一株副溶血弧菌噬菌體生物學特性、全基因組特征及其在食品中的應用

張俊鵬，劉文婷，石 甜，王華娟，王宏勛，周 敏,

（1.武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北武漢 430000；2.武漢輕工大學生命科學與技術學院，湖北武漢 430000）

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）是一種常見于河口和海洋環境的革蘭氏陰性嗜鹽細菌。食用未加工成熟的海產品是人類感染副溶血性弧菌的主要原因[1]。近年來海鮮類食品在市場廣泛流通，導致該菌由沿海向內陸傳播蔓延，甚至超過沙門氏菌和志賀氏菌，成為腹瀉的首要病原菌[2]。在過去的幾十年里，由于抗生素的過度使用，副溶血性弧菌中出現了抗生素耐藥性[3]。因此，迫切需要既安全又對消費者友好的新的控制方法。

噬菌體是細菌病毒，在自然界中廣泛存在，目前噬菌體在副溶血弧菌控制方面已有多篇報道。袁琳等[4]研究了噬菌體SHOU24 對即食對蝦中副溶血性弧菌的抑制效果，結果表明，經噬菌體處理的副溶血性弧菌的生長延滯期增長了4.04 h，噬菌體在常溫條件下能使即食蝦中副溶血性弧菌的濃度下降1 個數量級，噬菌體SHOU24 可顯著降低即食對蝦中的副溶血性弧菌數量。鄭小雙等[5]評價了副溶血性弧菌噬菌體VppMIX 的抑菌效果，結果顯示在25 ℃恒溫保藏12 h 后，不同劑量噬菌體VppMIX 處理的黃魚樣品中副溶血性弧菌數量比對照組降低了1.41～4.98 lgCFU/g。可見噬菌體十分適合用于海產品等易腐敗食品中主要病原菌的控制。

目前，已報道的副溶血性弧菌裂解性噬菌體數量有限，為了豐富該致病菌的噬菌體庫，本研究以10 株實驗室保存的副溶血弧菌為宿主菌，從湖北省武漢不同地點采集的樣品中分離烈性噬菌體，分析其形態、裂解譜、一步生長曲線、pH 及溫度穩定性等生物學特征，進行基因組比較，并以人工污染的基圍蝦作為模型，研究噬菌體在貯藏溫度下對模擬污染蝦肉的抑菌效果，為開發噬菌體抑制劑提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

23 株副溶血弧菌分離株 武漢輕工大學微生物實驗室，其中ATCC17802 為食品源標準菌株，F6、F7、F22、F23 來源于食品，Vp27、Vp33、Vp41、Vp44、460、461、469、470、474、475、485、486、O56、O514 來源于病人，H128、H256、H512 為抗生素誘導株。選取其中10 株細菌用于分離副溶血弧菌噬菌體；蝦肉樣品 武漢常青花園武商量販、常青花園菜市場、盒馬鮮生（武漢太和里店）；TCBS 瓊脂 青島海博生物技術有限公司；Agar 瓊脂粉 飛揚生物有限公司；酵母提取素、胰蛋白胨 北京瑞達恒輝公司；氯化鈉、無水乙醇 上海國藥集團化學試劑有限公司；96 孔微量培養板 美國康寧公司；0.22 μL 針頭過濾器 天津津騰公司；一次性注射器 金塔有限公司；DNaseⅠ、RNase A、蛋白酶K Takara 公司。

DRP-9062 型電熱恒溫培養箱 上海森信實驗儀器有限公司；SW-CJ-2FD 型雙人單面凈化工作臺蘇州凈化設備有限公司；DHG-9053A 電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；PHS-25 pH 計、CP214 型電子天平 奧豪斯儀器公司；S4OPL201 超純水機 上海樂楓科技有限公司；Mini 15K 離心機杭州奧盛儀器有限公司；DB150L 高壓滅菌鍋 北京亞歐德鵬科技有限公司；CMBR 全自動生長曲線分析系統 芬蘭Bio screen。

1.2 實驗方法

1.2.1 噬菌體的分離與純化 取蝦肉樣品25 g 加入225 mL 生理鹽水，均質2 min，混合液以5000 r/min離心10 min，取5 mL 上清液加入5 mL LB 液體培養基中，同時分別加入100 μL 處于對數生長期的10 株副溶血弧菌，37 ℃振蕩培養8 h 后5000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm 濾膜，濾液經10 倍梯度稀釋后與宿主菌混合，使用雙層平板法[6]，37 ℃培養6～8 h 檢測噬菌斑。挑取單個空斑至1 mL SM 緩沖液中，4 ℃過夜，用SM 緩沖液稀釋噬菌體液，取適宜梯度加入宿主菌制成雙層平板，37 ℃培養6～8 h，重復培養5 次，得到純化噬菌體。

