PB 試驗結合BBD 響應面法優化納豆γ-聚谷氨酸發酵條件

嚴德林，黃 雷，邱 婧，陳世浪，梅芷晴，張凱旋，楊存義，高向陽,

（1.華南農業大學食品學院廣東省功能食品活性物重點實驗室，廣東廣州 510642；2.華南農業大學廣州都柏林國際生命科學與技術學院，廣東廣州 510642；3.華南農業大學農學院廣東省分子育種重點實驗室，廣東廣州 510642）

納豆由大豆蒸煮后接種納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilisnatto）發酵而成，起源于日本，日本人食用納豆的歷史已長達兩千多年[1-3]。納豆含有豐富的功能物質，如納豆激酶、維生素K2等，具有預防心血管疾病、預防骨質疏松、降血糖、降低血壓和抗氧化等保健功能[4-9]。目前，對納豆的功能物質研究主要集中在納豆激酶和維生素K2，對其他功能物質報道較少。γ-聚谷氨酸（poly-γ-glutamic acid，γ-PGA）是納豆發酵過程產生的一種重要的活性物質，具有抗肥胖、促進鈣吸收等功能[10-12]。γ-PGA 也是納豆黏液的主要成分[13-14]。優質的納豆黏液呈白色，味道清淡或微酸，質地柔軟粘稠，拉絲長，這也是評判優質納豆的重要標準[15-17]。

γ-PGA 是由D/L 谷氨酸單體或兩個對映體通過α-氨基和γ-羧酸基之間的酰胺鍵連接在一起的陰離子多肽，其聚合度在1000～15000 之間，分子量越高，黏度越高[18-19]。γ-PGA 具有良好的水溶性，并且能完全被生物降解，對人體和環境無毒害無污染，在食品、農業、化妝品和醫藥等方面具有廣泛的應用[20-24]。合成γ-PGA 的方法主要有化學合成、肽合成、生物轉化和微生物發酵[25]。微生物發酵法生產γ-PGA 具有效率高、環境污染小、反應條件溫和等優點[26]。

目前，微生物發酵產γ-PGA 多數采用液態發酵，缺乏對納豆食品發酵產γ-PGA 條件優化的相關研究。本實驗采用納豆芽孢桿菌發酵納豆，利用Plackett-Burman 試驗設計結合Box-Behnken 響應面法，以γ-PGA 產生量和納豆感官品質的加權綜合評分為指標，對納豆發酵條件進行優化。確定了納豆γ-PGA 的最佳發酵條件，推動了高產γ-PGA 納豆的市場發展。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納豆芽孢桿菌（Bacillus subtilisnatto）本實驗室保藏；巴西10 號、巴西13 號、華夏3 號、粵小黃1 號、粵小黃2 號、粵小黃3 號6 種品種大豆 華南農業大學農學院大豆分子設計育種實驗室提供；氯化鈉 天津市大茂化學試劑廠；牛肉膏 廣州環凱微生物科技有限公司；蛋白胨、瓊脂粉 北京奧博星生物技術有限責任公司；γ-聚谷氨酸標準品 南京賽泰斯生物科技有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）上海麥克林生化科技有限公司；氫氧化鈉天津福晨化學試劑有限公司；鹽酸 廣州化學試劑廠；無水乙醇 國藥集團化學試劑有限公司。

HZS-H 水浴振蕩器 哈爾濱東聯電子技術開發有限公司；HYL-C3 組合式搖床 山東博科科學儀器有限公司；SW-CJ-2F 潔凈工作臺 蘇靜集團蘇州安泰空氣技術有限公司；YX-24HDD 手提式壓力蒸汽滅菌器 江陰濱江醫療設備有限公司；HC-3018 高速離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；UV-1750 紫外可見分光光度計 日本島津公司；BCD-215YD 冰箱 青島海爾股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制 斜面培養基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.9%，瓊脂1.5%，pH7.2；種子培養基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.9%，pH7.2。上述所有培養基于121 ℃下滅菌30 min 后冷卻待用。

1.2.2 納豆芽孢桿菌的活化和培養 將納豆芽孢桿菌接種于LB 斜面固體培養基上，37 ℃活化24 h，活化2 次。將平板上的納豆芽孢桿菌接種到液體培養基中，在37 ℃恒溫水浴中180 r/min 搖瓶培養24 h，隨后5000 r/min 離心10 min，再加入無菌水，形成1×107CFU/mL 的菌懸液，作為種子液保存。

