通過外源添加芽孢桿菌提升北方地區高溫大曲的品質

何猛超，鄔子璇，西玉玲，張德中，陳玉蓮，李 坤，井會涵，王鴻博，劉海坡，陳杉彬，韓興林,

（1.中國食品發酵工業研究院有限公司，北京 100015；2.國家酒類品質與安全國際聯合研究中心，北京 100015；3.山東秦池酒業（集團）有限公司，山東濰坊 262600；4.中國酒業協會，北京 100831）

中國白酒是最古老的蒸餾酒之一，同時也是中國五千年歷史流傳下來的寶貴財富，在中國傳統文化中扮演著十分重要的角色，深受廣大消費者喜愛[1-2]。貴州高原地區長期的高溫、高濕環境為醬香型白酒提供了天然的釀造環境，通過長期不間斷的釀造醬香型白酒這里逐漸孕育了多種耐熱、耐濕的功能微生物。以茅臺酒為代表的醬香型白酒工藝主要包括：高溫大曲的制備、高溫堆積發酵、高溫固態蒸餾、陶壇長期貯存等，其中高溫大曲的質量是決定產品品質的關鍵因素之一[3-4]。隨著近些年來中國白酒所呈現的“醬酒熱”勢頭高居不下，許多茅臺地區之外的酒廠也開始釀造醬香型白酒，以山東為代表的北方地區酒廠也在不斷提升自身醬香型白酒品質與質量，從高溫大曲的制作、酒醅的堆積工藝、酒體貯存與勾調方面不同程度在改進。

目前，行業對北方地區和南方地區所產的高溫大曲群落結構研究比較多，也解析出南北方高溫大曲在微生物方面的差異同時提出相關改變策略。候強川等[5]通過從細菌群落結構、功能以及細菌表型等多個維度來對比茅臺和湖北堯治河高溫大曲之間的差異性，兩種曲共有的細菌主要有芽孢桿菌屬、嗜熱放線菌屬、克羅彭斯特菌屬等，但這些菌屬的相對含量在兩種曲里面存在很大差異。何猛超等[6]通過對比茅臺地區與湖南地區高溫大曲的細菌群落結構發現，在Alpha 多樣性指數中，茅臺地區高溫大曲的細菌群落豐富度較高，而湖南地區高溫大曲細菌群落多樣性較高，兩個地區細菌在屬水平差異較大；梁慧珍等[7]通過在高溫大曲中篩選高產吡嗪類物質芽孢桿菌，并對大曲進行功能微生物的強化有效提高了高溫大曲吡嗪類物質種類；王曉丹等[8]在高溫大曲中篩選地衣芽孢桿菌并添加到窖池中層酒醅中，與對照曲比較，通過5%的菌株添加量，四甲基吡嗪提高了3.30倍，有效提高了粹沙酒的醬香風格。目前行業內對不同地區的高溫大曲研究較多的是分析其微生物群落結構并篩選其功能微生物，以及將功能微生物在酒醅堆積過程中進行應用，但運用不同芽孢桿菌在北方地區高溫大曲制作過程中進行添加并探究其魯棒性，最終得到適應性較優的菌株在北方地區進行規模化運用來提升高溫大曲質量的研究較為少見。

氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）是一種近年來新興的可用于檢測復雜基質樣品中揮發性和半揮發性有機物的技術[9-10]，其優勢在于結合了氣相的強分離能力和離子遷移譜的高靈敏度，可在短時間內完成痕量風味物質的分離和響應[11-12]。該方法不要求真空檢測環境、檢出限低、樣品無需前處理，在食品鑒偽及生產加工過程中的質量監控中的應用日益成熟[13-14]。ZHANG 等[15]通過GC-IMS 檢測了新鮮大曲和成熟大曲中揮發性有機化合物組成，結果表明熟化前后高溫大曲中揮發性有機化合物存在顯著差異。HE 等[16]采用GC-IMS 揭示了黑曲霉侵染水稻中揮發性有機化合物的動態變化及其代謝途徑，并建立了基于VOC分析的真菌侵染程度預測模型。以上研究證明利用GC-IMS 用于高溫大曲中標志性代謝物分析和判別的可行性。

