歐李果渣原花青素提取工藝優(yōu)化及其體外抗氧化和降糖活性評價(jià)

張曉冰，張羽師，王 雨，趙錦江，王笑雪，劉舒鵬，李衛(wèi)東

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488）

歐李（Cerasus humilis（Bge.）Sok.）是薔薇科櫻屬小灌木，其果肉中含有多酚、維生素、氨基酸與多肽以及多種礦物質(zhì)，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值[1]。本團(tuán)隊(duì)前期研究表明，京歐系列歐李果富含多酚類成分，歐李鮮果肉中四大類主要多酚類成分，即總酚、總黃酮、總原花青素和總花青素含量分別可達(dá)1899 mg/100 g FW、1861 mg/100 g FW、1082 mg/100 g FW和39.3 mg/100 g FW[2]。近年來，隨著歐李產(chǎn)品開發(fā)研究的進(jìn)一步擴(kuò)大，歐李果汁、果酒等多種食品加工逐步形成產(chǎn)業(yè)化，但加工過程中，歐李果肉榨汁后產(chǎn)生的大量歐李果渣作為廢棄物被丟棄，造成了資源浪費(fèi)。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄皮渣和花生紅衣一類的加工副產(chǎn)品富含原花青素，具有作為原花青素新來源的潛力[3]。同時(shí)，對此類副產(chǎn)品的利用符合循環(huán)經(jīng)濟(jì)理念，即副產(chǎn)品在被作為廢物丟棄之前被盡可能多的再利用和提取[4]，但有關(guān)歐李果渣資源回收開發(fā)的研究仍為空白。

原花青素是由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素縮合而成的聚合物，又稱縮合單寧[5]。原花青素在植物的根、莖、葉、花、果實(shí)、種子中均有分布，具有抗氧化、抗炎、抗糖尿病、抗衰老[6-11]等多種藥理作用，其在體內(nèi)的抗氧化活性是VC的20 倍、VE的50 倍[12-13]。此外，原花青素還可以通過與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合和競爭性抑制消化酶而發(fā)揮降血糖作用[14]。原花青素已經(jīng)成為食品、醫(yī)藥、化妝品和工業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[15-16]。原花青素提取主要以紫甘藍(lán)、藍(lán)靛果、蔓越莓等為原材料，采用有機(jī)溶劑萃取法、酶提取法、微波、超聲輔助[17-19]等方法。田爭福[20]采用響應(yīng)面法對歐李鮮果原花青素的超聲輔助提取法進(jìn)行了優(yōu)化，歐李果渣中可能也具有較高含量和良好活性的原花青素，但目前對于歐李果渣原花青素的含量、提取工藝和活性研究尚處空白。

本研究采用超聲波輔助提取法提取歐李果渣中的原花青素，以原花青素得率為評價(jià)指標(biāo)，采用單因素和正交試驗(yàn)得出最佳提取工藝，并進(jìn)一步考察歐李果渣原花青素的體外抗氧化和降血糖活性。本研究旨在促進(jìn)歐李產(chǎn)業(yè)副產(chǎn)物的合理利用，進(jìn)一步拓展歐李資源綜合開發(fā)并提升市場價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

歐李果渣 取自寧夏林業(yè)研究院股份有限公司；原花青素B1（批號：PS010162，HPLC 含量≥97.0%）成都普思生物科技股份有限公司；抗壞血酸（批號：20211011）天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（DPPH，批號：C143 57523）、2,2'-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，批號：C14003395），2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ，批號：C14194535）上海麥克林生化科技有限公司；過硫酸鉀（批號：20210116）、無水乙醇（分析純）福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；三氯化鐵六水合物（批號：C1518022）、醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH3.7）

國家化學(xué)試劑質(zhì)檢中心；阿卡波糖（批號：S25 M11X109783）、PBS 溶液（pH6.8）、α-葡萄糖苷酶（活力≥50 units/mg protein，批號：N25HS202422）上海源葉生物科技有限公司；PBS 溶液（pH7.2～7.4，批號：0824A21）北京雷根生物技術(shù)有限公司；無水碳酸鈉 分析純，北京化工廠；娃哈哈水 杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；鹽酸 分析純，北京市通廣精細(xì)化工公司。

