低共熔溶劑在類胡蘿卜素提取上的應用研究進展

高婧宇，謝龍莉，陳 楠，吳 帆，彭 郁，李 茉，倪元穎，溫 馨

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

類胡蘿卜素是一類重要的天然色素，普遍存在于動物、高等植物、藻類、真菌及細菌中[1]。類胡蘿卜素是脂溶性四萜類化合物，具有聚異戊二烯結構，按照官能團的不同，可將其分為兩大類：烴類和含氧類胡蘿卜素（圖1）[2]。烴類類胡蘿卜素的分子結構中只含有碳氫元素，如β-胡蘿卜素和番茄紅素；而含氧類胡蘿卜素的分子結構中除碳氫元素外，還含有氧元素，具有環氧基、羥基、酮基、羧基、甲氧基等含氧官能團，如蝦青素和葉黃素[3]。類胡蘿卜素的特殊分子結構賦予了其自身多種重要功能，如β-胡蘿卜素分子結構中存在的多個不飽和雙鍵和共軛雙鍵，使其具有抗氧化、提高人體免疫力、抗輻射等生物活性[4-5]；番茄紅素分子結構中含有的11 個共軛雙鍵和2 個非共軛雙鍵的特殊結構賦予了其極強的抗氧化、免疫調節和抗癌能力，對心血管疾病、眼部疾病等也有一定的預防作用[6-7]；葉黃素是構成人眼視網膜黃斑區域的主要色素，對于維持眼部健康、保護視力具有積極作用[8-9]；蝦青素分子多烯鏈兩端存在的羥基（OH）和酮基（C=O）結構，使其具有降血糖、抗氧化、抗炎、抗腫瘤、預防心腦血管疾病和神經保護等功能[10-11]。此外，蝦青素還具有較好的著色功能[12]。類胡蘿卜素的這些重要功能，使其在食品、醫藥、化妝品等行業均具有較為廣泛的應用[13]。但由于人體自身不能合成類胡蘿卜素，必須依靠食物獲得[14]，因此從膳食或膳食補充劑中獲取足量的類胡蘿卜素，對于人體正常生理功能的發揮和身體健康的提升具有重要意義。

圖1 常見類胡蘿卜素的化學結構Fig.1 Chemical structure of common carotenoids

目前類胡蘿卜素的產業化提取通常使用正己烷、丙酮和甲醇等有機溶劑[15]。有機溶劑提取法具有操作簡單、提取率高等優點，廣泛應用于工業化生產類胡蘿卜素產品。但是，由于有機溶劑提取時存在揮發性強、對人體和環境有害等問題，尋求更環保和毒性更低的替代溶劑變得愈發重要。因此，研究人員一直致力于尋求新的可替代綠色溶劑，以獲得更加綠色、安全的類胡蘿卜素提取物。低共熔溶劑（Deep eutectic solvent，DES）是一種新型的綠色溶劑，具有在室溫下蒸汽壓低、綠色環保、制備過程簡單、成本低、可生物降解等優點，且由于其結構的多樣性和廣泛的適用性[16]，近年來受到了研究人員的廣泛關注。在天然產物提取上，DES 目前多應用于多酚類[17]、多糖類[18]和生物堿類[19]等生物活性物質的提取，而對類胡蘿卜素的提取研究尚處于起步階段。由于DES極性和粘度可調，其在類胡蘿卜素的提取方面表現出很大的應用潛力[20]。

本文介紹了DES 的性質和分類，綜述了近年來DES 在類胡蘿卜素提取上的研究進展，總結了類胡蘿卜素的分離及DES 的回收方法，指出了目前DES提取類胡蘿卜素存在的問題，并展望了DES 在類胡蘿卜素提取分離上的應用前景，以期為新型類胡蘿卜素提取溶劑的開發和應用提供借鑒和參考。

1 低共熔溶劑的性質和分類

DES 是一種新型的綠色溶劑，由氫鍵供體（Hydrogen bond donor，HBD）和氫鍵受體（Hydrogen bond acceptor，HBA）通過氫鍵作用形成，二者在一定溫度下以一定摩爾比混合，制備的DES 體系熔點至少低于其中一種組分[16,21]（圖2 中E 點即為DES 熔點）。當使用天然物質作為組分時，所形成的DES 被稱為天然低共熔溶劑（Natural deep eutectic solvent，NADES）[22]。研究表明，DES 具有制備簡單、原料易得、成本低廉、可生物降解等優點。此外，DES 還具有獨特的溶解能力，既可用于親水性化合物也可用于疏水性化合物的提取，且毒性低、粘度可調、極性范圍廣[23-24]。更重要的是，由于組分安全且綠色，DES被判定為無毒[25]。

