模型可以準確預測桑寄生配方顆粒中的槲皮苷的含量。

3 結語

采用HPLC法測定桑寄生配方顆粒中槲皮苷的含量，使用近紅外光譜儀采集桑寄生配方顆粒的近紅外光譜，利用PCA法結合Hotelling T2方法剔除異常光譜，采用SPXY法劃分出校正集和驗證集，利用PLS法確立了桑寄生配方顆粒中槲皮苷含量測定的定量分析模型。該定量分析模型可快速完成大批量樣本的檢驗，有良好的預測能力，能夠滿足藥物的快速篩查。有利于各級藥監機構監督評價各個廠家生產的桑寄生配方顆粒的質量，有助于促進廠家生產工藝的規范化，提高產品質量。