BT25S 型1/100000 電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；RE-52 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHZ-Ⅲ型真空泵 上海亞榮生化儀器廠；FD-2A 型真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；KQ-400KDE 型高功率數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；BY-G20 型高速離心機(jī) 北京白洋醫(yī)療器械有限公司；Synergy2 多功能酶標(biāo)儀 美國BioTek 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 歐李果渣原花青素提取工藝流程 取歐李果渣樣品，剪刀剪碎，準(zhǔn)確稱取歐李果渣2.00 g，在超聲功率500 W 的條件下，以一定的乙醇濃度、超聲時(shí)間、超聲溫度和液料比進(jìn)行超聲波輔助提取，5163×g 離心力離心5 min，取上清液，即為歐李果渣原花青素提取液。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 乙醇濃度對歐李果渣原花青素得率的影響在液料比為1:30 g/mL，超聲溫度為50 ℃，超聲時(shí)間為40 min，乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%的條件下，考察乙醇濃度對歐李果渣原花青素得率的影響。

1.2.2.2 超聲溫度對歐李果渣原花青素得率的影響在液料比為1:30 g/mL，乙醇濃度為60%，超聲時(shí)間為40 min，超聲溫度分別為30、40、50、60、70 ℃的條件下，考察超聲溫度對歐李果渣原花青素得率的影響。

1.2.2.3 超聲時(shí)間對歐李果渣原花青素得率的影響在液料比為1:30 g/mL，超聲溫度為50 ℃，乙醇濃度為60%，超聲時(shí)間分別為20、30、40、50、60 min的條件下，考察超聲時(shí)間對歐李果渣原花青素得率的影響。

1.2.2.4 料液比對歐李果渣原花青素得率的影響在乙醇濃度為60%，超聲溫度為50 ℃，超聲時(shí)間為40 min，料液比分別為1:20、1:25、1:30、1:35、1:40 g/mL 的條件下，考察料液比對歐李果渣原花青素得率的影響。

1.2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對每個(gè)因素選擇合適的水平，應(yīng)用正交表（表1），開展L9（34）正交試驗(yàn)，根據(jù)得率得出歐李果渣原花青素的最佳提取工藝。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factor levels for orthogonal tests

1.2.4 原花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取50 μL原花青素B1 梯度稀釋溶液（0、0.01、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mg/mL）于96 孔板中，加入用無水乙醇:水:濃鹽酸=6:1:1 的酸化乙醇配制的濃度為0.1%的4-二甲基氨基肉桂醛（DMAC）200 μL，靜置20 min 后在640 nm 波長處測定吸光度。以原花青素B1 濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=7.223X+0.0439（0～0.3 mg/mL，R2=0.9999）。

1.2.5 原花青素含量測定 取原花青素提取液，稀釋5 倍。按1.2.4 方法進(jìn)行顯色并測定樣品的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算提取液中原花青素的濃度，再計(jì)算出得率，即每克歐李果渣中提取的原花青素質(zhì)量。計(jì)算公式如下：

式中：W 為歐李果渣原花青素得率，mg/g；C 為根據(jù)吸光度度計(jì)算出的原花青素濃度，mg/mL；V 為原花青素提取液體積，mL；f 為稀釋倍數(shù)；M 為歐李果渣取樣量，g。

1.2.6 抗氧化活性測定 按照最佳提取工藝得到歐李果渣原花青素提取液，經(jīng)AB-8 大孔樹脂法和明膠沉淀法純化，凍干可得到純度為≥98.1%的原花青素粉末，取凍干樣品配制成1 mg/mL 的樣品溶液并進(jìn)行梯度稀釋，用于活性測定。

