高效液相色譜法測定訶子中訶黎勒酸和訶子酸

王巍，張強，楊武杰，郝季，陳九妹，安悅言，鞠成國，2，竇德強

［1.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧大連 116600； 2.國家中醫藥管理局中藥炮制技術傳承基地（遼寧），遼寧大連 116600］

訶子為使君子科植物訶子(Terminalia chebula Retz.)或絨毛訶子(T.chebula Retz.var.tomentella Kurt.)的干燥成熟果實，為《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》) 2020 年版一部收載。訶子味苦、酸、澀，性平，歸肺、大腸經，具有澀腸止瀉、斂肺止咳、降火利咽的功效[1]。訶子化學成分主要為鞣質類[2]，其中以訶黎勒酸、訶子酸含量較高[3-5]。國內外多項研究表明，訶黎勒酸、訶子酸具有良好的抗氧化、抗炎、抗腫瘤以及降血糖的作用[6-9]。趙鹿等[2]從植物親緣學及化學成分特有性、傳統功效、藥性、藥動學、新臨床用途和化學成分可測性等多個方面預測包括訶黎勒酸、訶子酸在內的4 個化學成分為訶子的質量標志物。《中國藥典》中訶子的質量標準缺少含量測定的要求，這對訶子藥材的質量控制造成了一定的缺憾。同時現有文獻也未見對訶黎勒酸、訶子酸同時進行含量測定的報道，多是對其它鞣質類成分進行測定[10-11]。筆者建立了測定訶子藥材中訶黎勒酸、訶子酸含量的高效液相色譜法，作為《中國藥典》2020年版一部中訶子質量標準的補充。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC-16型，日本島津公司。

電子天平：FA1004B 型，感量為0.1 mg，上海精密科學儀器有限公司。

電子天平：METTLER AE240 型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司。

醫用超聲波清洗器：KQ-250E 型，江蘇昆山市超聲儀器有限公司。

訶黎勒酸、訶子酸對照品：經HPLC法[12-13]檢測，純度(質量分數)不小于98%，自制。

乙腈：色譜純，美國天地試劑公司。

甲醇、甲酸：均為色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司。

訶子藥材：市售，產地為云南，經遼寧中醫藥大學藥學院宋慧鵬副教授鑒定為使君子科植物訶子Terminalia chebula Retz.的干燥成熟果實。

實驗用水為娃哈哈純凈水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Dikma Platisil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，北京迪科馬科技有限公司)；柱溫：30 ℃；檢測波長：280 nm；流動相：體積分數為0.1%的甲酸水溶液-乙腈-甲醇(體積比為78∶16∶6)，等度洗脫，流量為1 mL/min；進樣體積：5 μL。

1.3 溶液制備

混合對照品溶液：訶黎勒酸、訶子酸質量濃度分別為0.410、0.455 mg/mL。精密稱取訶黎勒酸、訶子酸對照品適量，加入50%(體積分數，下同)乙腈溶液溶解，并稀釋、定容。

樣品溶液：取訶子藥材，去核，留果肉，粉碎，過孔徑為250 μm (65目)篩。精密稱取0.1 g，精密加入50%乙腈溶液25 mL，稱定質量，超聲(功率250 W，頻率40 kHz)提取30 min，冷卻至室溫，以提取溶劑補足損失質量，搖勻，濾過。精密量取續濾液2 mL至10 mL容量瓶中，用50%乙腈溶液定容至標線，搖勻，再經0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，作為樣品溶液。

1.4 實驗方法

取混合對照品溶液、樣品溶液，按照1.2 色譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積，按照外標法計算訶子藥材中訶黎勒酸、訶子酸的含量。

2 結果與討論

2.1 提取方式選擇

取訶子藥材，去核，留果肉，粉碎，過孔徑為250 μm 篩。精密稱取2 份，每份0.1 g，精密加入50%乙腈溶液25 mL，稱定質量，分別超聲(功率250 W，頻率40 kHz)提取30 min、加熱回流30 min；放冷，以提取溶劑補足損失質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液2 mL至10 mL容量瓶中，用50%乙腈溶液定容至標線，搖勻，再經0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液進行測定。超聲提取樣品測得訶黎勒酸質量分數為13.95%，訶子酸質量分數為9.30%；加熱回流30 min提取樣品測得訶黎勒酸質量分數為13.27%，訶子酸質量分數為9.15%。說明超聲提取效果更佳，因此提取方式應以超聲提取為宜。

