高效液相色譜法測定化妝品原料中N-乙酰神經氨酸

刁飛燕，李俊婕，吳曉云，劉慧香，于海英，李啟艷

（山東省食品藥品檢驗研究院，國家藥品監督管理局化妝品原料質量控制重點實驗室，特色植物資源化妝品濟南市工程研究中心，產業技術基礎公共服務平臺，濟南 250101）

N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac)，通用名為唾液酸(SA)。唾液酸是一類母體結構為9個碳原子組成的神經氨酸，是廣泛存在于生物系統中的一類天然糖類化合物。在大部分哺乳動物中發現的唾液酸主要是N-乙酰神經氨酸，因此常把N-乙酰神經氨酸稱為唾液酸[1-2]，已被證實其具有抗病毒、抗氧化、抗衰老等多種生理功效[3-5]，在化妝品中常用作保濕劑、皮膚保護劑等。燕窩、牛奶、乳制品等是N-乙酰神經氨酸的主要天然來源[6-8]。N-乙酰神經氨酸在2021年通過化妝品新原料注冊備案，成為國產化妝品新原料。

目前N-乙酰神經氨酸的測定法主要有紫外可見分光光度法[9-10]、高效液相色譜法[11-12]、液相色譜-串聯質譜法[13-14]。比色法中采用間苯二酚顯色法測定N-乙酰神經氨酸含量，操作繁瑣，化妝品原料基質復雜，測定單一組分時易受干擾，導致測定結果偏高；而液相色譜-質譜法測定成本相對較高。目前尚無針對化妝品原料中N-乙酰神經氨酸測定的標準方法，難以保證原料的有效性、安全性。筆者選擇強陽離子SCX 色譜柱，優化樣品處理條件，利用高效液相色譜-二極管陣列檢測器進行測定，解決了該原料極性大，在一般反相色譜柱中不能保留的難題，為化妝品原料中N-乙酰神經氨酸的質量檢測提供了技術支持。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC-20AT 型，日本島津實驗器材有限公司。

電子天平：MS105DU 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒托利多公司。

純水儀：Milli-Q A10型，美國密理博公司。

數控超聲波清洗器：KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司。

數顯恒溫水浴鍋：HH-S6 型，山東博科科學儀器有限公司。

乙腈、甲醇：色譜純，德國默克公司。

磷酸、乙酸：色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

N-乙酰神經氨酸對照品：純度(質量分數)為98%，美國西格瑪奧德里奇公司。

供試品原料：共11批，某企業提供。

實驗用水為超純水，由密理博純水儀制得。

1.2 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK SCX 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本資生堂公司)；檢測器：二極管陣列檢測器；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液(體積比為80∶20)，流量為1.0 mL/min；檢測波長：205 nm；柱溫：35 ℃；進樣體積：10 μL；

1.3 溶液配制

N-乙酰神經氨酸對照品儲備液：2 000 μg/mL，稱取N-乙酰神經氨酸對照品適量，用2% (體積分數，下同)乙酸溶液稀釋并定容。

N-乙酰神經氨酸系列標準工作溶液：質量濃度分別為10.0、20.0、50.0、100.0、250.0、500.0 μg/mL，分別準確移取不同體積的N-乙酰神經氨酸對照品儲備液，用2%乙酸溶液稀釋制得。

樣品溶液：稱取供試品原料適量(其中含N-乙酰神經氨酸約40 mg)，精密稱定，置于25 mL 比色管中，加入50% (體積分數，下同)乙酸溶液10 mL 溶解，蓋上玻璃塞，置于80 ℃水浴中加熱30 min，取出比色管，冷卻至室溫。將水解液轉移至250 mL容量瓶中，用水稀釋至標線，混勻，過孔徑為0.45 μm 濾膜，取續濾液作為樣品溶液。

空白對照溶液：除不加供試品外，其余測定步驟與樣品溶液制備步驟一致。

1.4 實驗方法

取N-乙酰神經氨酸系列標準工作溶液及樣品溶液，按1.2色譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積，建立標準工作曲線，按色譜峰面積外標法計算樣品中的N-乙酰神經氨酸含量。