1.2.6.1 DPPH 自由基清除率的測定 參考繆園欣等[21]的方法，稱取0.1984 g DPPH 用無水乙醇溶解并定容至50 mL，配制成0.1 mmol/L 的DPPH 儲備液，取0.05、0.15、0.25、0.35、0.45、0.55 mg/mL 的樣品溶液各100 μL 和等體積的0.1 mmol/L 的DPPH無水乙醇溶液加入96 孔板，充分混勻避光反應(yīng)30 min，于517 nm 波長處測定吸光度。用VC作陽性對照，每種樣品測定3 次，根據(jù)公式計(jì)算DPPH 自由基清除率：

式中：A1為樣品吸光度；A2為樣品本底的吸光度；A0用無水乙醇代替樣品測定的吸光度。

1.2.6.2 ABTS+自由基清除率的測定 參考王晗等[22]的方法，將7.5 mmol/L 的ABTS 溶液與2.5 mmol/L的K2S2O8溶液等體積混合，室溫避光放置12～16 h，形成ABTS 儲備液。用0.1 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液（pH7.4）稀釋ABTS 儲備液，使其在734 nm 處的吸光度為0.70±0.02，將150 μL 的ABTS 稀釋液分別與5、15、25、35、45、55 μg/mL 的樣品溶液各50 μL混合，室溫避光反應(yīng)6 min 后測定734 nm 處的吸光度。用VC作陽性對照，每種樣品測定3 次，根據(jù)公式計(jì)算ABTS+自由基清除率：

式中：A1為樣品吸光度；A2為樣品本底的吸光度；A0用水代替樣品測定的吸光度。

1.2.6.3 FRAP 法對鐵離子還原能力的測定 參考李新原等[23]的方法，配制10 mmol/L 的TPTZ 溶液、20 mmol/L 的三氯化鐵溶液低溫避光備用。按照10:1:1 的比例混合醋酸緩沖液（pH3.7）、10 mmol/L TPTZ 溶液和20 mmol/L 三氯化鐵溶液配制FRAP工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。將樣品溶液稀釋至6 個(gè)不同質(zhì)量濃度：0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL。于96 孔板中加入50 μL 不同質(zhì)量濃度的待測溶液，再加入200 μL FRAP 工作液。室溫避光反應(yīng)20 min，測定593 nm 處的吸光度。用VC作陽性對照，每個(gè)樣本重復(fù)3 次。

用去離子水將100 mmol/L FeSO4·7H2O 溶液梯度稀釋，取50 μL 不同濃度的Fe2+標(biāo)準(zhǔn)溶液于96 孔板中，加入FRAP 工作溶液200 μL，室溫下避光反應(yīng)20 min，測定593 nm 處的吸光度。每個(gè)濃度重復(fù)3 次。以FeSO4的濃度（mmol/L）為自變量，以扣除空白對照的吸光度為因變量作圖，并進(jìn)行線性擬合，得到FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=3.4094X+0.0091（0～0.5 mmol/L，R2=0.9995）。根據(jù)回歸方程計(jì)算出對應(yīng)的FeSO4濃度，即為FRAP 值，此值越大，表明其鐵離子還原能力越強(qiáng)。

1.2.7 抑制α-葡萄糖苷酶的活性測定 參考孫美玲等[24]的方法，取0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/mL 的樣品溶液各10 μL 分別與等體積的α-葡萄糖苷酶（8.335 nkat/mL）均勻混合，于37 ℃下保溫15 min。然后加入20 μL 的pNPG（5 mmol/L，溶解于pH 為6.8 的0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液中）在37 ℃反應(yīng)30 min，添加150 μL Na2CO3（1 mol/L）終止反應(yīng)，在405 nm 處測定吸光度。以阿卡波糖為陽性對照，等體積磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 為6.8）代替α-葡萄糖苷酶溶液作對照組，抑制率公式如下：