2.2 提取溶劑選擇

取訶子藥材，去核，留果肉，粉碎，過孔徑為250 μm 篩。精密稱取21 份，每份0.1 g，分別精密加入25 mL 的水、不同濃度的甲醇溶液或不同濃度的乙腈溶液，其余步驟同上，結果見表1。

表1 不同提取溶劑時訶黎勒酸和訶子酸質量分數測定結果Tab.1 Determination results of mass fractions of chebulagic acid and chebulinic acid in different extraction solvents %

由表1可知，乙腈的提取率高于甲醇，其中50%乙腈溶液對兩種成分的提取量均較高，因此提取溶劑選擇50%乙腈溶液。文獻[14-15]對訶子化學成分分析均采用70%甲醇溶液作為提取溶劑，筆者在制備訶黎勒酸、訶子酸對照品時發現，兩者在甲醇中不穩定，會與溶劑發生可逆的絡合反應，因此采用甲醇為溶劑進行提取對含量測定結果影響較大。

2.3 色譜條件優化

2.3.1 檢測波長

分別對訶黎勒酸、訶子酸對照品進行200～400 nm 吸收光譜掃描，結果表明，訶黎勒酸最大吸收波長為278 nm，訶子酸最大吸收波長為280 nm，最終檢測波長確定為280 nm。

2.3.2 流動相

由于樣品提取試劑為乙腈，首先選擇乙腈-水作為淋洗液，發現在不同配比條件下1，2，3，4，6-O-五沒食子酰基葡萄糖與訶子酸均無法分離，表明1，2，3，4，6-O-五沒食子酰基葡萄糖與訶子酸在乙腈中選擇性相似，色譜行為相近。在洗脫體系中加入少量甲醇，結果表明，隨著甲醇加入量的增加，兩者的分離度逐漸增大，當甲醇體積分數為6%時，兩者可以達到完全分離，且訶黎勒酸與訶子酸在24 h內穩定性良好，故最終選擇以水-乙腈-甲醇三相組成淋洗液。

取訶子藥材，按1.3 方法制備樣品溶液，對淋洗液組成進行優化，考察兩種目標成分的色譜分離效果，兩種目標成分保留時間、色譜分離度、理論塔板數及拖尾因子結果見表2。由表2可知，當選擇序號為1、3、5的流動相時，訶黎勒酸、訶子酸的分離度較小；選擇序號為4的流動相時，訶子酸的保留時間過長；選擇序號為7 的流動相時，拖尾因子變大；序號為6 的流動相中增加了甲酸體積分數，但對整體色譜行為影響不大。綜合考慮，序號為2 的流動相效果最佳，故流動相選擇0.1%的甲酸水溶液-乙腈-甲醇(體積比為78∶16∶6)。

表2 不同流動相組成時訶黎勒酸、訶子酸的色譜分離效果Tab.2 Chromatographic separation effect of chebulagic acid and chebulinic acid under different mobile phase compositions

2.3.3 淋洗液流量

取訶子藥材，按1.3方法制備樣品溶液，分別選擇不同淋洗液流量進行試驗，考察兩種目標成分的色譜分離效果，兩種目標成分保留時間、色譜分離度、理論塔板數及拖尾因子結果見表3。由表3可知，淋洗液流量大于1.0 mL/min時，訶黎勒酸分離度低于2.0；當淋洗液流量小于1.0 mL/min時，訶子酸的保留時間過長。綜合考慮，淋洗液流量選擇1.0 mL/min。

表3 不同淋洗液流量時訶黎勒酸、訶子酸的色譜分離效果Tab.3 Chromatographic separation effect of chebulagic acid and chebulinic acid at different flow rates of eluent

2.3.4 進樣體積

取訶子藥材，按1.3 方法制備樣品溶液，分別選擇不同進樣體積進行試驗，考察兩種目標成分的色譜分離效果，兩種目標成分色譜分離度、理論塔板數及拖尾因子結果見表4。由表4可知，當進樣體積不大于5 μL 時，訶黎勒酸、訶子酸的分離度均大于1.5；理論塔板數均大于8 000，拖尾因子均小于1.2；但進樣體積為3 μL 太小，誤差較大；當進樣體積為10 μL 時，理論塔板數顯著降低；當進樣體積為20 μL 時，訶黎勒酸與訶子酸前延峰拖尾現象嚴重，不能滿足定量分析要求。綜合考慮，選擇進樣體積為5 μL。