本論文主要是通過將貝萊斯芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌兩種芽孢桿菌在高溫大曲中進行添加強化，并研究不同芽孢桿菌對大曲發酵能力和風味的影響。旨在提高北方地區高溫大曲的質量進而提升醬香型白酒的品質，同時也為除茅臺地區以外的醬香產區的高溫大曲制作提供建議。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實驗選用的菌株（貝萊斯芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌）均由中國食品發酵研究院有限公司提供；高溫大曲 均來自山東秦池酒業有限公司，采取九點取樣法收集出倉大曲，粉碎過40 目篩后-20 ℃冰箱保存待測；大曲微生物DNA 試劑盒 Fast DNA?Spin Kit for Soil；無水乙醇、濃硫酸、氫氧化鈉、酚酞、丙酮、2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮、2-壬酮等 分析純，天津市福晨化學試劑廠；乙酸乙酯、己酸乙酯等標準品 色譜純，美國Sigma-Aldrich公司；TAE 緩沖液 北京索萊寶科技有限公司；引物上海生物工程股份有限公司；DNA Marker Takara；瓊脂糖 南京生興生物技術有限公司；核酸染料Gengreen 上海賽百盛有限公司；土壤DNA 提取試劑盒（E.Z.N.A.Soil DNA Kit）Omega Bio-Tek公司；所用的細菌培養基為牛肉膏蛋白胨培養基，霉菌培養基為馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養基。

CP1502 電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司；HH-S6A 電熱恒溫水浴鍋 北京利偉永興儀器有限公司；PX2 型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 上海賽默生物科技有限公司；DYY5 穩壓電泳儀 北京六一儀器廠；GeI Image System Tanon 1600 凝膠成像儀 上海天能科技有限公司；Illumina MiSeq 高通量測序平臺 美國Illumina 公司；FlavourSpec?1H1-00053 型氣相離子遷移譜：配有LAV、Reporter、Gallery Plot 插件以及內置的GC×IMS Library Search NIST 數據庫和IMS數據庫 德國G.A.S.公司；CTC-PAL 自動進樣裝置瑞士CTC Analytics AG 公司；WAX 毛細管柱（30 m×0.53 mm，1 μm）美國RESTEK 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 芽孢桿菌在強化大曲中的添加方法 將提供的兩株高產吡嗪芽孢桿菌（貝萊斯芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌）用牛肉膏蛋白胨液體培養基活化并在37 ℃、180 r/min 培養1 d 至108CFU/mL。每種芽孢桿菌的添加量為10 L 種子液添加到10 t 生曲中，添加時間為在高溫大曲拌料時和水進行混合后加入，每種芽孢桿菌各做5 房作為實驗曲，以不添加菌株作為空白對照曲，每個曲房的長×寬×高規格為9.5 m×3.8 m×4.5 m，地面面積約為36 m2，待出倉后采用五點取樣法即房子的四點取一塊，中心點取一塊進行取樣分析。將添加貝萊斯芽孢桿菌的高溫大曲簡稱強化1 號曲，將添加解淀粉芽孢桿菌的高溫大曲簡稱為強化2 號曲，不添加芽孢桿菌的簡稱為對照曲。

1.2.2 高溫大曲中芽孢桿菌、霉菌計數 芽孢桿菌計數方法：準確稱取10 g 樣品，加入裝有90 mL 無菌生理鹽水（0.9% NaCl 溶液）的三角瓶中，振蕩均勻，在80 ℃水浴鍋下放置15 min，充分去除掉其他菌的干擾，再取1 mL 加入無菌水9 mL，以此類推，根據實際情況逐級稀釋，一般稀釋至10-4～10-6。

霉菌計數方法：準確稱取10 g 樣品，置入裝有90 mL 無菌生理鹽水（0.9% NaCl 溶液）的三角瓶中，振蕩均勻，在30 ℃條件下放置30 min，再取1 mL加入無菌水9 mL，以此類推，根據實際情況逐級稀釋，一般稀釋至10-4～10-6。

