Wnt蛋白在皮膚鱗狀細胞癌與基底細胞癌中的表達情況研究

袁燕平 張盧舜

九江學院附屬醫院病理科，九江 332000

非黑色素瘤屬于人類最常見的皮膚惡性腫瘤，包括基底細胞癌（basal cell carcinoma，BCC）和鱗狀細胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）兩個類型。SCC 約占所有皮膚惡性腫瘤的29.4%，而BCC 約占28.0%［1］。BCC 和SCC 的病因及發病機制目前尚不十分清楚，但已證實與紫外線照射、電離輻射、人乳頭瘤病毒、化學致癌物、器官移植和免疫抑制等有關。BCC 的臨床特點是具有局部侵襲性，但是遠處轉移并不常見。BCC 的組織形態有相當大的變異性，存在許多病理學亞型，包括結節型、表淺型、囊腫型、腺樣型、色素型、硬斑型、異形型、纖維上皮瘤和痣樣基底細胞上皮瘤型［2］。SCC 是人類第二常見的皮膚惡性腫瘤。SCC 和BCC 在生物學行為上有所不同，臨床上常常可見SCC 很早就發生轉移。

Wnt 信號通路通常分為經典和非經典信號通路［3-11］。Wnt10a和Wnt10b是經典通路的重要成員，它們可以激活經典的Wnt/β-catenin/Tcf信號通路從而發揮作用，而Wnt5a蛋白主要介導激活非經典Wnt 信號通路。Wnt 信號通路已被證明是許多惡性腫瘤發生發展的重要因素［3-6］。在黑色素瘤、乳腺癌、結直腸癌、原發性肝癌、甲狀腺癌、白血病等腫瘤組織中均發現Wnt 信號通路關鍵蛋白β-catenin 的核內聚集現象。對于Wnt信號通路在黑色素瘤中的作用研究報道較多，現已發現β-catenin 在黑色素瘤細胞胞質和胞核內顯示較高的表達狀態，當黑色素瘤細胞的β-catenin 基因被敲除后，細胞的生長增殖受到抑制，但是轉移能力反而增強，這是因為β-catenin 介導的細胞黏附作用被削弱了［7-8］。為了探索Wnt 信號通路在非黑色素瘤形成中的作用，本試驗同時檢測了SCC 和BCC 中Wnt5a、Wntb、β-catenin 和Wnt10a 的表達情況，結果顯示4 種蛋白在兩種腫瘤中的表達情況大不相同，部分蛋白顯示出明顯的差異化表達。

資料與方法

1.標本和試劑來源

收集2021 年1 月至12 月在九江學院附屬醫院皮膚科就診并且經過病理科確診的33例BCC和33例SCC標本，其中男28例，女38例，年齡45～88歲。

本研究經九江學院附屬醫院醫學倫理委員會批準（L2021023），所獲得的樣本均征得患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

兔抗人Wnt5a（稀釋比1∶200）多克隆抗體和Wnt10a（稀釋比1∶200）多克隆抗體購自Bioss 公司，兔抗人Wnt10a（稀釋比1∶200）多克隆抗體購自proteintech 公司，二抗、SP法免疫組化試劑盒和DAB顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

2.方法

采用SP 法，操作流程如下：所有標本均經10%福爾馬林固定，常規脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，以3 μm 厚度連續切片，微波修復，3%雙氧水封閉內源性過氧化物酶，之后進行血清封閉。依次加入一抗、二抗及鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶，DAB 顯色，蘇木精對比染色，常規脫水，透明，中性樹膠封固。磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照。

3.結果判定

免疫組織化學染色判讀采用著色強度積分與數量積分相加的方法。將陽性細胞百分比分成5 級。無陽性細胞為0 分，陽性細胞≤25%為1 分，25%～≤50%為2 分，50%～≤75%為3 分，＞75%為4 分。著色強度無色為0 分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。著色強度積分與數量積分相加：1 分為（-），2～3 分為（+），4～5 分為（++），6～7 分為（+++），其中（-）和（+）定為陰性，而（++）和（+++）定為陽性。試驗結果由2 位經驗豐富的病理診斷醫生（副主任醫師）采用雙盲法獨立閱片并打分。