1.2.3 納豆發酵產γ-PGA 的工藝流程

1.2.3.1 納豆發酵 對大豆進行挑選、清洗，隨后用干凈自來水常溫浸泡18 h。將浸泡好的大豆瀝干，于常壓、121 ℃下蒸煮30 min，自然冷卻至37 ℃左右進行接種（接種后需要攪拌均勻大豆和種子液），發酵。發酵完成后放于4 ℃冰箱下進行后熟24 h[27-28]。

1.2.3.2γ-PGA 的初步純化 稱取1 g 納豆于離心管中，加入10 mL 蒸餾水，8000 r/min 離心15 min，除去菌體，取上清液，加入3 倍體積的無水乙醇，在4 ℃下靜置過夜后，8000 r/min 離心15 min，取沉淀，加入與上清液體積相等的蒸餾水溶解，隨后稀釋20 倍后進行測定。

1.2.4 單因素實驗 通過不同品種大豆發酵納豆，根據發酵結果取最優大豆進行后續發酵工藝實驗。在大豆浸泡pH7.0、接種量4%、裝瓶量15%、發酵溫度37 ℃和發酵時間24 h 的固定條件下，分別考察大豆浸泡pH（6.6、6.8、7.0、7.2、7.4）、接種量（1%、2%、4%、6%、8%）、裝瓶量（5%、10%、15%、20%、25%）、發酵溫度（33、35、37、39、41 ℃）和發酵時間（18、21、24、27、30 h）對納豆發酵工藝的影響。每個因素進行3 次平行實驗，記錄平均值。

1.2.5 Plackett-Burman 試驗設計 Plackett-Burma（PB）是一種2 水平的試驗方法，可以用較少的實驗從眾多影響因素中快速篩選出顯著影響因素[29]。根據前期單因素預實驗結果，對大豆浸泡pH、接種量、裝瓶量、發酵溫度、發酵時間5 個因素進行考察。每個因素選取高（1）和低（-1）兩個水平，設置3 個虛擬列。設計N=12 的PB 試驗（表1）。

表1 Plackett-Burman 試驗設計因素水平Table 1 Plackett-Burman experimental design factor level

1.2.6 最陡爬坡試驗 響應面擬合方程只有在接近最優值（綜合得分最高）的區域才能完全模擬真實情況。因此，需要通過最陡爬坡試驗逼近最優值區域，進行有效的響應面分析。根據PB 試驗結果，得到對綜合得分影響最明顯的3 個因素，并根據其正負效應設計步長和變化方向。估計值為正則為正效應，反之則為負效應，快速達到最優響應區域[30]。

1.2.7 Box-Behnken 響應面試驗 根據PB 試驗和最陡爬坡試驗分析結果確定的3 個因素，以綜合評分為響應值，對每個因素的3 個水平進行（-1、0、+1）編碼。每個試驗點平行3 次。呈現正效應的因素采用高水平，呈現負效應的因素采用低水平。Box-Behnken 試驗設計（BBD）的因素及水平見表2。

表2 Box-Behnken 試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken test

1.2.8γ-PGA 測定 本文參考Yan 等[31]的方法進行發酵納豆γ-PGA 測定。

1.2.8.1γ-PGA 標準溶液的配制 精確稱取一定量的γ-聚谷氨酸標準品，用蒸餾水溶解，稀釋至含量為100 μg/mL 的γ-PGA 標準液。精密量取10、20、30、40、50 mL 上述溶液，分別置于1～5 號容量瓶中，用蒸餾水定容至100 mL，搖勻，得到10～50 μg/mL 的γ-PGA 標準液，待檢測。

1.2.8.2 CTAB 溶液的配制 配制2% NaOH 溶液，并以此為溶劑，加入CTAB，攪拌溶解，配制成5 g/L的CTAB 試液。

1.2.8.3 CTAB 比濁法 取2 mL 待測液于試管中，準確加入2 mL CTAB 試液，輕微振蕩，靜置3 min，將反應液倒入比色皿中，以蒸餾水和CTAB 試液混合作為空白，測定在波長224 nm 下的吸光值。以γ-PGA 標準品濃度為橫坐標，224 nm 處的吸光值為縱坐標，得到γ-PGA 標準曲線的線性方程為Y=0.0216X+0.0734，R2=0.9913。將所測得的樣品吸光值代入標準曲線，并根據下式（1）計算γ-PGA 含量：

1.2.9 感官評價方法 由經過專業培訓的人員組成評價小組（5 男5 女）對納豆的色澤、氣味、滋味和拉絲進行評分，分值范圍為0～10 分[32]。納豆感官評分標準見表3。

