毫針和火針療法治療骨髓抑制大鼠模型的分子作用機(jī)制

楊曉琳 李巖

1天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院中醫(yī)科，天津 300211；2天津市公安醫(yī)院針灸理療科，天津300040

骨髓抑制是指臨床中由于各種原因?qū)е碌墓撬柚醒?xì)胞前體活性下降。骨髓中含有豐富的造血干細(xì)胞，可以分化為白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板。當(dāng)機(jī)體受到部分抗生素、抗腫瘤藥物、放療的作用時(shí)，會(huì)出現(xiàn)骨髓抑制的副作用，導(dǎo)致造血干細(xì)胞不能正常分化，外周血中的成熟紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板減少，患者出現(xiàn)貧血、出血、感染等癥狀。常見的導(dǎo)致骨髓抑制的藥物包括卡鉑、順鉑和環(huán)磷酰胺等癌癥化療藥物［1］。對(duì)于接受化療的癌癥患者的調(diào)查顯示：癌癥患者在化療期間骨髓抑制的發(fā)生率極高。60%～70%的癌癥患者因骨髓抑制的出現(xiàn)，必須減少或者停止癌癥的臨床治療。因此，骨髓抑制使癌癥患者的治療計(jì)劃受阻，患者的病情和生存質(zhì)量進(jìn)一步惡化。臨床上使用的大多數(shù)化療藥物可對(duì)人體造血系統(tǒng)造成不良的反應(yīng)，其中一部分化療藥物可以直接損傷外周血細(xì)胞，造成外周血象下降，而另一部分化療藥物可以作用于骨髓，造成骨髓損傷，導(dǎo)致血細(xì)胞生成障礙，引起外周血細(xì)胞減少［2］。因此，骨髓抑制會(huì)導(dǎo)致癌癥患者治療過程中產(chǎn)生諸如感染、敗血癥和膿毒癥等［3］，導(dǎo)致患者化療藥物使用量下降，進(jìn)而導(dǎo)致治療效果不理想。盡管近年來針對(duì)骨髓抑制的研究取得了一定的進(jìn)展，但是如何從根本上解決化療藥物誘發(fā)的骨髓抑制現(xiàn)象，仍然是癌癥治療中的難題，始終困擾著癌癥患者和醫(yī)護(hù)人員［4］。因此，需要新的治療手段以從根本上解決臨床中骨髓抑制的癥狀。

毫針和火針療法屬于中醫(yī)微創(chuàng)治療手段。火針和毫針各有所長，火針挾火氣盛，毫針纖細(xì)痛微，毫針和火針療法優(yōu)化了針灸療法，提高了針灸療效。毫針和火針療法已被大多數(shù)患者所接受［5］。中醫(yī)理論認(rèn)為，火針和毫針可放血，“宛陳則除之者，去血脈也”；可速刺，以纖細(xì)之體攜火直入；可留刺，疾入穴下，留駐穴中；可決血調(diào)氣，通經(jīng)活絡(luò)，兼有賀氏“強(qiáng)通”“溫通”“微通”三通之功能［6］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，毫針和火針療法治療疾病的作用原理是對(duì)穴位的剌激有物理的機(jī)械刺激和溫?zé)嶝菁ぜ吧淼臒o菌性灼傷剌激。三者合一，增強(qiáng)了刺激強(qiáng)度、作用時(shí)間。毫針和火針療法，借“火”之力通經(jīng)活絡(luò)，集針之法激發(fā)經(jīng)氣，取灸之溫陽驅(qū)散濕寒。如針刺穴下，不用提插捻轉(zhuǎn)，其經(jīng)氣自來，即刻退出針來，針還像留在穴中，其經(jīng)氣纏綿，針感不絕，療效可立竿見影［7-9］。

本研究開展于2022 年3 月至9 月，通過環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)建立大鼠骨髓抑制模型，并且通過檢測毫針和火針治療前后大鼠血細(xì)胞數(shù)量、病理情況，骨髓基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞周期以及細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)等多項(xiàng)指標(biāo)，探究毫針和火針治療大鼠骨髓抑制的分子機(jī)制，為毫針和火針治療骨髓抑制的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和臨床支持。

資料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD 大鼠共96只，4～6周齡，體質(zhì)量為250～300 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（京）2021-0012。飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（SPF 級(jí)）；飼養(yǎng)條件：常規(guī)飼養(yǎng)7 d 以適應(yīng)環(huán)境，飼養(yǎng)期間給予大鼠標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及純凈飲水，光和暗循環(huán)各12 h，相對(duì)濕度45%～65%，溫度18～23 ℃。