1.2.2 噬菌體效價測定 純化的噬菌體液進行10 倍稀釋，將10-5、10-6及10-7的噬菌體液100 μL 分別與100 μL 對數期的宿主菌混合，利用雙層平板法[6]觀察噬菌斑的個數。

噬菌體效價（PFU/mL）=噬菌斑數量×稀釋倍數×10

1.2.3 噬菌體透射電鏡觀察 參考Ramírez-Orozco等[7]方法，采用磷鎢酸負染法進行透射電鏡觀察噬菌體形態，并利用軟件Digital Micrograph Demo 3.9.1測量噬菌體頭部直徑和尾長。

1.2.4 噬菌體宿主譜測定 使用點斑法測定噬菌體的宿主譜[8]，取3.7 mL LB 半固體培養基加入0.1 mL宿主菌（109CFU/mL），顛倒混勻后傾倒在固體培養基上，待凝固后，滴加噬菌體懸液（109PFU/mL）10 μL，置37 ℃培養箱中培養8～12 h，觀察裂解圈的形成。

1.2.5 噬菌體的最佳感染復數（multiplicity of infection，MOI）按照不同的MOI 值（0.001、0.01、0.1、1、10、100、1000）將噬菌體與宿主菌混合，對不同MOI 值的噬菌體效價進行測定[6]，效價最高的MOI值則為噬菌體的最佳感染復數。

1.2.6 噬菌體的一步生長曲線 將噬菌體原液與宿主菌以最佳感染復數混合，在37 ℃水浴鍋中溫浴10 min，使噬菌體盡可能多地吸附到宿主菌上。將混合液4 ℃、8000 r/min 離心2 min，棄上清液使用等體積LB 培養基（3% NaCl）重懸，重懸2 次，取1 mL重懸液加入到9 mL LB 培養基（3% NaCl）。從0 min開始，每隔10 min 取500 μL 于4 ℃、8500 r/min 離心2 min，測定噬菌體效價[6]。

1.2.7 噬菌體的熱穩定性 提前準備不同溫度（30、40、50、60、70 ℃）的水浴鍋，將噬菌體原液稀釋到107PFU/mL，取1 mL 噬菌體原液于1.5 mL 離心管中，將離心管放入不同溫度的水浴鍋中溫浴。從0 min開始，每隔30 min 測定離心管中噬菌體效價[6]。

1.2.8 噬菌體的pH 穩定性 提前準備不同pH 的PBS 緩沖液，將100 μL 噬菌體效價為107PFU/mL的噬菌體原液加入到900 μL 預先準備好的不同pH的PBS 緩沖液中，使得混合后體系的最終pH 分別為（2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13），于37 ℃水浴鍋中溫浴2 h。使用雙層平板法測定噬菌體效價[6]。

1.2.9 噬菌體全基因組提取和功能基因分析 噬菌體全基因組提取采用苯酚-氯仿法，具體步驟參考文獻[9]。委托上海澤塔公司對提取的噬菌體474x1基因組進行全基因組測序，并對噬菌體基因組進行拼接，得到完整的基因組序列。使用DNA Statistics（http://www.geneinfinity.org/sms/sms_dnastats.html）對噬菌體基因組序列進行分析，包括四種堿基的組成比例、GC 平均含量。使用JSpeciesWS（https://jspecies.ribohost.com/jspeciesws/）對從NCBI 數據庫上下載的10 株弧菌噬菌體全基因組完整序列進行平均核苷酸同一性（ANI）統計，得到矩陣。使用微生信在線工具（http://www.bioinformatics.com.cn/plot_basic_matrix_heatmap_064）繪制熱圖。使用RAST 在線注釋工具（https://rast.nmpdr.org/）對全基因序列進行基因預測。使用tRNAscan-SE（https://www.swmath.org/software/8005）在線工具預測全基因組中有無tRNA 基因。使用NCBI 數據庫的BLASTn 對預測的各個基因進行逐個檢索分析，推測其基因功能。用BRIG（0.95）軟件繪制基因組圈圖。使用VFDB數據庫（https://www.mgc.ac.cn/VFS/）預測噬菌體474x1 基因組中可能存在的毒力基因，使用CARD數據庫（https://card.mcmaster.ca/）預測基因組中可能存在的抗生素抗性基因。使用MEGA 7.0 軟件建立基于末端酶大亞基的進化樹，分析噬菌體474x1 的親緣性。