表3 納豆感官評價表Table 3 Natto sensory evaluation table

1.2.10 綜合評分的計算方法 以γ-PGA 產量和感官評價的綜合評分為指標進行分析[33]，如下式（2）：

1.3 數據處理

每個樣品重復測定3 次，利用Desgin-Expert 8.06 軟件對試驗結果進行分析，優化各因素最優條件并根據預測結果進行驗證。采用SPSS 16.0 對數據進行顯著性和誤差分析，采用Origin 2018 作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素優化發酵條件

2.1.1 不同大豆品種篩選 在一定發酵條件下，測定巴西10 號、巴西13 號、華夏3 號、粵小黃1 號、粵小黃2 號、粵小黃3 號6 種品種納豆的感官總分及γ-PGA 含量，計算綜合評分。由圖1 可知，6 種品種大豆發酵納豆產γ-PGA 及其感官品質有一定的差異。整體上看，華夏大豆和粵小黃大豆發酵納豆γ-PGA產生量及其感官品質高于巴西大豆發酵納豆，且γ-PGA 產生量和納豆感官品質呈一定的正比關系。粵小黃2 號納豆γ-PGA 產生量和綜合評分最高，分別達到3.28 mg/g 和9.45，華夏3 號感官總分最高為31.83。巴西10 號納豆γ-PGA 產生量和綜合評分最低，分別為2.30 mg/g 和8.07，粵小黃3 號感官總分最低為30.00。根據以上結果，選用γ-PGA 產生量和綜合評分最高的粵小黃2 號進行后續的發酵實驗。

圖1 不同大豆品種發酵納豆產γ-PGA 的差異Fig.1 The difference of γ-PGA produced by fermented natto from different soybean varieties

2.1.2 不同大豆浸泡pH 對納豆發酵產γ-PGA 的影響 測定大豆浸泡pH6.6、6.8、7.0、7.2、7.4 的粵小 黃2 號納豆的感官總分及γ-PGA 含量，計算綜合評分，大豆浸泡pH 對納豆品質的影響如圖2 所示。由圖2 可知，隨著浸泡pH 的增大，γ-PGA 產生量及綜合評分呈現出先上升后下降的趨勢，當浸泡pH 達到7.2 時，γ-PGA 產生量及綜合評分達到最大值，之后開始降低。可能是因為pH 過高或者過低，不利于菌株生長繁殖，最終形成芽孢，停止產γ-PGA[34]。但是納豆的感官總分幾乎保持不變，說明此pH 區間對納豆感官品質的影響不大。因此，納豆發酵產γ-PGA的大豆最佳pH 為7.2。

圖2 不同大豆浸泡pH 對納豆發酵產γ-PGA 的影響Fig.2 Effects of different soybean soaking pH values on the production of γ-PGA by natto fermentation

2.1.3 不同接種量對納豆發酵產γ-PGA 的影響 測定接種量為1%、2%、4%、6%、8%的粵小黃2 號納豆的感官總分及γ-PGA 含量，計算綜合評分。接種量對納豆品質的影響如圖3 所示，由圖3 可得，隨著接種量的增大，納豆γ-PGA 產生量、感官總分和綜合評分呈現出先急速上升后緩慢下降的趨勢。當接種量小于4%時，三個評價指標均處于低水平。這是因為當接種量較低時，納豆芽孢桿菌不能將納豆充分發酵，但當接種量達4%時，納豆芽孢桿菌能最大程度地利用大豆中的營養物質，使γ-PGA 產生量、感官總分和綜合評分達到最佳。當接種量大于4%時，三個評價指標緩慢下降。可能是菌量過多，形成競爭。也可能是由于營養物質的減少與其代謝產物的增加抑制了發酵過程，導致納豆γ-PGA 產生量變少，感官總分和綜合評分降低[3]。因此，納豆發酵產γ-PGA 的最佳接種量為4%。

2.1.4 不同裝瓶量對納豆發酵產γ-PGA 的影響 測定裝瓶量為5%、10%、15%、20%、25%的粵小黃2 號納豆的感官總分及γ-PGA 含量，計算綜合評分，裝瓶量對納豆品質的影響如圖4 所示。由圖4 可得，隨著裝瓶量的增大，納豆γ-PGA 產生量、感官總分和綜合評分呈現出先急速上升后下降的趨勢。當裝瓶量為20%時，納豆γ-PGA 產生量、感官總分和綜合評分最高，這與周雪琴等[34]、Yang 等[35]的研究結果一致。這可能是因為裝瓶量過少時，營養物質缺乏，不足以支撐菌株的生長繁殖，最終形成芽孢，停止產γ-PGA；當裝瓶量過多時，會導致營養物質不能被最大利用，發酵不完全，感官品質不夠好。因此，納豆發酵產γ-PGA 的最佳裝瓶量為20%。