2.主要試劑及儀器

環(huán)磷酰胺（貨號(hào)BP1094）（美國Merck 公司）；4%多聚甲醛（貨號(hào)P885233）（上海麥克林生化科技股份有限公司）；快速瑞氏吉姆沙染色試劑（貨號(hào)AC11921-3*30 ml）（上海吉至生化科技有限公司）；EDTA 脫鈣液（貨號(hào)AR1071）（博士德生化科技有限公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（貨號(hào)P0012S）、RIPA蛋白裂解液（貨號(hào)P0013B）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；細(xì)胞周期檢測試劑盒（貨號(hào)C1052）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；CD6 抗體（貨號(hào)bs-2488R）、CD4 抗 體（貨 號(hào)bs-0647R）、Cyclin D1 抗 體（貨 號(hào)bs-0623R）、E2F1 抗體（貨號(hào)bs-23184R）、GAPDH 抗體（貨號(hào)bs-2188R）（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；澳洲胎牛血清（貨號(hào)C0227）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

DYCZ-24DN SDS-PAGE 蛋白電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；5200 系列全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光/熒光圖像分析系統(tǒng)（上海天能生命科學(xué)有限公司）；電子顯微鏡（DM4000B，Leika 公司）；低溫冷凍離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）；DK-320型全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（上海德卡實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)科技有限公司）；流式細(xì)胞儀（NovoCyte，艾森生物有限公司）；血細(xì)胞自動(dòng)分析儀（KT6610VET，南京華仁生物科技有限公司）。

3.動(dòng)物分組及模型制備

適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，96只大鼠全部入組。全部稱取并記錄大鼠體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量情況，依次進(jìn)行編號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對(duì)照組、模型組、火針組、毫針組，各24只；每組再隨機(jī)分為4組，每組6只。除對(duì)照組外，其余各組大鼠利用環(huán)磷酰胺建立大鼠骨髓抑制模型。腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/（kg·d），單次給藥，連續(xù)3 d，利用藥代動(dòng)力學(xué)分析，4 d 后環(huán)磷酰胺活性消失，因此給藥環(huán)磷酰胺4 d 后，環(huán)磷酰胺化療大鼠模型即造模成功。同時(shí)，對(duì)照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。其余各組大鼠依次在造模成功后4 h進(jìn)行治療。

對(duì)照組和模型組大鼠處理方式：每天陪同抓取、固定，但是不進(jìn)行治療。火針組大鼠處理方式：根據(jù)編號(hào)依次將大鼠俯臥固定于鼠板上，針具選用華佗牌毫火針（半寸，0.18 mm×13.00 mm），選取雙側(cè)足三里穴（足三里穴位于大鼠后肢膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm 處），于造模后第1 天、第3 天、第5 天、第7 天，采用火針點(diǎn)刺法垂直刺入3 mm，不留針，隔日1次，連續(xù)7 d。毫針組大鼠處理方式：根據(jù)編號(hào)依次將大鼠俯臥固定于鼠板上，針具、選穴同火針組，垂直刺入3 mm，留針6 min，于造模后第1 天開始，每天1次，連續(xù)7 d。

4.生化指標(biāo)檢測

4.1.外周血細(xì)胞計(jì)數(shù) 每組大鼠均選取第4 組進(jìn)行外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)，作為血常規(guī)組測量血常規(guī)指標(biāo)（白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血紅蛋白和血小板），分別于造模前、造模完成當(dāng)日（d0），治療后第1（d1）、3（d3）、5（d5）、7（d7）天，晨起空腹?fàn)顟B(tài)下，采集尾靜脈血10 μl，迅速進(jìn)行血液稀釋，搖勻后上機(jī)測定血常規(guī)。

4.2.骨髓切片瑞氏吉姆沙染色 每組大鼠均選取第4 組，治療后第7 天采集尾靜脈血后頸椎脫臼法處死，取出大鼠的股骨組織置于4%多聚甲醛溶液固定24 h，經(jīng)10%EDTA 脫鈣液慢性脫鈣4～5 周。將脫鈣好的標(biāo)本經(jīng)不同濃度的乙醇梯度脫水，二甲苯透化標(biāo)本，然后進(jìn)行浸蠟和包埋組織。將包埋好的蠟塊切片（切片厚度約3 μm）再經(jīng)二甲苯脫蠟，蒸餾水洗滌，滴加1 ml 瑞氏吉姆沙A 液于切片上，并讓染液迅速覆蓋整個(gè)標(biāo)本染色1～2 min，再緩慢滴加瑞氏吉姆沙B 液于A 液上面，用移液器輕輕吹打，使兩液充分混合，染色5～10 min，蒸餾水沖洗后烘烤干燥，封片后在電子顯微鏡下觀察病理變化。