表4 不同進樣體積時訶黎勒酸、訶子酸的色譜分離效果Tab.4 Chromatographic separation effect of chebulagic acid and chebulinic acid at different injection volumes

2.3.5 柱溫

取訶子藥材，按1.3 方法制備樣品溶液，分別選擇不同柱溫進行試驗，考察兩種目標成分的色譜分離效果，兩種目標成分保留時間、色譜分離度、理論塔板數及拖尾因子結果見表5。由表5可知，在30～40 ℃范圍內隨著柱溫的升高，訶黎勒酸、訶子酸保留時間逐漸減小，其它指標無明顯變化，為減少儀器運行的損耗，選擇柱溫為30 ℃。

表5 不同柱溫時訶黎勒酸、訶子酸的色譜分離效果Tab.5 Chromatographic separation effect of chebulagic acid and chebulinic acid at different column temperatures

2.4 系統適用性試驗

取對照品溶液、樣品溶液分別按1.2色譜條件進樣測定，結果如圖1所示。由圖1可以看出，在樣品溶液和對照品溶液的色譜圖中訶黎勒酸、訶子酸色譜峰保留時間一致，且實現基線分離。訶黎勒酸保留時間為13.507，分離度為2.2，理論塔板數為8 860，拖尾因子為1.16；訶子酸保留時間為33.711，分離度為3.2，理論塔板數為11 087，拖尾因子為1.20。

圖1 訶黎勒酸、訶子酸混合對照品溶液、訶子樣品溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed reference solutionof chebulagic acid and chebulinic acidand sample solution of Terminalia Chebula Retz.

2.5 線性方程、檢出限與定量限

取混合對照品溶液，以50%乙腈溶液逐級稀釋成訶黎勒酸質量濃度分別為0.205 0、0.102 5、0.051 3、0.025 6、0.012 8、0.006 4 mg/mL，訶子酸質量 濃 度 分 別 為0.227 5、0.113 8、0.056 9、0.028 4、0.014 2、0.007 1 mg/mL 的系列混合對照品工作溶液。按1.2 色譜條件分別進樣測定，以目標物質量(μg)為橫坐標，對應色譜峰面積為縱坐標，進行線性回歸，計算得訶黎勒酸的線性方程為y=1 591 948x-25 820，相關系數為0.999 6；訶子酸的線性方程為y=2 267 031x-61 935，相關系數為0.999 5。表明訶黎勒酸、訶子酸的質量分別在0.032 03～1.025 μg、0.035 55～1.137 μg 范圍內與色譜峰面積線性關系良好。

將質量濃度最低點的混合對照品溶液以50%乙腈溶液逐級稀釋，分別進樣檢測，以信噪比為3∶1時對應的溶液中目標物的質量為方法檢出限，以信噪比為10∶1 時對應的溶液中目標物的質量為定量限。訶黎勒酸的檢出限為2.67 ng，定量限為8.00 ng；訶子酸的檢出限為4.44 ng，定量限為11.85 ng。

2.6 精密度試驗

取訶子藥材，按1.3 方法平行制備6 份樣品溶液，按1.2色譜條件分別進樣測定，計算訶黎勒酸和訶子酸的質量分數及相對標準偏差，結果列于表6。由表6可知，訶黎勒酸平均質量分數為97.9 mg/g，相對標準偏差為1.8%；訶子酸平均質量分數為83.9 mg/g，相對標準偏差為1.8%。表明該方法精密度良好。

表6 精密度試驗結果Tab.6 Results of precision test

2.7 加標回收試驗

取訶子藥材樣品粉末，按照所建方法測定訶黎勒酸、訶子酸含量，然后取約0.05 g樣品，共9份，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，精密加入相當于藥材中目標物含量約80%、100%和120%的訶黎勒酸、訶子酸對照品，每個劑量3 份，按1.3 方法制備樣品溶液，按1.2色譜條件進樣測定，計算兩種目標成分的回收率，結果列于表7。由表7可知，訶黎勒酸、訶子酸的回收率均在97%～103%之間，表明方法準確度良好。

表7 加標回收試驗結果Tab.7 Results of spiked recovery test

3 結語

建立高效液相色譜法測定中藥材訶子中訶黎勒酸和訶子酸的含量，該方法穩定可靠，專屬性強，靈敏度高，精密度及準確度好，可對《中國藥典》2020年版一部中訶子含量測定項進行補充，以利于訶子藥材的質量控制。