圖4 不同裝瓶量對納豆發酵產γ-PGA 的影響Fig.4 Effects of different bottling quantities on production of γ-PGA by natto fermentation

2.1.5 不同發酵溫度對納豆發酵產γ-PGA 的影響溫度是影響微生物生長與代謝的重要原因。測定發酵溫度為33、35、37、39、41 ℃的粵小黃2 號納豆的感官總分及γ-PGA 含量，計算綜合評分。發酵溫度對納豆品質的影響如圖5 所示，由圖5 可知，隨著發酵溫度的增大，納豆γ-PGA 產生量、感官總分和綜合評分呈現出先急速上升后緩慢下降的趨勢。當發酵溫度為37 ℃時，納豆γ-PGA 產生量、感官總分和綜合評分最高，這與Feng 等[36]的研究結果相近。溫度過高或過低不僅對菌株的正常生長有影響，而且發生反應所需要的酶在高溫下失活，在低溫下活性受到較大的抑制，從而導致γ-PGA 的產量降低，發酵不完全，感官品質變差[26]。因此，納豆發酵產γ-PGA 的最佳發酵溫度為37 ℃。

圖5 不同發酵溫度對納豆發酵產γ-PGA 的影響Fig.5 Effects of different fermentation temperatures on γ-PGA production by natto fermentation

2.1.6 不同發酵時間對納豆發酵產γ-PGA 的影響測定發酵時間為18、21、24、27、30 h 的粵小黃2 號納豆的感官總分及γ-PGA 含量，計算綜合評分。發酵時間對納豆品質的影響如圖6 所示，由圖6 可知，隨著發酵時間的延長，納豆γ-PGA 產生量、感官總分和綜合評分迅速增長，當發酵時間達24 h 時，三個評價指標達到最大，這與陳樂樂等[3]、Yang 等[35]的研究結果一致。之后γ-PGA 產生量、感官總分和綜合評分隨時間的增加趨于平穩或緩慢降低。發酵時間的長短對菌株的繁殖及成品納豆的性質都會有一定影響。發酵初期，納豆菌代謝加快產物積累，γ-PGA產生量、感官總分升高；隨著發酵時間到一定的范圍，納豆菌代謝下降，逐漸不轉化剩余的營養物質，故γ-PGA 產生量、感官總分趨于平穩或者緩慢降低[37]。因此，納豆發酵產γ-PGA 的最佳發酵時間為24 h。

圖6 不同發酵時間對納豆發酵產γ-PGA 的影響Fig.6 Effects of different fermentation time on the production of γ-PGA by natto fermentation

2.2 Plackett-Burman 試驗

納豆發酵產γ-PGA 綜合評分的Plackett-Burman試驗結果及方差分析見表4、表5。利用 Design Expert 8.0.6 軟件，以綜合評分Y 為響應值，得到回歸方程為Y=7.81-0.018A-0.017B-0.050C+0.66D+0.33E，R2=0.9987。表明該回歸方程模型的擬合度良好，回歸方程具有代表性。其中R2adj=0.9976，表明模型適用于99.76%的效應值。表5 方差分析結果顯示，發酵溫度（D）、發酵時間（E）、裝瓶量（C）的結果對綜合分數（Y）有較顯著影響（P＜0.01），各因素影響的大小為D＞E＞C，其他2 個因素影響不顯著，故取發酵溫度、發酵時間和裝瓶量這三個因素進行后續爬坡試驗。

表4 Plackett-Burman 試驗設計與結果Table 4 Plackett-Burman test design and results

表5 Plackett-Burman 試驗設計方差分析Table 5 Analysis of variance for Plackett-Burman trial design

2.3 最陡爬坡試驗結果

從表6 中可以看出，隨著裝瓶量、發酵溫度、發酵時間這三個重要因素的趨勢性變化，納豆γ-PGA 產生量、感官總分和綜合評分呈先上升后下降的趨勢，并且在第3 組實驗的條件下，三個指標達到最高。因此，以該試驗組為下一步響應面的中心試驗點，進行響應面試驗。