4.3.骨髓有核細(xì)胞懸液的制備及骨髓單核成纖維細(xì)胞培養(yǎng) 每組大鼠均選擇4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行骨髓有核細(xì)胞懸液的制備，分別選取第1 組，分別于造模后第1 天；選取第2 組，分別于治療后第3 天；選取第3 組，分別于治療后第5 天；選取第4 組，分別于治療后第7 天，頸椎脫臼法處死大鼠，經(jīng)75%乙醇消毒后，置于超凈工作臺(tái)中取大鼠的雙側(cè)股骨組織，用手術(shù)剪剖開股骨兩端，兩側(cè)股骨用1 ml DMEM 培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔收集原代骨髓細(xì)胞，最后，經(jīng)過篩網(wǎng)過濾制成骨髓單核細(xì)胞懸液。將骨髓單核細(xì)胞懸液按1×106個(gè)/ml 的細(xì)胞密度接種于含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2和飽和濕度條件下，細(xì)胞換液培養(yǎng)，在培養(yǎng)7 d后觀察骨髓單核成纖維細(xì)胞的生長狀況。

4.4.流式細(xì)胞法檢測骨髓成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期 收集各組骨髓成纖維細(xì)胞，PBS 緩沖液漂洗1 次，將細(xì)胞重懸于0.3 ml 的預(yù)冷PBS 緩沖液中，加入0.7 ml 預(yù)冷乙醇，輕柔混勻2 次，4 ℃固定過夜。1 000 r/min 離心5 min，有效離心半徑是10 cm，去上清，加入PI 染色緩沖液（50 mg/L PI，0.1 g/L RNase A 和0.05% Triton X-100）總體積1.0 ml/樣品，37 ℃孵育40 min。然后，1 000 r/min離心5 min，有效離心半徑是10 cm，小心去除上清，加入1.0 ml PBS 緩沖液，輕柔混勻，300目篩網(wǎng)過濾后，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

4.5.免疫印記法檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá) 取狀態(tài)正常的各組骨髓單核成纖維細(xì)胞在RIPA 蛋白裂解液中充分裂解。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定各組骨髓單核成纖維細(xì)胞蛋白濃度。采用SDS-PAGE 電泳法進(jìn)行蛋白分離，將蛋白采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用5%封閉液封閉后，使用抗CD4（稀釋比例1∶1 000）、抗CD6（稀釋比例1∶8 000）、抗Cyclin D1（稀釋比例1∶1 000）、抗E2F1（稀釋比例1∶8 000）和抗GAPDH（稀釋比例1∶2 000）一抗孵育，4 ℃過夜，然后使用辣根過氧化物酶（HRP）結(jié)合的二抗室溫孵育1～2 h。通過全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)觀察和記錄蛋白印跡信號(hào)，并使用Gelpro32 軟件分析蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析，圖表采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和制作。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布且方差整齊時(shí)，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布或方差不齊時(shí)，則選擇Bonferroni 校正和Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.各組大鼠外周血細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白含量比較

由表1 結(jié)果可見，模型組白細(xì)胞數(shù)量和血小板數(shù)量低于對(duì)照組，紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白含量高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。治療后1、3、5、7 d，火針組和毫針組白細(xì)胞數(shù)量和血小板數(shù)量高于模型組，紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白含量低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。這表明毫針和火針治療均可以改善環(huán)磷酰胺所致的大鼠骨髓抑制狀態(tài)。

表1 各組SD大鼠外周血細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白含量（）

表1 各組SD大鼠外周血細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白含量（）

注：對(duì)照組和模型組大鼠每天陪同抓取、固定，但是不進(jìn)行治療；火針組大鼠根據(jù)編號(hào)依次將大鼠俯臥固定于鼠板上，選取雙側(cè)足三里穴于造模后第1天、第3天、第5天、第7天，采用火針點(diǎn)刺法治療，火針垂直刺入3 mm，不留針，隔日1次，連續(xù)7 d；毫針組大鼠根據(jù)編號(hào)依次將大鼠俯臥固定于鼠板上，針具、選穴同火針組，垂直刺入3 mm，留針6 min，于造模后第1 天開始，每天1 次，連續(xù)7 d。與對(duì)照組比較，aP＜0.05；火針組與模型組比較，bP＜0.05；毫針組與模型組比較，cP＜0.05；毫針組與火針組比較，dP＜0.05

