基于煙酰胺磷酸核糖轉移酶（NAMPT）探討紅景天苷在非酒精性脂肪性肝病小鼠模型中的保護作用

李榮軍，徐春霞，張 庭，張志紅，王 縷

1 瀘州市中醫醫院脾胃病肝病科，四川 瀘州 646000

2 西南醫科大學附屬醫院全科醫學科，四川 瀘州 646000

不良的生活方式及飲食習慣導致非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）患病率迅速增長，已成為我國第一大慢性肝病和健康體檢肝臟生化指標異常的首要原因［1］。最新的流行病學調查［2-3］結果顯示，包括中國在內的多數亞洲國家NAFLD 患病率處于中上水平（＞25%）。紅景天苷在NAFLD 中可通過改善胰島素抵抗、抗氧化應激、抗纖維化等途徑發揮保護作用［4-7］。同時，研究［8］表明，細胞內煙酰胺磷酸核糖轉移酶（nicotinamide phosphoribosyltransferas，NAMPT）具有調節肝脂質代謝的潛在作用。本研究通過建立NAFLD 模型，并以NAMPT 為切入點，探討紅景天苷在NAFLD 中的調控作用及其可能機制，以期為紅景天苷的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級6 周齡雄性KM 小鼠24 只，體質量（30±5）g，由成都達碩實驗動物有限公司提供，飼養于西南醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證編號：SCXK（川）2015-030，實驗動物使用許可證編號：SYXK（川）2014-000。

1.1.2 藥物制備 紅景天苷（＞98%，大連美侖生物技術有限公司），批號：J1206A。用時以蒸餾水配置成濃度為10 mg/mL的藥液。

1.1.3 高脂飼料 配方：82.5%普通飼料、10%豬油、5%蔗糖、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉，購自成都達碩實驗動物有限公司。

1.1.4 試劑 ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C 檢測試劑盒（Mindray 公司）；NAMPT、AMPKα、SERBP1 抗體、Sirt1（Affinity公司）；β-actin抗體（Abclonal公司）；Western及IP 細胞裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（Beyotime公司）；預染蛋白Marker（ABClone 公司）；ECL 發光試劑盒（Affinity 公司）；Immobilon-PSQ PVDF 膜（Sigmaaldrich公司）；PAGE 凝膠快速制備試劑盒（上海雅酶生物科技有限公司）；Glycine（Biofroxx 公司）；Tris 緩沖液、SDS（Biofroxx公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及造模 將小鼠適應性喂養1周，隨機分為正常組（普通飼料喂養）、高脂飲食（HFD）組、HFD+空白對照組、HFD+紅景天苷組，每組6只。HFD組通過高脂飼料喂養14 周建立NAFLD 動物模型，14 周末以HFD 組小鼠肝臟病理切片中出現大小不一的脂滴和氣球樣變為造模成功標準。在14周末開始給予HFD+紅景天苷組小鼠100 mg·kg-1·d-1紅景天苷灌胃處理8 周，HFD+空白對照組小鼠以同等體積的生理鹽水作為對照，給藥期間各組小鼠喂養方式不變。

1.2.2 獲取標本 22 周末，禁食24 h 后稱重，處死小鼠，打開腹腔，腹主動脈采血，收集血液樣品并分離血清；部分肝組織用多聚甲醛液（4%）固定，常規石蠟包埋、切片、HE 染色在光學顯微鏡下觀察肝細胞形態、脂質沉積等病理學變化，通過NAFLD 活動度積分（NAFLD activity score，NAS）評價各組小鼠肝組織脂肪變性、小葉炎癥和氣球樣變程度［9］，評分越高表明脂肪變性、小葉炎癥、氣球樣變程度越高（表1）。剩余肝組織置于-80 ℃保存，用于Western Blot檢測。

表1 NAS評分標準Table 1 NAS scoring criteria for liver tissue

1.2.3 ELISA法測定血清生化指標 取小鼠血清樣本，按照各指標ELISA 試劑盒說明書進行ALT、AST、TG、TC、HDL-C、LDL-C等相關生化指標測量。

1.2.4 Western Blot 法檢測肝組織內NAMPT、Sirt1、AMPKα、SREBP1表達 取小鼠肝臟樣本，向每管加入RIPA裂解液，用滅菌剪刀將組織剪碎，置碎冰上裂解10 min；收集裂解液，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min；離心后取上清液，用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。BCA 定量后將蛋白濃度調至10 μg/μL，上樣40 μg，經凝膠電泳分離后轉至PVDF 膜上，5% BSA 室溫下封閉2 h，分別加入兔抗NAMPT 抗體（1∶1 000）；AMPKα 抗體（1∶1 000）；SERBP1抗體（1∶1 000）；Sirt1抗體（1∶1 000）；鼠抗β-actin抗體（1∶100 000），4 ℃過夜，第二天經過TBST 充分漂洗后加入HRP標記的羊抗兔抗體（1∶5 000），室溫孵育2 h，經TBST充分漂洗后，ECL發光顯影。