圖2 具有一個低共熔點的簡單二元系統相圖[16]Fig.2 Phase diagram of a simple binary system with a low eutectic[16]

由于HBA 和HBD 的種類繁多，形成的DES 體系的理化性質也是可調節的，從而可以滿足不同工業應用的廣泛需求。根據對水的親和力，DES 可分為親水性DES 和疏水性DES。由于其固有的氫鍵作用力，大部分DES 通常表現出高度的親水性，組成成分具有較高的極性且可與水混溶；而疏水性DES 由水溶性較差的物質組成，通常具有較低的粘度和極性，并且與水不混溶[26]。DES 的親水性和疏水性對生物活性物質的提取分離效果有很大影響，親水性DES 在提取極性較強的天然產物方面表現出較好的效果，如生物堿[27]、黃酮類[28]、黃嘌呤[29]、兒茶素[30]和精油[31]等，但不適合于含水或者親脂性樣品的提取。疏水性DES 在類胡蘿卜素等疏水性生物活性物質的提取上得到了成功的應用[32-33]。

2 低共熔溶劑在類胡蘿卜素提取上的應用

作為一種新型的綠色溶劑，DES 在類胡蘿卜素的提取上展現出巨大的潛力。目前，DES 在類胡蘿卜素提取上的應用方式主要有以下三種：a.DES 作為溶劑直接提取；b.DES 作為助劑，輔助有機溶劑提取；c.其他方法如超聲波、微波和酶等輔助DES 提取（詳見表1）。由于類胡蘿卜素自身具有較強的親脂性，在其提取上多利用疏水性DES（如薄荷醇基DES 和中鏈飽和脂肪酸基DES），這些DES 在極性更弱的類胡蘿卜素，如β-胡蘿卜素和番茄紅素的提取上表現出不錯的效果。此外，也有一些研究利用極性相對較強的親水性DES 提取類胡蘿卜素（如氯化膽堿基DES 和醇基DES），這些DES 對極性相對較強的類胡蘿卜素，如葉黃素和蝦青素的提取效果更好。

表1 DES 在類胡蘿卜素提取中的應用Table 1 Application of DES in carotenoid extraction

2.1 低共熔溶劑作為溶劑直接提取類胡蘿卜素

DES 作為溶劑直接提取類胡蘿卜素的研究中，提取葉黃素的較多，且DES 的提取效果優于有機溶劑。研究顯示，百里酚-葑醇NADES 對微藻中葉黃素的提取率是傳統有機溶劑正庚烷-乙醇-水的6 倍[34]。此外，碳酸鉀-甘油DES 也可成功地從粗棕櫚油中提取葉黃素[35]。葉黃素是一種具有兩個羥基的類胡蘿卜素，具有一定的極性，故相較于極性低的傳統有機溶劑，極性較強的DES 對其提取效果更好。DES 作為溶劑直接提取β-胡蘿卜素的研究也有報道。親水性較強的氯化膽堿:丙二酸（1:1）DES 對枸杞中總胡蘿卜素的提取率（10 μg/g）是有機溶劑（己烷:乙醇:丙酮:甲苯=10:6:6:7，v/v/v/v）和超臨界CO2萃取的5 倍多[36]。此外，疏水性較強的中鏈飽和脂肪酸基DES（辛酸:癸酸）也可成功地將β-胡蘿卜素從南瓜中提取出來[37]。在結構上，相較于葉黃素，β-胡蘿卜素的羥基數目更少，故其極性弱于葉黃素；但因β-胡蘿卜素結構中存在2 個β-紫羅酮環，賦予其比無環類胡蘿卜素如番茄紅素更強的極性，因此β-胡蘿卜素具有相對中等的極性，使得親水性較強的DES和疏水性較強的DES 均能很好地提取該物質。

DES 作為溶劑直接提取類胡蘿卜素時，提取效果與DES 和目標提取物之間的極性有較大關系。根據相似相溶原理，采用合適極性的DES 提取極性相近的類胡蘿卜素會有更好的效果。