分別取100 μL 稀釋液在牛肉膏蛋白胨培養基和馬鈴薯葡萄糖培養基上進行涂布，芽孢桿菌在37 ℃恒溫恒濕培養箱培養16～24 h，霉菌在35 ℃恒溫恒濕培養箱培養24～36 h 進行菌落數的計算[17]。

1.2.3 大曲理化指標檢測 不同類型高溫大曲的理化指標（水分、糖化力、液化力、酯化力、發酵力、酸度等）依據QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》測定[18]。

1.2.4 大曲微生物群落組成檢測

1.2.4.1 總DNA 的提取 稱取不同類型高溫大曲5.0 g 用液氮速凍后迅速研磨。大曲總DNA 提取方法按照土壤DNA 提取試劑盒操作說明書[18-19]。為了保證所提取的基因組的濃度及純度對其進行PCR擴增及產物純化，對細菌16S rRNA 基因的V3-V4 高變區進行擴增，所用引物為338F/806R（5-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3/5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3），擴增體系為：DNA 模板 10 ng，10xPCR緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs mix 2 μL，5 U/μL DNA聚合酶0.4 μL，5 μmol/L 正向和反向引物各0.8 μL，體系用ddHO 補充至20 μL。擴增條件為95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環，72 ℃ 10 min。對真菌的內部轉錄間隔區（ITS1）進行擴增，所用引物為ITS5F/ITS1R

（5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3/5-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3），擴增體系為：DNA 模板10 ng，10xPCR 緩沖液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs mix 2 μL，5 U/μL DNA 聚合酶0.4 μL，5 μmol/L 正向和反向引物各0.8 μL，體系用ddHO 補充至20 μL。擴增條件為95 ℃預變性6 min，接著進入循環: 94 ℃變性45 s、52 ℃退火45 s、72 ℃延伸120 s，共循環35 次，72 ℃終延伸10 min。擴增后用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.4.2 高通量測序 將檢測合格樣品送往蘇州帕諾米克生物醫藥科技有限公司，通過高通量測序（Illumina Miseq PE250）平臺進行高通量測序。

1.2.5 大曲揮發性有機物的檢測

1.2.5.1 氣相色譜-離子遷移譜分析條件 大曲粉末混勻后稱取1 g 于20 mL 頂空進樣瓶中，封蓋備用，每個樣品設置2 次平行。

進樣條件：頂空進樣體積500 μL；孵育時間10 min；孵育溫度50 ℃；孵育轉速500 r/min；高純度氮氣（≥99.999%）為載氣；進樣針溫度85 ℃；清洗時間0.5 min。

GC 分析條件：WAX 30 m ID: 0.53 mm 石英毛細管柱，柱溫60 ℃；載氣：高純度氮氣（≥99.999%）；載氣流速程序：初始2.0 mL/min，保持2 min，10 min 內線性增至10 mL/min，20 min 內線性增至100 mL/min，運行時間30 min。

IMS 分析條件：漂移管長度98 mm；管內線性電壓500 V/cm；漂移管溫度45 ℃；漂移氣為高純度氮氣（≥99.999%）；漂移氣流速150 mL/min；放射源為β射線（氚，3H）；模式：正離子。

物質定性分析方法：GC-IMS 檢測結果為三維信號吸收峰圖譜，采用儀器配套的Vocal 軟件結合其配置的NIST 氣相保留指數數據庫和G.A.S 自建IMS遷移時間數據庫對二維譜圖中物質進行定性分析。

1.3 數據處理

采用Reporter、Gallery Plot 插件生成二維、三維峰譜圖和有機物指紋圖譜并進行樣品間的差異對比；采用The Unscrambler X 10.3 進行PCA 分析并制圖；采用SIMCA 14.1 進行正交偏最小二乘回歸分析。