式中：W 為樣品溶液或阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率；A 為樣品的吸光度；A0為對照組的吸光度；A1為PBS 和pNPG 溶液與酶溶液混合反應(yīng)的吸光度；A2為PBS 和pNPG 溶液混合反應(yīng)的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用3 次平行數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，均使用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Microsoft Office Excel 2019 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析；使用GraphPad Prism8 軟件進(jìn)行繪圖、IC50值計(jì)算和基于Turkey 多重檢驗(yàn)的單因素ANOVA 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對歐李果渣原花青素得率的影響如圖1 所示，歐李果渣中原花青素得率隨著乙醇濃度的提高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，當(dāng)乙醇濃度為60%時(shí)，原花青素得率最大。當(dāng)乙醇濃度高于60%后，原花青素的得率下降。這是由于乙醇濃度的增大，脂溶性成分溶出增加，導(dǎo)致原花青素得率下降[25]。也有可能與不同濃度的乙醇極性或者高濃度乙醇對原花青素分子破壞有關(guān)[26]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，乙醇濃度選取50%～70%。

圖1 乙醇濃度對歐李果渣原花青素得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of proanthocyanidins from Cerasus humilis pomace

2.1.2 超聲溫度對歐李果渣原花青素得率的影響如圖2 所示，歐李果渣中原花青素得率在30～50℃范圍內(nèi)隨著溫度升高而增加，已有研究證明酚類物質(zhì)釋放速率和物質(zhì)的量隨溫度升高而增加[27]。當(dāng)溫度高于50 ℃后，原花青素得率不斷降低。高溫會導(dǎo)致原花青素穩(wěn)定性降低[28]，原花青素的結(jié)構(gòu)被破壞，高溫下其他成分也可能溶出，以致原花青素的含量下降。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，超聲溫度選取40～60 ℃。

圖2 超聲溫度對歐李果渣原花青素得率的影響Fig.2 Effect of sonication temperature on the yield of proanthocyanidins from C.humilis pomace

2.1.3 超聲時(shí)間對歐李果渣原花青素得率的影響如圖3 所示，超聲時(shí)間為40 min 時(shí)，原花青素得率最大，超聲時(shí)間多于40 min 時(shí)，隨著超聲時(shí)間的延長，原花青素的得率逐漸降低。當(dāng)時(shí)間低于40 min 時(shí)，原花青素可能溶出還不夠充分，但時(shí)間過長原花青素可能會與空氣中的氧氣發(fā)生氧化反應(yīng)[29]，導(dǎo)致得率下降。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，超聲時(shí)間選取30～50 min。

圖3 超聲時(shí)間對歐李果渣原花青素得率的影響Fig.3 Effect of sonication time on the yield of proanthocyanidins from C.humilis pomace

2.1.4 料液比對歐李果渣原花青素得率的影響 如圖4 所示，料液比在1:20～1:30 g/mL 范圍內(nèi)，原花青素得率呈明顯上升趨勢，當(dāng)料液比超過1:30 g/mL后，原花青素得率呈下降趨勢。這可能是因?yàn)樵诹弦罕葹?:30 g/mL 時(shí)，原花青素已經(jīng)基本溶出，因此隨著溶劑體積的增加，其他成分可能會溶出，與原花青素反應(yīng)或干擾原花青素穩(wěn)定性，導(dǎo)致原花青素的得率反而降低[30]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，料液比選取1:25～1:35 g/mL。

圖4 料液比對歐李果渣原花青素得率的影響Fig.4 Effect of material-liquid ratio on the yield of proanthocyanidins from C.humilis pomace

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對乙醇濃度、超聲溫度、超聲時(shí)間、料液比4 個(gè)因素進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。

表2 歐李果渣原花青素提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal tests on the extraction process of proanthocyanidins from C.humilis pomace

由表2 可知，4 個(gè)因素對歐李果渣中原花青素提取得率的影響順序?yàn)椋撼暅囟龋玖弦罕龋境晻r(shí)間＞乙醇濃度，最佳提取工藝為A3B3C2D2，即乙醇濃度70%，超聲溫度60 ℃，超聲時(shí)間40 min，料液比1:30 g/mL，在此條件下進(jìn)行歐李果渣中原花青素提取，原花青素得率為15.37 mg/g，高于實(shí)驗(yàn)中所有結(jié)果，該工藝條件穩(wěn)定可靠。