2.2 低共熔溶劑作為助劑輔助有機溶劑提取類胡蘿卜素

當DES 作為助劑使用時，合適的DES 種類及添加量，可以達到改變傳統有機溶劑的粘度和極性的效果，更有利于類胡蘿卜素的提取。DES 作為助劑輔助有機溶劑提取類胡蘿卜素的研究以蝦青素提取為主。氯化膽堿-酒石酸DES 輔助甲醇（80:20，v/v）對蝦廢料中蝦青素的提取率是單獨使用甲醇提取時的1.1 倍（分別為267.00±2.50、239.20±0.63 μg/g）[42]。0.25 mg/mL 的醇基DES（甲基三苯基溴化膦:1,2-丁二醇=1:4）作為助劑，輔助丙酮從三疣梭子蟹中提取蝦青素的提取率是不加DES 組的3 倍多（分別為73、23 μg/g）[43]。蝦青素結構中的-OH 和C=O 賦予了其自身較大的極性，有機試劑中添加合適濃度的DES 可以降低溶劑粘度并增加萃取基質的極性。此外，DES 濃度的增大也增加了其與目標化合物之間的氫鍵相互作用，也會使蝦青素的提取率增加。故添加合適濃度的、極性較高的DES，諸如醇基DES 和氯化膽堿基DES，可以使蝦青素更好地溶解在極性相似的溶劑中，從而獲得較高的提取率[49]。

以上研究表明，溶劑的粘度和極性都會對類胡蘿卜素的提取結果產生很大的影響，添加合適種類和濃度的DES 能夠改善有機溶劑的極性和粘度，從而獲得更高的類胡蘿卜素提取率。

2.3 其他方法輔助低共熔溶劑提取類胡蘿卜素

除了上述兩種應用方式，也有研究利用超聲波、微波或酶輔助DES 提取類胡蘿卜素。通過借助其他方法，可以進一步增強DES 對類胡蘿卜素的提取效果。其中，超聲波輔助DES 提取法的應用多集中于番茄紅素和蝦青素。研究顯示，超聲波輔助法有效提高了DL-薄荷醇-乳酸DES 對番茄皮渣中番茄紅素的提取效果，超聲波輔助后的提取率是未經超聲波輔助的1.6 倍[45]。超聲波輔助氯化膽堿-1,2-丁二醇DES 對蝦殼粉末中蝦青素的提取率分別是室溫攪拌法和加熱輔助法的2.2 倍和1.2 倍（提取率分別為75、34、62 μg/g）[46]。超聲波輔助法可以顯著增強DES對類胡蘿卜素的提取率可能是因為，一方面超聲波和DES 之間存在著協同作用，從而增強了傳質效率，提高了類胡蘿卜素的提取率。另一方面，超聲波儀器發射的高頻脈沖會產生空化氣泡，當這些氣泡在物質表面附近破裂時，會導致細胞破裂以及固體粉碎，從而使得溶劑的傳質阻力降低，提高了傳質效率[50]。此外，微波輔助和酶法輔助DES 提取類胡蘿卜素也得到了不錯的效果，如微波輔助甲醇-氯化膽堿-酒石酸DES 對蝦廢料中蝦青素的提取率是微波輔助甲醇提取的1.1 倍（提取率分別為267.00±2.50、239.20±0.63 μg/g）[42]，酶法輔助DL-薄荷醇-乳酸DES 對向日葵花中葉黃素的提取率是不加酶提取的9.9 倍（分別為14490、1470 μg/g）[48]。