2 結果與分析

2.1 強化大曲理化指標分析

醬香型高溫大曲的理化指標中的水分、酸度、液化力和糖化力反映醬香型大曲是否成熟；發酵力和酯化力是醬香型大曲的生化性能，反映了醬香型高溫大曲品質。

從表1 中數據結果可以看出，試驗組與對照曲的理化指標存在差異。其中，大曲的水分是衡量大曲質量的關鍵指標之一，三種高溫大曲的水分均在11%左右，總體上符合低于13%的醬香型高溫大曲的標準。

表1 不同高溫大曲理化指標分析Table 1 Analysis of physical and chemical indexes of Daqu at different high temperature

液化力和糖化力的高低與大曲中微生物的生長繁殖有一定的關聯性，尤其是霉菌。測得的三種大曲的糖化力和液化力中，強化1 號曲和強化2 號曲與對照曲存在顯著性差異（P＜0.05），可能原因是通過添加一定量的芽孢桿菌，促進了霉菌的數量，進而提高了大曲的糖化力和液化力。

酯化力、發酵力作為高溫大曲生化功能的動態指標，目前還沒有標準對高溫大曲的兩個指標作出明確規定。三種大曲的酯化力和發酵力中，強化2 號曲與強化1 號曲、對照曲存在顯著性差異（P＜0.05），可見芽孢桿菌的添加對于大曲酯化力和發酵力也有一定的影響，尤其是對強化2 號曲影響較大，因為醬香型高溫大曲的發酵力、酯化力與微生物的種類、數量和代謝產物密切相關，特別是產酯酵母、酒精酵母，強化2 號曲中可能酵母菌屬的占比稍高而使酯化力、發酵力高于強化1 號曲及對照曲。

大曲的酸度也是衡量大曲質量的重要指標。三種大曲中對照曲的酸度最高為1.39 mmol/10 g，其次是添加強化2 號曲的酸度為1.33 mmol/10 g，添加強化1 號曲的酸度最低為1.21 mmol/10 g，通過添加一定量的芽孢桿菌有效地提高了高溫大曲的酶活，并通過提高原料的利用率進而降低了大曲的酸度。

2.2 強化大曲微生物指標分析

2.2.1 不同高溫大曲微生物菌落計數結果 從表2可以看出，通過添加一定比例的不同芽孢桿菌，三種高溫大曲中強化1 號曲、強化2 號曲與對照曲的芽孢桿菌數、霉菌數之間存在顯著性差異（P＜0.05）。從實驗結果可以看出通過外源添加一定量的芽孢桿菌數，能夠有效增加北方地區酒廠的高溫大曲的芽孢桿菌數，在芽孢桿菌的數量級上能初步達到茅臺地區的水平。其次，通過外源添加芽孢桿菌后，能夠影響其他微生物的群落結構，本實驗以霉菌的變化作為參考，因為在高溫大曲制作過程中由于制作溫度較高，大多數酵母不耐受高溫都會死掉，只有耐高溫的細菌尤其是芽孢桿菌，還有就是霉菌能夠存活下來，所以以霉菌作為參考。可以看出，強化1 號曲的霉菌數最高，能達到1.3×108CFU/g 左右，其次是強化2 號曲霉菌數，能達到1.1×108CFU/g 左右，而對照曲的霉菌數最低為1.0×107CFU/g 左右。

表2 不同高溫大曲微生物菌落計數Table 2 Analysis of microbial colony number of Daqu at different high temperature

2.2.2 高溫大曲微生物群落結構分析

2.2.2.1 高溫大曲細菌落結構分析 三種高溫大曲中的細菌種類及相對豐度在屬水平上的分析結果見圖1。

不同高溫大曲的細菌種類、群落豐度等方面是不同的。通過添加不同菌種的高溫大曲與對照高溫大曲在細菌屬水平上（＞1%）見表3。

表3 不同高溫大曲屬水平主要細菌（%）Table 3 Main bacteria at different levels of high temperature Daqu (%)