表6 最陡爬坡試驗設計及結果Table 6 Test design and results of steepest climb

2.4 響應面分析結果

納豆發酵產γ-PGA 綜合評分的響應面分析試驗結果見表7，回歸模型的方差分析見表8。利用Design Expert 8.0.6 軟件對表7 中綜合評分數據進行二次多元回歸擬合，回歸方程如下：Y綜合評分=10.04-0.029A+0.065B+0.096C+5.000E-003AB-7.500E-003AC+0.010BC-0.27A2-0.60B2-0.25C2。

表7 Box-Behnken 試驗設計及結果Table 7 Box-Behnken test design and results

表8 Box-Behnken 試驗回歸模型及方差分析Table 8 Box-Behnken test regression model and variance analysis

由表8 可知，綜合評分模型的F值為47.09，P＜0.0001，說明模型均高度顯著，模型成立。失擬項為4.14，P＞0.05 不顯著，說明未知因素對實驗的影響小。該模型R2為0.9838，R2adj為0.9629，即表明該模型可以解釋96.29%的納豆發酵綜合評分的變化，僅有大概3.71%變化不能被預測。模型與實際實驗的擬合程度好，可用于分析與預測各因素對納豆發酵產γ-PGA 綜合評分的影響。由表8 可知，方程中一次項B 對納豆發酵產γ-PGA 的綜合評分影響顯著（P＜0.05），而一次項C 對納豆發酵產γ-PGA 的綜合評分影響較顯著（P＜0.01），二次項A2、B2、C2的影響極顯著（P＜0.001），說明各因素對納豆發酵產γ-PGA 綜合評分的影響呈二次關系，而非簡單的線性關系。由F值檢驗可知各因素對綜合評分影響的大小順序為：C＞B＞A，即發酵時間＞發酵溫度＞裝瓶量。

2.5 響應面因素間的交互作用分析

為了更直觀地觀察3 因素之間的交互作用，確定綜合評分最高點。根據上述回歸方程和回歸模型方差分析表，利用Design-expert 軟件繪制響應面分析圖及其等高線圖（圖7）。每個響應面代表在保持一個變量的最優條件下，其他兩個自變量之間的交互作用對納豆發酵產γ-PGA 綜合評分的影響。

圖7 兩兩因素交互作用對綜合評分影響的響應面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour map of the interaction of pairwise factors on the comprehensive score

從圖7 的響應面分析圖可以看出，在一個變量確定的情況下，其他兩個因素對綜合評分的影響基本呈拋物線狀，且存在極大值點，變化趨勢為先增大后減小。響應面越陡，等高線的疏密度分布越不均勻，說明交互作用越大。圖7 的（a）、（c）圖中曲面相對較為陡峭，（b）、（d）圖中等高線的疏密度分布較不均勻、呈近似馬鞍形[38]，說明裝瓶量與發酵溫度、裝瓶量與發酵時間均有一定交互作用，對綜合評分有一定的影響，但不顯著，與表8 中的P值相對應（P＞0.05）。圖7 的（e）圖雖然曲面相對較為陡峭，但是其等高線（f）圖近似圓形，說明發酵溫度與發酵時間的交互作用不顯著，這與回歸模型中的方差分析結果一致。

2.6 驗證實驗

回歸模型預測的納豆發酵產γ-PGA 最優發酵條件及綜合評分為：裝瓶量19.89%，發酵溫度37.06 ℃，發酵時間24.20 h，綜合評分為10.05。根據實際情況，將發酵條件修正為裝瓶量19.90%、發酵溫度37.10 ℃、發酵時間24.20 h，進行3 次平行發酵驗證實驗。結果得出，γ-PGA 產量為3.65 mg/g，感官總評分為31.67 分，綜合評分為10.04 分。實際值與預測值無顯著性差異（P＞0.05），說明得到的最優發酵條件參數可靠，模型得到的實驗結果具有較強的實際意義。

3 結論

以γ-PGA 產生量和納豆感官總分的綜合評分為依據，對納豆發酵產γ-PGA 進行工藝優化。結果表明：在大豆浸泡pH、接種量、裝瓶量、發酵溫度和發酵時間單因素優化實驗的基礎上，采用Plackett-Burman 試驗設計方法篩選出對綜合評分影響最大的3 個因素是裝瓶量、發酵溫度和發酵時間。通過最陡爬坡試驗選取接近綜合得分最高的3 個重要水平，最后通過Box-Behnken 響應面試驗設計，得到納豆發酵產γ-PGA 的最優實際發酵條件：裝瓶量19.90%、發酵溫度37.10 ℃、發酵時間24.20 h，此時，綜合評分為10.05。最終驗證實驗的綜合評分為10.04，與預測值相差不大。這說明模型得到的預測結果穩定可靠，能夠指導實際生產應用。