2.各組大鼠骨髓組織病理學(xué)結(jié)果比較

由圖1 結(jié)果可見，對(duì)照組（A）骨髓組織切片中可見明顯的骨髓原始細(xì)胞（如圖黑色箭頭所示）及桿狀核細(xì)胞（如圖黃色箭頭所示）；模型組（B）骨髓組織切片中僅可見骨髓原始細(xì)胞（如圖黑色箭頭所示），且細(xì)胞數(shù)量明顯減少，并未發(fā)現(xiàn)桿狀核細(xì)胞；毫針組（C）和火針組（D）骨髓組織切片中，與模型組相比，骨髓原始細(xì)胞數(shù)量明顯增加，并且可見桿狀核細(xì)胞。這表明毫針和火針治療對(duì)于骨髓抑制的大鼠有明顯的修復(fù)作用。

圖1 各組SD大鼠骨髓細(xì)胞瑞氏吉姆沙染色結(jié)果比較（×100）。A：對(duì)照組；B：模型組；C：毫針組；D：火針組

3.各組大鼠骨髓單核成纖維細(xì)胞周期結(jié)果比較

由表2 可見，大鼠骨髓抑制建模后，骨髓單核成纖維細(xì)胞周期停留在G0/G1 期，分裂的骨髓單核細(xì)胞無法進(jìn)入S期，進(jìn)而進(jìn)入休眠狀態(tài)。火針組和毫針組G0/G1 期細(xì)胞百分率的變化趨勢基本相同，但火針組和毫針組G0/G1 期骨髓單核成纖維細(xì)胞百分率始終低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中火針組變化較毫針組更顯著（均P＜0.05），且S期和G2/M期骨髓單核成纖維細(xì)胞百分率始終高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。結(jié)果表明毫針和火針可不同程度釋放G1 和S 期骨髓單核成纖維細(xì)胞，使細(xì)胞進(jìn)入快速增殖階段，促進(jìn)骨髓單核成纖維細(xì)胞向各種血細(xì)胞分化，進(jìn)而增加白細(xì)胞和血小板的比例，減少紅細(xì)胞的比例，彌補(bǔ)各種有核血細(xì)胞的缺少，從而有效改善大鼠骨髓抑制狀態(tài)。

表2 各組SD大鼠中骨髓單核成纖維細(xì)胞周期檢測比較（%（）

表2 各組SD大鼠中骨髓單核成纖維細(xì)胞周期檢測比較（%（）

注：對(duì)照組和模型組大鼠每天陪同抓取、固定，但是不進(jìn)行治療；火針組大鼠根據(jù)編號(hào)依次將大鼠俯臥固定于鼠板上，選取雙側(cè)足三里穴于造模后第1天、第3天、第5天、第7天，采用火針點(diǎn)刺法治療，火針垂直刺入3 mm，不留針，隔日1 次，連續(xù)7 d；毫針組大鼠根據(jù)編號(hào)依次將大鼠俯臥固定于鼠板上，針具、選穴同火針組，垂直刺入3 mm，留針6 min，于造模后第1天開始，每天1次，連續(xù)7 d。“-”表示無數(shù)據(jù)。與對(duì)照組比較，aP＜0.05；火針組與模型組比較，bP＜0.05；毫針組與模型組比較，cP＜0.05；毫針組與火針組比較，dP＜0.05

4.各組大鼠單核成纖維細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果比較

選取每組大鼠骨髓單核成纖維細(xì)胞進(jìn)行蛋白表達(dá)量檢測。圖2 和表3 結(jié)果所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠骨髓單核成纖維細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CD4、CD6、Cylcin D1 和E2F1 相對(duì)表達(dá)量明顯下調(diào)（均P＜0.05）；與模型組比較，毫針組和火針組治療后3、7 d大鼠骨髓單核成纖維細(xì)胞中CD4、CD6、Cylcin D1 和E2F1 蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào)（均P＜0.05）；火針組細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CD4、CD6、Cylcin D1和E2F1表達(dá)上調(diào)更顯著（均P＜0.05）。

圖2 各組SD大鼠中單核成纖維細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果

表3 各組SD大鼠中骨髓單核成纖維細(xì)胞蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

表3 各組SD大鼠中骨髓單核成纖維細(xì)胞蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（）

注：對(duì)照組和模型組大鼠每天陪同抓取、固定，但是不進(jìn)行治療；火針組大鼠根據(jù)編號(hào)依次將大鼠俯臥固定于鼠板上，選取雙側(cè)足三里穴于造模后第1天、第3天、第5天、第7天，采用火針點(diǎn)刺法治療，火針垂直刺入3 mm，不留針，隔日1次，連續(xù)7 d；毫針組大鼠根據(jù)編號(hào)依次將大鼠俯臥固定于鼠板上，針具、選穴同火針組，垂直刺入3 mm，留針6 min，于造模后第1 天開始，每天1 次，連續(xù)7 d。與對(duì)照組比較，aP＜0.05；火針組與模型組比較，bP＜0.05；毫針組與模型組比較，cP＜0.05；毫針組與火針組比較，dP＜0.05