2 結果與討論

2.1 色譜條件選擇

2.1.1 色譜柱

分別考察Symmetry Shield RP18 柱(簡稱C18柱)、CAPCELL PAK SCX 柱( 簡 稱SCX 柱) 和Hypersil GOLD AQ柱(簡稱AQ柱)對N-乙酰神經氨酸的保留行為。結果表明，C18柱和AQ柱對N-乙酰神經氨酸不易保留；SCX柱使用混合強陽離子交換填料，具有離子交換和疏水作用雙重功能，選擇性強，延長了N-乙酰神經氨酸的保留時間，能實現對N-乙酰神經氨酸的良好分離，且色譜峰形良好，故選擇CAPCELL PAK SCX 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)作為分析柱。

2.1.2 流動相

分別考察甲醇-0.1% (體積分數，下同)磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1% (體積分數，下同)甲酸溶液3種流動相體系。結果表明，與甲醇相比，有機相選擇乙腈，色譜圖中雜質峰較少；水相選擇水或0.1%甲酸溶液時，峰形較寬并前延，水相為0.1%磷酸溶液時，色譜峰形得到改善。

考察乙腈與0.1%磷酸溶液的體積比分別為90∶10、80∶20、70∶30對測定結果的影響。結果顯示，隨著水相比例的增加，N-乙酰神經氨酸的保留時間延長。當乙腈與0.1%磷酸溶液的體積比為80∶20時，保留時間及峰形佳，最終選擇流動相組成為乙腈-0.1%磷酸溶液(體積比為80∶20)。

2.1.3 檢測波長

采用高效液相色譜儀對N-乙酰神經氨酸標準工作溶液在190～400 nm 波長范圍內進行掃描，所得光譜圖為典型的末端吸收曲線，參考最大吸收檢測波長，選擇檢測波長為205 nm。

2.2 樣品處理方法

唾液酸可分為游離態唾液酸和結合態唾液酸兩種形式，其中游離態唾液酸是未與糖或蛋白結合的唾液酸，樣品中結合態的唾液酸經過加熱及酸處理，產生游離態的唾液酸[15]，超聲提取不能水解完全，需將樣品水浴加熱后測定，因此采取水解樣品處理方法，并考察不同水解溶劑、水解溫度、水解時間三個因素對提取結果的影響。

分別選擇50%乙酸溶液、0.5 mol/L硫酸氫鈉溶液、0.1 mol/L 硫酸溶液、1% (體積分數)磷酸溶液4種水解液進行試驗。結果表明，在相同溫度、相同水解時間條件下，以50%乙酸溶液和1%磷酸溶液為水解溶劑時，N-乙酰神經氨酸含量測定值高于其余兩種水解溶劑，但經1%磷酸溶液水解后樣品溶液顏色明顯加深，雜質的色譜響應值增大，目標物檢出限略高，故選擇50%乙酸溶液為水解溶劑。

分別選擇水解溫度為30、40、60、80、100 ℃進行試驗，結果如圖1所示。由圖1可以看出，隨著水解溫度升高，目標物測定值逐漸增大，當水解溫度超過80 ℃時，目標物發生部分降解，測定值逐漸降低，故選擇水解溫度為80 ℃。

圖1 不同水解溫度時的測定結果Fig.1 Determination results of diffferent hydrolysis temperature

分別選擇水解時間為10、20、30、40、60 min 進行試驗，結果如圖2所示。由圖2可以看出，當水解時間為10～30 min 時，目標物測定值逐漸增大；當水解時間為30～60 min 時，目標物測定值基本一致，故選擇水解時間為30 min。