1.3 統計學方法 采用SPSS 26.0 統計軟件進行數據分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NAFLD小鼠模型建立 正常組小鼠肝組織中央靜脈周圍肝細胞呈放射狀分布，單行排列，形態一致，細胞核圓且居中，胞漿均勻分布；HFD 組小鼠肝索排列紊亂，肝細胞體積明顯增大且胞質染色變淺（部分呈現透明），出現“氣球樣”變，部分細胞核被擠壓于一側，匯管區周圍有炎癥細胞浸潤，提示NAFLD模型建立成功（圖1）。

圖1 各組小鼠肝組織病理形態學變化（HE染色，×100）Figure 1 Pathological changes of liver tissue in mice of each group（HE staining，×100）

2.2 紅景天苷對KM 小鼠血清生化指標的影響 與正常組比較，HFD 組及HFD+空白對照組的血清ALT、AST、TC、TG、LDL-C 水平明顯升高（P值均＜0.05），而HDL-C 明顯降低（P＜0.05）；HFD+紅景天苷組血清AST、TC 水平明顯高于正常組（P值均＜0.05）。與HFD組及HFD+空白對照組相比，HFD+紅景天苷組小鼠血清ALT、AST、TG、LDL-C 水平明顯降低（P值均＜0.05），而HDL-C 明顯升高（P＜0.05）（表2）。

表2 紅景天苷對KM小鼠血清生化指標的影響Table 2 The effect of Salidroside on serum biochemical indicators in KM mice

2.3 各組小鼠肝組織病理變化比較 正常組小鼠肝組織結構完整，中央靜脈周圍的肝細胞形態一致、呈有序單行條索狀排列、放射狀分布，胞核圓且居中，胞漿分布均勻；與正常組比較，HFD 組及HFD+空白對照組小鼠肝組織可觀察到明顯的脂肪變性、小葉炎癥、氣球樣變等病理變化，NAS 評分明顯升高（P值均＜0.01）；與HFD 組及HFD+空白對照組比較，HFD+紅景天苷組小鼠肝組織損傷程度明顯減輕，肝細胞結構排列較為完整有序，肝組織脂肪蓄積及細胞空泡化得到明顯改善，脂肪空泡數量明顯減少，NAS 評分降低（P值均＜0.01）（圖2，表3）。

圖2 各組小鼠肝臟組織HE染色Figure 2 Pathological changes of liver tissue in mice of each group

表3 各組小鼠肝組織NAS評分Table 3 The NAS score of liver tissue in mice of each group

2.4 各組小鼠肝組織NAMPT、AMPKα、Sirt1、SREBP1 蛋白表達比較 與正常組相比，HDF組及HDF+空白對照組小鼠肝組織中NAMPT、AMPKα、Sirt1蛋白表達顯著降低（P值均＜0.05），而經過紅景天苷處理的小鼠肝臟NAMPT、AMPKα、Sirt1 蛋白表達明顯高于HDF 組、HDF+空白對照組（P值均＜0.05），同時HDF+紅景天苷組AMPKα 低于正常組（P＜0.05）。HDF 組以及HDF+空白對照組可明顯上調SREBP1 的表達，與正常組比較差異具有統計學意義（P值均＜0.01），經過紅景天苷處理的小鼠肝臟SREBP1 表達較HDF 組以及HDF+空白對照組明顯減少（P＜0.01）（圖3、4）。

圖3 各組小鼠肝組織NAMPT、Sirt1、AMPKα、SREBP1蛋白表達Figure 3 The hepatic protein expression of NAMPT、Sirt1、AMPKα、SREBP1 in mice of each group

圖4 紅景天苷對NAFLD小鼠肝臟NAMPT、Sirt1、AMPKα、SREBP1表達的影響Figure 4 The effect of salidroside on the hepatic protein expression of NAMPT、Sirt1、AMPKα、SREBP1 in mice of each group