討論

本研究表明，毫針和火針治療均可以有效改善大鼠骨髓抑制的癥狀。骨髓抑制大鼠模型的建立可以在動(dòng)物體內(nèi)有效模擬化療藥物使用后，癌癥患者產(chǎn)生骨髓抑制的不良癥狀。在本項(xiàng)研究中，筆者成功創(chuàng)建了骨髓抑制大鼠模型，為骨髓抑制的深入研究和科學(xué)探索提供了的研究基礎(chǔ)和實(shí)踐手段［10］。在本次實(shí)驗(yàn)中，使用腹腔注射環(huán)磷酰胺的方法建立骨髓抑制大鼠模型。環(huán)磷酰胺是臨床常用的化療藥物，主要有抗腫瘤作用。環(huán)磷酰胺能夠與腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)合，打斷腫瘤細(xì)胞的DNA 分子的合成，進(jìn)而阻斷腫瘤細(xì)胞的生長和繁殖［11］。環(huán)磷酰胺的不良反應(yīng)與其劑量相關(guān)，比較常見的不良反應(yīng)有脫發(fā)、惡心嘔吐等。這些不良反應(yīng)都較輕，其嚴(yán)重的不良反應(yīng)是骨髓抑制。環(huán)磷酰胺導(dǎo)致骨髓抑制的分子機(jī)制是打破骨髓中處于休眠和增殖狀態(tài)的造血干細(xì)胞的代謝平衡，最終導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)骨髓抑制［12-14］。骨髓抑制影響生成紅細(xì)胞、血小板和白細(xì)胞的數(shù)量，一般在臨床通過檢測這些不同血細(xì)胞的數(shù)量來進(jìn)行衡量和評(píng)估。

毫針和火針是一門創(chuàng)新的中醫(yī)微創(chuàng)治療技術(shù)，是針灸學(xué)的重要組成部分，是針灸療法中獨(dú)特的治療體系。本研究表明，毫針和火針可改善大鼠骨髓抑制，其作用機(jī)制可能是通過上調(diào)骨髓細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，使造血干細(xì)胞的增殖和休眠重新恢復(fù)平衡，進(jìn)而增加紅細(xì)胞、血小板和白細(xì)胞的數(shù)量［15-16］。另外，足三里穴是足陽明胃經(jīng)的主要穴位之一，屬“土穴”，能夠燥化脾濕，生發(fā)胃氣。如《靈樞》中所述：“邪在脾胃，則病肌肉痛；陽氣有余，陰氣不足，則熱中善饑；陽氣不足，陰氣有余，則寒中腸鳴腹痛；陰陽俱有余，若俱不足，則有寒有熱；皆調(diào)于足三里［17］。”《靈樞》中還講到：“著痹不去，久寒不已，卒取其三里骨為干；腸中不便，取三里……善嘔，嘔有苦，長太息，恐人將捕之，邪在膽，逆在胃，膽液泄則口苦，胃氣逆則嘔苦，故曰嘔膽，取三里以下胃氣逆［18］。”《外臺(tái)》里講到：“凡人年三十以上，苦不灸三里，令人氣上眼？以三里下氣［19］。”可見足三里是治療“本虛”的要穴，可以調(diào)理肝脾，補(bǔ)益氣血，改善腫瘤患者的“本虛”［20］。因此，對(duì)于毫針和火針治療效果來講，足三里穴位的選擇也是極為關(guān)鍵的。

綜上所述，毫針和火針治療大鼠骨髓抑制的可能作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)骨髓單核細(xì)胞中CD4、CD6、Cylcin D1 和E2F1 蛋白的表達(dá)，從而恢復(fù)骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖和休眠的代謝平衡。但是，本研究中并未直接驗(yàn)證毫針和火針對(duì)細(xì)胞周期信號(hào)通路的調(diào)控作用。因此，在今后的研究中，可通過基因敲除和信號(hào)通路抑制等方法進(jìn)一步闡釋毫針和火針治療骨髓抑制的分子機(jī)制，為毫針和火針治療骨髓抑制的臨床應(yīng)用提供更為有利的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明 楊曉琳：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)，分析/解釋數(shù)據(jù)，起草文章，統(tǒng)計(jì)分析；李巖：對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，行政、技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)