圖2 不同水解時間時的測定結果Fig.2 Determination results of different hydrolysis time

2.3 方法專屬性

分別取空白對照溶液、N-乙酰神經氨酸標準工作溶液和樣品溶液，按1.2色譜條件進行測定，記錄色譜圖，如圖3所示。

圖3 空白對照溶液、 N-乙酰神經氨酸標準溶液和樣品溶液色譜圖Fig.3 Chromatograms of blank control solution，N-acetylneuraminic acid standard solution and sample solution

由圖3 可以看出，N-乙酰神經氨酸保留時間約為6.8 min，色譜峰形良好。空白對照溶液及樣品溶液基質均無干擾，滿足試驗要求，表明該方法專屬性良好。

2.4 線性方程與檢出限、定量限

取N-乙酰神經氨酸系列標準工作溶液，按照質量濃度由低到高的順序依次進樣分析，以溶液質量濃度為橫坐標(x)，以色譜峰面積為縱坐標(y)，進行線性回歸，計算線性方程和相關系數。結果顯示N-乙酰神經氨酸質量濃度在10.0～500.0 μg/mL 范圍內與色譜峰面積線性關系良好，線性方程為y=5 420.15x-1 181.45，相關系數為0.999 9。

取N-乙酰神經氨酸質量濃度為10 μg/mL 的標準工作溶液，用2%乙酸溶液逐級稀釋，分別以3 倍信噪比和10 倍信噪比對應的質量濃度作為檢出限和定量限，該方法檢出限為0.12 μg/mL，定量限為0.4 μg/mL。

2.5 加標回收與精密度試驗

稱取樣品適量(其中含N-乙酰神經氨酸約20 mg)，精密稱定，分別進行低、中、高三個濃度水平的加標回收及精密度試驗，每個濃度水平平行制備6份，按1.3方法制備加標樣品溶液，按1.2色譜條件分別測定，計算N-乙酰神經氨酸的回收率及相對標準偏差，結果見表1。由表1 可知，目標組分的平均回收率為97.7%～98.9%，測定結果的相對標準偏差(RSD)為0.37%～1.36%，表明該方法準確度及精密度良好，滿足分析要求。

表1 加標回收與精密度試驗結果Tab.1 Results of recovery and precision test

2.6 穩定性試驗

按1.3 方法平行制備樣品溶液，分別于第0、2、4、8、12、24 h 進樣測定，計算色譜峰面積，結果見表2。由表2可知，N-乙酰神經氨酸色譜峰面積測定結果的相對標準偏差為0.90%，表明樣品溶液在24 h內穩定性良好。

表2 穩定性試驗結果Tab.2 Results of stability test

2.7 樣品測定

目前國家藥品監督管理局公布的化妝品新原料備案信息中顯示，N-乙酰神經氨酸在化妝品中使用時的最大允許質量分數為2%，故檢測原料中N-乙酰神經氨酸的含量對保障化妝品的質量及安全使用具有重要意義。N-乙酰神經氨酸制備方法主要是天然產物提取、化學合成法、酶法合成[16]、微生物發酵法[17]。備案新原料N-乙酰神經氨酸的制備方法為微生物發酵法，含量可達98%以上。《已使用化妝品原料目錄(2021 年版)》收錄的燕窩提取物中含有N-乙酰神經氨酸，因此選取燕窩提取物和N-乙酰神經氨酸兩類原料進行測定。

按所建方法測定11 批供試品原料中N-乙酰神經氨酸的含量，其中1#～8#原料標示為燕窩提取物，9#～11#標示為N-乙酰神經氨酸，測定結果見表3。由表3 可知，所測樣品中N-乙酰神經氨酸的質量分數范圍為6.2%～98.5%。6#、8#原料中N-乙酰神經氨酸的含量測定值略低于標示值，其余樣品測定值與標示值相符。

表3 樣品測定結果Tab.3 Determination results of sample

3 結語

建立了檢測化妝品原料中N-乙酰神經氨酸的高效液相色譜方法。該法準確、高效，未使用有機溶劑衍生，大幅降低了對人員和環境的影響。該法具有良好的線性、準確度、精密度，為制定化妝品原料中N-乙酰神經氨酸的含量測定相關標準提供了依據。