三種高溫大曲的細菌在屬水平上的豐度和群落結構是各不相同的。從圖1 和表3 可以看出三種高溫大曲的優勢細菌屬（＞1%）的主要微生物有糖多孢菌屬、枝芽孢桿菌屬、克羅彭斯特菌屬、芽孢桿菌屬、高溫放線菌屬、假諾卡氏菌屬、威斯氏菌屬、乳桿菌屬、海洋桿菌屬、葡萄球菌屬等，這也是醬香型高溫大曲常見的細菌群落結構。其中強化1 號曲中的芽孢桿菌屬占比為18.92%，強化2 號曲中的芽孢桿菌屬占比為21.68%，而對照曲中的芽孢桿菌屬占比僅僅為7.48%從三種高溫大曲的微生物群落結構芽孢桿菌屬豐度占比可以看出，強化1 號曲、強化2 號曲中的芽孢桿菌的占比明顯高于對照曲，該結果與芽孢桿菌數的計數結果相一致，可見通過添加一定比例的芽孢桿菌能夠增加北方地區酒廠自制高溫大曲的芽孢桿菌屬的數量及豐度占比。

2.2.2.2 高溫大曲真菌落結構分析 三種高溫大曲中的真菌種類及相對豐度在屬水平上的分析結果見圖2。

圖2 不同高溫大曲在屬水平上的真菌群落結構Fig.2 Fungus structure of different high temperature Daqu at the genus level

不同高溫大曲的真菌種類、群落豐度等方面是不同的。通過添加不同菌種的高溫大曲與對照高溫大曲在真菌屬水平上（＞1%）見表4。

表4 不同高溫大曲屬水平主要真菌（%）Table 4 Main fungus at different levels of high temperature Daqu (%)

通過外源添加一定量的芽孢桿菌后，不僅對高溫大曲的細菌群落結構有擾動現象，且同時影響了真菌的群落結構。從圖2 和表4 可以看出，三種高溫大曲的優勢真菌屬（＞1%）的微生物主要為熱子囊菌屬、嗜熱真菌屬、曲霉屬。其中強化1 號曲的優勢真菌屬為熱子囊菌屬，豐度占比為50.88%，而強化2 號曲和對照曲的優勢真菌屬為嗜熱真菌屬，豐度占比分別為55.90%、56.63%。通過在高溫大曲制作過程中添加芽孢桿菌后，真菌群落結構也發生變化，且添加不同種類的芽孢桿菌對真菌的群落結構是不同的，強化2 號曲中的嗜熱真菌屬水平上與對照曲的占比相似，但強化1 號曲中的嗜熱真菌屬占比降低，曲霉增加，從這里可以看出添加解淀粉芽孢桿菌后對高溫大曲的真菌群落中優勢真菌屬的豐度擾動較小。

從表2、表3、表4 結果可以看出，在添加貝萊斯芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌后對原有高溫大曲的微生物群落結構發生改變且芽孢桿菌屬的數量及豐度占比也得到了明顯增加，其他細菌、真菌在群落豐富度上發生了微小的變動。此外，通過芽孢桿菌計數、高通量數據可以看出，強化2 號曲中的芽孢桿菌數和豐度明顯比強化1 號曲的高，所以可以初步判斷通過添加一定量的解淀粉芽孢桿菌后更適合在北方地區的高溫大曲中適應性馴化繁殖。

2.3 強化大曲揮發性風味物質分析

2.3.1 添加不同菌大曲GC-IMS 譜圖分析 圖3 和圖4 分別為運用儀器配置的Reporter 插件分析獲得的不同大曲GC-IMS 三維譜圖和二維譜圖，圖中的橫坐標代表離子遷移時間，縱坐標代表氣相保留時間，垂直方向高度代表對應揮發性物質的離子吸收峰強度。從圖3 可直觀看出大曲揮發性組分在保留時間400～1800 s 范圍內存在明顯差異，由于三維圖譜分析不便，因此取俯視圖（圖4）進行差異對比。以紅色豎線為反應離子峰（RIP 峰），RIP 峰右側的每個點代表1 種揮發性有機物，信號峰越趨近于白色表示濃度越小，紅色表示濃度較大，顏色越深表示濃度越大。圖4 中最左側對照曲對應二維圖中的信號峰數量較少，且顏色較淺，而右側兩種強化曲中的信號峰數量和總體強度相比于對照曲均有顯著增加，證明添加功能菌后的高溫大曲中揮發性代謝物更加豐富。