4.統計學分析

采用SPSS 19.0 統計軟件進行數據分析，計數資料采用χ2檢驗，當P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1.Wnt10a、Wnt10b、Wnt5a、β-catenin在BCC中的表達

在所有BCC 病例中，腫瘤細胞區域均可見Wnt10b、Wnt5a 和β-catenin 的強烈表達（圖1A、B、C）；部分病例中Wnt10b、Wnt5a 也微弱地表達在間質細胞中（圖1B、C 箭頭所示）；但是，所有病例均未見Wnt10a 的表達，在無論是腫瘤區域還是其他區域均為陰性（圖1D）。

圖1 基底細胞癌（BCC）樣本中β-catenin、Wnt10b、Wnt5a 和Wnt10a的免疫組織化學染色表達情況（免疫組織化學 ×400）。癌組織巢細胞中可見明顯的β-catenin、Wnt10b、Wnt5a 表達（A、B、C），而Wnt10a 則為陰性表達（D）。在腫瘤間質細胞（黑色箭頭）可見Wnt10b、Wnt5a的表達

2.Wnt10a、Wnt10b、Wnt5a和β-catenin在SCC中的表達

在所有SCC 病例中，腫瘤細胞區域均可見Wnt10b、Wnt5a 和β-catenin 的強烈表達（圖2A、B、C）；在病例中Wnt10b、Wnt5a 也微弱地表達在間質細胞中（圖2B、C 箭頭所示）；Wnt10a在所有SCC 病例中呈陰性表達的有23例，呈現陽性表達有10例，陽性表達率為30.3%（10/33）。

圖2 鱗狀細胞癌（SCC）樣本中β-catenin、Wnt10b、Wnt5a 和Wnt10a 的免疫組化染色表達情況（免疫組織化學 ×400）。癌組織細胞中可見明顯的β-catenin、Wnt10b、Wnt5a 和Wnt10a 表達（A、B、C、D），表達部位包括細胞核和細胞漿。在腫瘤間質細胞（黑色箭頭）可見Wnt10b、Wnt5a 的表達，而未見β-catenin 和Wnt10a表達

3.Wnt10a在BCC和SCC中的表達

Wnt10a 在BCC 中的陽性表達率為0，而在SCC 中出現4例中等強度表達，6例強陽性表達，陽性率為30.3%（10/33）。在SCC 中，Wnt10a 主要表達在腫瘤細胞的胞漿，極少表達在胞核區，在腫瘤間質未見表達。Wnt10a 在BCC 和SCC 中的表達差異有統計學意義（χ2=11.785 7，P＜0.05）。見表1、圖3。

圖3 不同鱗狀細胞癌（SCC）樣本中的Wnt10a 的免疫組織化學染色表達情況（A2-C2免疫組織化學 ×400）。絕大部分樣本中未見Wnt10a 表達（A1、A2），個別樣本中可見微弱的Wnt10a 表達于癌巢邊緣腫瘤細胞內（B1、B2），另有少部分樣本中癌組織細胞中可見明顯的Wnt10a 表達（C1、C2），主要位于細胞的胞漿和胞核

表1 Wnt10a在BCC和SCC樣本中的表達情況比較

討論

Wnt 信號通路在調節細胞生長、增殖和分化以及胚胎發育過程中起著重要作用。Wnt 蛋白家族成員的異常表達可導致Wnt 信號通路激活，進而參與多種腫瘤的發生、發展［8，12］。對于Wnt信號通路的最新研究發現，細胞內Wnt信號通路至少有3個分支。⑴經典型Wnt/β-catenin 信號通路：β-catenin 是一種細胞質蛋白，分子量95 kD，它直接與E-鈣黏蛋白的胞內結構域結合，控制著細胞的附著、增殖和分化等功能；⑵JNK 信號通路（planar cell polarity）；⑶Wnt/Ca2+信號通路［12-13］。