綜上，DES 作為溶劑，與各輔助方法之間具有協同作用，同時輔助手段又通過對植物基質或細胞的破壞作用增強傳質效率，因此能大大增加類胡蘿卜素的提取率。

2.4 低共熔溶劑的分離及類胡蘿卜素的回收

與揮發性有機溶劑相比，DES 的優點之一是蒸汽壓較低，然而這種優勢會導致很難使用蒸發法從中回收生物活性物質。目前在類胡蘿卜素的回收方面，研究多利用脂肪酸基NADES 的極性可調性，將類胡蘿卜素與提取溶劑分離開。如圖3 所示，NH3·H2O的加入可以使NADES 提取物極性發生轉變，從而將類胡蘿卜素沉淀到底部，經簡單過濾即可實現類胡蘿卜素的分離；CO2可以使NADES 和氨溶液之間發生相分離，經離心即可實現NADES 的回收。整個分離回收過程能夠實現溶劑極性的快速轉換，且不需要復雜的試驗操作，對試驗環境和設備也沒有很高的要求，可以用于類胡蘿卜素的回收[37,40,51]。此外，雖然目前離心仍然是實驗室最常用的分離方法，但Shahbodaghi 等[52]發現，不采取離心操作，利用鹽析效應用含鹽固相萃取柱也能夠更簡單地從分散液中快速分離DES，程序如圖4 所示。一旦混濁的混合溶劑流經含鹽固相萃取柱，樣品溶液與鹽之間的離子交換作用增加，從而也會使疏水性DES 發生相分離。

圖3 類胡蘿卜素與DES 的分離程序[40]（a）及DES 與氨溶液的[53]分離程序（b）Fig.3 Separation of carotenoids from DES[40] (a) and separation of DES from NH3·H2O[53] (b)

圖4 基于低共熔溶劑固化和鹽析效應的無離心氣助液相微萃取[52]Fig.4 Centrifuge-free air-assisted liquid phase microextraction based on the solidification of deep eutectic solvent and salting-out effect[52]

3 總結與展望

DES 作為一種綠色溶劑，在類胡蘿卜素提取方面已經得到了成功的應用，現有研究發現其提取效果普遍優于傳統有機溶劑。目前，DES 在類胡蘿卜素的提取上主要有三種應用方式：a.DES 作為溶劑直接提取；b.DES 作為助劑輔助有機溶劑提取；c.其他方法輔助DES 提取。當DES 作為溶劑直接提取類胡蘿卜素時，HBA 和HBD 種類的選擇很大程度上決定著提取效果。合適粘度的DES 可以增加傳質效率，合適極性和溶劑化能力的DES 能夠更多地溶解目標化合物，獲得更好的提取效果。當DES 作為助劑輔助有機溶劑提取類胡蘿卜素時，選擇合適的DES 種類及添加量，更有利于類胡蘿卜素的提取。此外，借助其他方法，如超聲波輔助DES 提取類胡蘿卜素，能夠進一步增加類胡蘿卜素的提取率。總的來說，DES 由于其自身特有的性質，不論以何種方式應用于類胡蘿卜素的提取，均表現出了比傳統有機溶劑更好的提取效果。在實際操作中，充分考慮溶劑與目標化合物之間的極性關系，會得到更高的提取率。

雖然DES 在類胡蘿卜素的提取上已表現出了較大的優勢，但是仍然存在一些問題，有待今后進一步的研究。a.繼續開發探究其他更多類型的DES，目前用于類胡蘿卜素提取的DES 種類較少，HBA 主要集中于中鏈飽和脂肪酸、氯化膽堿和萜烯類物質，HBD 主要為單羧酸。b.進一步考察不同類型DES對同一種類胡蘿卜素提取效果的影響，以及同種DES 對不同類胡蘿卜素提取效果的影響。獨特的極性和可調節的粘度作為DES 的優勢，也是影響類胡蘿卜素提取效果的關鍵因素，系統探究DES 自身物理性質與類胡蘿卜素提取率之間的關系，能夠為今后更精準地開發用于類胡蘿卜素提取的其他類型DES 提供基礎與支持。c.尋找更多DES 與類胡蘿卜素高效分離的方法，提取物與溶劑的分離是后續研究目標物質性質和應用的前提，然而目前的研究尚停留在對DES 提取類胡蘿卜素工藝的優化方面，對于DES 與類胡蘿卜素分離的方法報道較少，且現有的分離方法多基于中鏈飽和脂肪酸基DES，該方法是否同樣適用于其他類型DES 則有待進一步考察。d.進一步考察用于類胡蘿卜素提取的DES 的循環利用性能，真正實現提取溶劑的高效利用。e.鑒于DES 的可設計性，未來研究中可以增加DES 的組分構建三元DES。三元DES 可以在二元DES 提取效果的基礎上，進一步實現對于特定類胡蘿卜素的更高效提取，或者實現對于不同極性類胡蘿卜素的同時高效提取，以達到更優良的提取效果。總體來說，DES 對類胡蘿卜素提取的研究仍處于初步階段，今后還需開展更加系統全面的探究。