2.3 歐李果渣原花青素體外抗氧化活性

2.3.1 DPPH 自由基清除能力 歐李果渣原花青素和VC的DPPH 自由基清除能力測定結(jié)果如圖5 所示。歐李果渣原花青素和VC溶液對DPPH 自由基的清除率隨著濃度增加而升高。在濃度為0.05～0.55 mg/mL 的濃度范圍內(nèi)，歐李果渣原花青素的DPPH 自由基清除率從38.43%增加到74.87%，VC的DPPH 自由基清除率從16.07%增加到57.84%。歐李果渣原花青素和Vc 的IC50值分別為0.10 和0.35 mg/mL，歐李果渣原花青素的IC50值顯著低于Vc 的IC50值（P＜0.05）。結(jié)果表明，歐李果渣原花青素比VC具有更強(qiáng)的DPPH 自由基清除能力。

2.3.2 ABTS+自由基清除能力 歐李果渣原花青素和VC的ABTS+自由基清除能力測定結(jié)果如圖6 所示。歐李果渣原花青素和VC溶液對ABTS+自由基的清除率隨著濃度增加而升高，在濃度為5～55 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，歐李果渣原花青素的ABTS+自由基清除率從43.36%增加到99.78%，VC的ABTS+自由基清除率從14.87%增加到98.68%。歐李果渣原花青素和VC的IC50值分別為7 和26 μg/mL，歐李果渣原花青素的IC50值顯著低于VC的IC50值（P＜0.05）。結(jié)果表明，歐李果渣原花青素比VC具有更強(qiáng)的ABTS+自由基清除能力。

圖6 歐李果渣原花青素對ABTS+自由基的清除作用Fig.6 Scavenging of ABTS+· by proanthocyanidins from C.humilis pomace

2.3.3 FRAP 法測鐵離子還原能力 歐李果渣原花青素和VC的鐵離子還原能力測定結(jié)果如圖7 所示。歐李果渣原花青素和VC溶液的FRAP 值隨著濃度增加而升高。在濃度為0.01～0.06 mg/mL 的濃度范圍內(nèi)，歐李果渣原花青素的FRAP 值從0.07 mmol/L增加到0.40 mmol/L，VC的FRAP 值從0.04 mmol/L增加到0.36 mmol/L，歐李果渣原花青素的FRAP 值顯著高于VC的FRAP 值（P＜0.05）。結(jié)果表明，在相同濃度下，歐李果渣原花青素比VC具有更強(qiáng)的鐵離子還原能力。

圖7 歐李果渣原花青素的鐵離子還原能力Fig.7 Iron ion reducing power of proanthocyanidins from C.humilis pomace

2.4 歐李果渣原花青素體外降糖活性

歐李果渣原花青素和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的活性抑制測定結(jié)果如圖8 所示。歐李果渣原花青素和阿卡波糖溶液隨著濃度增加對α-葡萄糖苷酶抑制率升高。在濃度為0.02～0.12 mg/mL 的濃度范圍內(nèi)，歐李果渣原花青素對α-葡萄糖苷酶抑制率從23.24%增加到87.92%，阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制率從27.06%增加到97.48%。歐李果渣原花青素和阿卡波糖的IC50值分別為0.056 和0.046 mg/mL。結(jié)果表明，歐李果渣原花青素具有一定的降糖效果，但弱于阿卡波糖，其可視為一種有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑。

圖8 歐李果渣原花青素的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用Fig.8 Inhibition of α-glucosidase activity by proanthocyanidins from C.humilis pomace

3 結(jié)論

本研究采用超聲波輔助溶劑方式對歐李果渣原花青素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過單因素和正交試驗(yàn)得到最佳工藝條件：乙醇濃度70%，超聲溫度60 ℃，超聲時(shí)間40 min，料液比1:30 g/mL，在此條件下，歐李果渣原花青素得率為15.37 mg/g。通過對純化后的歐李果渣原花青素進(jìn)行體外抗氧化和降糖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對自由基的清除能力和抗氧化活性均顯著強(qiáng)于VC，也具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制能力，但其抗氧化和降血糖能力綜合評價(jià)仍需要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究為歐李果渣原花青素的產(chǎn)品開發(fā)以及歐李果渣的資源利用提供一定的理論依據(jù)，具有較好的應(yīng)用前景。