圖3 不同高溫大曲的GC-IMS 三維譜圖Fig.3 Three dimensional spectrum of GC-IMS of different high temperature Daqu

圖4 不同高溫大曲中揮發性物質的GC-IMS 譜圖Fig.4 GC-IMS patterns of volatile compounds in different high temperature Daqu

2.3.2 揮發性有機物定性分析 表5 為利用GC-IMS分析大曲中揮發性有機物的定性結果，根據分析軟件中自帶的NIST 數據庫和德國G.A.S 公司建立的IMS 遷移時間數據庫，對譜圖中的有機物信號峰進行準確的二維定性分析。表中化合物名稱后綴的M、D 和P 分別代表有機物單體、二聚體和三聚體。從不同大曲樣品中共鑒定出共73 個信號吸收峰，56 種揮發性有機物，主要包括醇類、酮類、醛類、酯類、吡嗪類及其他類別。其中吡嗪類物質7 種，醇類13 種，酮類12 種，醛類8 種，酯類9 種和其他類7 種。其中吡嗪類物質作為醬香型白酒的關鍵香味物質同時也是白酒中的健康因子，為酒體提供了馥郁的烘焙和堅果香氣[20-21]。丙醛等醛類物質的氣味閾值較低，可為發酵食品提供特殊風味[22]。同時檢出的酯類物質作為白酒中重要的風味組分，有助于形成酒體中柔美的花果香氣[23]。為了觀察不同種大曲中風味組分的差異，利用Vocal 軟件中的Gallery Plot 插件生成指紋圖譜，對各樣品圖譜中同個位置的信號峰進行對比。

表5 GC-IMS 分析高溫大曲中的揮發性有機物Table 5 Analysis of volatile components in high temperature Daqu by GC-IMS

2.3.3 揮發性有機物指紋圖譜 圖5 從上至下為對照曲、強化1 號曲和強化2 號曲的揮發性有機物指紋圖譜，每一行顯示二維圖譜中的94 個信號吸收峰，每個樣品平行2 次，每一列表示同一物質在不同樣品中的信號峰。從圖5 中可以看出不同大曲之間的揮發性風味成分含量和組成均存在顯著差異。紅色A 框內選中的是強化2 號曲中的特征性代謝物，包括2-甲基吡嗪、2-乙基-3-甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、乙酸己酯、環戊酮、環己酮、仲辛醇、異丙醇等。B 區域中的正戊醛、正己醛、苯甲醛、糠醛、2,3-戊二酮、羥丙酮、正己醇、1-戊醇、丁酸己酯、乙酸丁酯等化合物在強化1 號曲中的含量顯著高于2 號曲和對照曲。C 區域框選了在對照曲中信號最強的物質，包括2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪和丙醛二聚體。綠色框選中的D 區域為同時在兩種強化曲中含量顯著較高的信號區域，包括2-乙酰基吡嗪、仲辛酮、叔丁醇、硫丙烯和異戊烯醛。

圖5 不同高溫大曲中揮發性有機物指紋圖譜Fig.5 Gallery plot fingerprint of volatile compounds in different high temperature Daqu

大曲自身含有的揮發性有機物是多種微生物代謝反應的結果，在很大程度上受到復雜微生物群落的影響。由圖5 可知，強化2 號曲的特征性代謝物與對照曲和1 號曲相比含有更加豐富的吡嗪類物質，表明向相同基質大曲中外源添加一定量的芽孢桿菌后，解淀粉芽孢桿菌在北方地區環境下表現出更強的產吡嗪能力。根據GC-IMS 指紋圖譜分析結果，添加解淀粉芽孢桿菌的強化2 號曲在北方條件下培養成熟后呈現出更豐富的風味輪廓，其中投產前大曲自身含有的多種吡嗪是白酒中重要的呈味組分同時也是近年來備受關注的健康因子。