目前，對Wnt 信號通路的研究較為深入。Wnt 蛋白是一類分泌糖蛋白，共有19 種，其中屬于經典途徑的有Wnt10a、Wnt8A、Wnt3A、Wnt3、Wnt2、Wnt1、Wnt8B、Wnt10b［12］。Wnt 蛋白與卷曲蛋白和LRP5/6 形成復合物后活化胞內DVL，從而導致降解復合體中GSK-3β 的活性喪失，阻斷β-catenin 的磷酸化進程，這導致β-catenin 逃避活性酶的識別和降解，由此引起細胞內β-catenin 出現堆積，堆積到一定程度后入核結合核轉錄因子，暴露下游靶基因的啟動子，至此靶基因被激活并且表達，致使細胞異常增殖。筆者在BCC 和SCC 中都發現了β-catenin 的過表達和聚集現象，表明經典Wnt信號通路參與了兩種腫瘤的發生，其與皮膚惡性腫瘤關系密切，這一點也與之前的文獻報道相同［8］。

利用轉染的方法抑制多種結直腸癌細胞系中Wnt10a基因表達后，細胞的代謝被明顯抑制，腫瘤細胞的生長速度也明顯降低［14］。其他研究也發現，Wnt10a 蛋白在食管癌、胃癌、腎癌、結直腸癌以及子宮內膜樣癌中也發揮著關鍵性的作用［15-17］。本研究發現，所有BCC 中均未見Wnt10a 表達，而SCC 病例中則有部分樣本出現陽性表達，這說明Wnt10a 積極參與了SCC 的癌變過程。與正常皮膚中的角質形成細胞相比，皮膚SCC 細胞中的β-catenin 表達水平顯著增加［18］，本研究也觀察到相同情況。這表明Wnt10b的高表達激活了Wnt/β-catenin/Tcf 信號通路，細胞內β-catenin不斷累積后，不但促進癌細胞的快速增殖，還導致細胞發生遠處轉移。

人們在研究小鼠乳腺腫瘤病毒時發現，激活Wnt10b 基因后可導致小鼠產生乳腺腫瘤，由此發現了Wnt 蛋白家族新成員——Wnt10b。1997 年Bui等［19］首次發現并描述了與鼠類Wnt10b 同源的人類基因，人類的Wnt10b 基因與鼠類基因在核苷酸和氨基酸水平的一致性分別達到了88%和95%。Wnt10b在人類乳腺癌、前列腺癌骨轉移瘤、原發性肝癌和結腸癌中均出現異常高表達［20］，提示Wnt10b基因的過表達可能和這些腫瘤的發生發展密切相關。本研究觀察到，Wnt10b 在兩種皮膚腫瘤中的表達都是明顯增多的，而在腫瘤細胞中的表達量是高于間質細胞的，說明Wnt10b 積極參與兩種腫瘤的發生發展過程。

Wnt5a也是Wnt蛋白家族重要成員之一，可以激活經典Wnt信號通路，使下游β-catenin蛋白表達增加，進而參與腫瘤的發生發展，但在某些情況下它也可以抑制經典Wnt 信號通路［21-23］。研究發現，Wnt5a 在多種腫瘤中出現異常表達，如骨肉瘤、肝癌、前列腺癌、肺癌等［7，24-25］，Wnt5a 的mRNA 與腫瘤的轉移關系密切，而且也與預后相關。Wnt5a在人體內的表達和作用具有組織器官特異性。因此，它既可以發揮促癌作用，又可發揮抑癌作用。結合本研究結果分析，筆者認為其對皮膚非黑色素腫瘤的促進作用是占主導地位的。

Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤中的作用已經被眾多研究所證實［26-29］，但是筆者查閱文獻發現其在皮膚非黑色素中的作用的研究相對較少。本研究顯示，多種Wnt 蛋白高表達于SCC 和BCC 中，同時發現Wnt10a 在SCC 組織中的表達高于BCC 組織，差異有統計學意義（P＜0.05），說明經典和非經典Wnt 信號通路都參與了二者的發生發展過程，而其中Wnt10a 在兩種腫瘤中發揮的作用不同，其更多地參與了SCC 的癌變過程。Wnt10a 在BCC 和SCC 中有著不同的作用，其內在的機制有待進一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明袁燕平：醞釀和設計試驗，實施研究，采集數據，分析/解釋數據；張盧舜：起草文章，對文章的知識性內容作批評性審閱