3 討論

紅景天苷為紅景天提取物，是景天科紅景天屬的多年生草本植物，分子式：C14H20O7，在《四部醫典》和《本草綱目》均有記載。研究［10-14］證明紅景天苷有提高機體免疫力、增強體質、改善人體造血機能、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗疲勞、降血糖、抗病毒、抗輻射、預防高原反應等多種功能。此外，戴寧等［15］研究顯示紅景天苷對高脂高膽固醇飲食誘導的NASH 有較好的抑制效果，其機制可能與紅景天苷的抗氧化作用有關；陳少東等［4］研究發現，紅景天苷能明顯降低NAFLD 血清TG 水平及AST 活性，改善肝組織脂肪變性的病理狀態，具有顯著減輕NASH病理損傷的藥理效應。張新茹［16］研究報道，紅景天苷能顯著降低高脂飲食聯合鏈脲佐菌素誘導的2型糖尿病小鼠的血脂、減少肝臟中的脂質沉積。本研究結果顯示，高脂飼料誘導的NAFLD 模型組血生化指標中ALT、AST、TG、TC、LDL-C 均明顯升高，且AST、TG 升高明顯，同時導致肝組織明顯脂肪變性，提示存在明顯的NASH表現，而經過紅景天苷治療后，ALT、AST、TG、LDL-C 均明顯下降，肝脂肪變程度明顯改善，提示紅景天苷具有改善NAFLD 小鼠的脂代謝、肝功能、肝脂肪變性的作用，存在改善NAFLD 的潛力，進一步證實了紅景天苷防治NAFLD、高血脂等方面的療效。

國內研究［17］顯示人群的NAFLD 患病率為13%～43%，且NAFLD 患病率呈逐年上升趨勢，每年新發NAFLD的人數比例約為4%。其中非肥胖NAFLD也有一定的患病率，其主要的危險因素包括甘油三酯的蓄積、遺傳因素、不良的生活方式、糖尿病、高尿酸血癥、高雄激素血癥、藥物性脂肪肝等［18］，不僅最終可能進展為晚期肝病（包括失代償性肝硬化和肝細胞癌），其與代謝綜合征、2型糖尿病、動脈粥樣硬化性心血管疾病以及結直腸腫瘤等的高發密切相關［19］。NAFLD 最顯著的特征是甘油三酯在肝臟中的積累。據報道［15］，脂質合成異常是肝臟異常脂質沉積的主要原因之一。NAMPT 是一種高度保守的52 kD 蛋白質，在哺乳動物中具有細胞內（iNAMPT）和細胞外形式（eNAMPT）。NAMPT是細胞內煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的重要調節因子，是調節來自哺乳動物NAM 轉變為NAD+補救途徑中的限速步驟［20］。研究［8］表明，NAMPT在體內和體外肝脂肪變性模型中發揮了關鍵作用，NAMPT通過激活NAD+補救途徑促進NAD+的產生，增加的NAD+作為底物激活Sirt1信號通路，一方面Sirt1的活化直接促進SREBP1的脫乙酰化，導致SREBP1活性抑制；另一方面，Sirt1 通過激活AMPKα，間接抑制SREBP1活性。SREBP1 活性的抑制最終導致包括FASN 和ACC在內的脂肪生成基因表達的抑制，從而減輕高脂飲食誘導的小鼠肝脂肪變性［21-22］。本研究結果顯示，與正常組相比，高脂飲食誘導的NAFLD 模型組，NAMPT、Sirt1、AMPKα 表達明顯減少，且SREBP1 表達增加，提示高脂飲食可通過NAMPT、Sirt1、AMPKα、SREBP1 信號通路，促進脂質合成且沉積于肝臟，從而導致NAFLD。經過紅景天苷干預后NAFLD小鼠肝組織NAMPT、Sirt1、AMPKα蛋白表達升高，SREBP1的表達減少，由此推斷紅景天苷可通過上調NAMPT、Sirt1、AMPKα，抑制SREBP1 活性，最終導致其下游脂肪生成受抑，減輕高脂肪飲食誘導的小鼠肝脂肪變性，發揮其對NAFLD的保護作用。

綜上，紅景天苷可明顯改善NAFLD 小鼠血液生化指標，保護肝臟功能，降低血液中血脂含量，并可通過促進NAMPT、Sirt1、AMPK的表達，減少SERBP1的表達，發揮其對NAFLD 的保護作用。通過本研究進一步闡明紅景天苷在NAFLD 中的作用及其可能機制，為紅景天苷相關產品的進一步開發以及找尋防治NAFLD 藥物新靶點具有重要的科學和社會意義。

倫理學聲明：本研究方案于2021年9月29日經由西南醫科大學實驗動物福利倫理委員會審批，批號：20210929-013，符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：王縷、李榮軍、張志紅負責課題設計；王縷、張庭負責飼養動物，造模，處理動物獲得標本；王縷負責Western Blot、ELISA、病理組織學相關試驗；徐春霞負責資料分析；李榮軍、張志紅負責擬定寫作思路；李榮軍、王縷負責撰寫論文，修改論文，最后定稿。