2.3.4 主成分分析與偏最小二乘回歸分析 圖6a 為根據指紋圖譜中定性出物質的特征信號區域的吸收峰體積進行主成分分析得分圖，結果顯示不同曲樣本組間分離明顯，前兩個主成分的總分離貢獻率達到99%，其中PC1 和PC2 的值分別為72%和27%，基于GC-IMS 得到的代謝物信號吸收峰可以對不同強化大曲進行有效聚類。

圖6 三種高溫大曲的主成分分析和正交偏最小二乘結果Fig.6 Principal component analysis and OPLS-DA of three different high temperature Daqu

正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）結合了正交信號[24]和PLS-DA 來篩選差異變量，是一種有監督的判別分析統計方法。圖6b 為OPLS-DA 的Biplot圖，結合了得分和載荷信息，位于觀測值附近的變量在對應樣品中含量較高。從圖中可知14（2,5-二甲基吡嗪）、15（2,6-二甲基吡嗪）和68（丙醛）對于區分對照曲有較大貢獻；4（乙酸-D）、16（3-羥基-2-丁酮）、19（羥丙酮）、40（異丁醇-D）、47（硫代呋喃）和48（仲丁醇-D）是強化1 號曲中的特征性代謝物；8（仲辛醇）、9（2-乙基-6-甲基吡嗪）、11（（E）-3-己烯-1-醇）、13（2,3-二甲基吡嗪）、17（3-羥基-2-丁酮）、22（乙酸己酯）和29（環戊酮）是分離強化2 號曲的關鍵揮發性有機物。Biplot 圖所得結果與指紋圖譜基本保持一致。

變量重要性投影值（variable importance in project，VIP）可以反映各組分對模型分類的貢獻程度[25]，將VIP＞1 作為篩選標準，各化合物的VIP 值結果見圖6c。篩選出13 種VIP 值大于1 的對分類貢獻度較大的代謝物，按照VIP 值由高到低排序包括環己酮、2-乙酰基吡嗪、乙酸、硫丙烯、異丁醇、異戊醇、環戊酮、仲辛酮、3-辛酮、乙醇、丙醛、正丁醛和3-羥基-2-丁酮，其中環己酮、環戊酮、仲辛酮、硫丙烯和2-乙酰基吡嗪均在強化2 號曲中含量較高。此外本研究還進行了OPLS-DA 模型驗證（置換檢驗n=200），如圖6d 所示。R2=0.561、Q2=-1.23，右側的R2和Q2均高于左側，且Q2與y 軸交于負半軸，說明該模型可靠不存在過擬合現象。

3 結論

通過本研究可以看出在制作高溫大曲時添加芽孢桿菌是提升北方醬酒產區高溫大曲質量一種有效策略。本試驗主要是添加一定比例的貝萊斯芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌兩種來自茅臺地區高溫大曲的優勢芽孢桿菌后，分析結果表明在高溫大曲中微生物系統魯棒性的情況存在下，從整體上看強化1 號曲、強化2 號曲在各項指標（理化指標、微生物指標、揮發性有機物）都明顯優于對照曲，其次是添加解淀粉芽孢桿菌的強化2 號曲在理化指標、芽孢桿菌數及豐度占比、風味物質組成的方面都明顯優于添加貝萊斯芽孢桿菌的強化1 號曲及對照曲；利用GCIMS 對添加不同芽孢桿菌大曲粉末進行分析檢測，共鑒定出56 種揮發性有機物，其中包含7 種吡嗪類物質并根據指紋圖譜判斷強化2 號曲中吡嗪類物質種類和含量顯著高于強化1 號曲和對照曲，同時也可以看出解淀粉芽孢桿菌更加適合在除茅臺地區之外的北方醬香白酒產區繁殖生長，這對于提升北方地區自制高溫大曲的質量及白酒品質的提升具有一定的參考價值。