1.2.10 噬菌體對基圍蝦中副溶血性弧菌的抑制作用參考葛強等[10]的實驗步驟稍作改進，將購買的新鮮蝦去殼，用無菌刀將蝦肉切為1 cm×1 cm 的樣品，重約1 g，將肉樣煮沸30 min 后置于無菌平皿中。在樣品中接種100 μL 1.0×105lgCFU/mL 副溶血性弧菌474，于超凈臺中風干10 min 使其吸附后用封口膜封住，作為對照組。實驗組應在副溶血性弧菌474 吸附后另外分別接種100 μL 1.0×108lgCFU/mL（MOI=1000）和100 μL 1.0×109lgCFU/mL（MOI=10000）的噬菌體懸液，常溫條件下靜置10 min 使其吸附后用封口膜封住。將樣品置于4 ℃，在第0、3、6、9、12 h 分別取樣，將樣品放入10 mL 離心管中，加入5 mL 生理鹽水，3000 r/min 離心10 min，使蝦肉沉淀，取上清液進行適當梯度稀釋，取1 mL 稀釋液采用平板計數法檢測蝦肉中副溶血性弧菌的菌量，從而檢測噬菌體的抑菌效果。

1.3 數據處理

采用Excel 2019 計算數據平均數和標準差、Origin 2022 進行折線圖繪制和IBM SPSS Statistics 23 的獨立樣本T檢驗進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 副溶血弧菌噬菌體形態學特征

以副溶血弧菌474 菌株為宿主菌從海鮮市場基圍蝦樣品中成功分離出1 株裂解性較強副溶血弧菌噬菌體，命名為474x1。培養后474x1 可在474 菌株的菌苔上形成清晰、透明的噬菌斑，直徑1.5～2 mm（圖1）。電鏡下觀察噬菌體的頭部呈六邊形，直徑約70.8 nm，尾長約18.3 nm。具有典型的有尾噬菌體目短尾病毒科病毒形態特征（圖2）。

圖1 副溶血弧菌噬菌體474x1 噬菌斑形態Fig.1 Plaque morphology of V.parahaemolyticus phage 474x1

圖2 副溶血弧菌噬菌體474x1 透射電鏡形態Fig.2 Transmission electron microscope morphology of V.parahaemolyticus phage 474x1

2.2 副溶血弧菌噬菌體474x1 宿主譜

副溶血弧菌噬菌體474x1 宿主譜如表1。噬菌體474x1 能夠裂解23 株副溶血弧菌中的19 株（19/23=82.61%），表明噬菌體474x1 對耐藥副溶血弧菌具有良好的裂解能力。

表1 副溶血弧菌噬菌體474x1 宿主譜Table 1 Host range of V.parahaemolyticus phage 474x1

2.3 副溶血弧菌噬菌體474x1 最佳感染復數

表2 為副溶血弧菌噬菌體474x1 效價測定結果。當MOI 為0.01 時，噬菌體效價達到最大為9.66 lgPFU/mL，說明噬菌體474x1 在感染副溶血弧菌474 時，噬菌體與宿主菌的數量的比值為0.01 時，可增殖最多的噬菌體。

表2 副溶血弧菌噬菌體474x1 的最佳感染復數Table 2 Multiplicity of infection of V.parahaemolyticus phage 474x1

2.4 副溶血弧菌噬菌體474x1 一步生長曲線

以培養時間為橫坐標，以反應體系中噬菌體效價的對數為縱坐標繪制噬菌體的一步生長曲線。如圖3 所示，噬菌體474x1 的潛伏期為10 min，裂解期為10～90 min，裂解末期噬菌體效價達到8.81 lgPFU/mL，裂解量為115 PFU/cell。

圖3 副溶血弧菌噬菌體474x1 一步生長曲線Fig.3 One-step growth curve of V.parahaemolyticus phage 474x1

2.5 副溶血弧菌噬菌體474x1 熱穩定性和pH 穩定性

噬菌體對溫度的敏感性如圖4 所示，474x1 在30～50 ℃的范圍內活性穩定，70 ℃時其活性迅速下降，30 min 被完全滅活；60 ℃孵育1 h 后效價可減少1 個數量級。474x1 的效價在pH4～11 之間均較穩定，但pH＞11 和pH＜4 條件下孵育2 h 后活性喪失（圖5）。

圖4 副溶血弧菌噬菌體474x1 熱穩定性Fig.4 Thermal stability of V.parahaemolyticus phage 474x1

圖5 副溶血弧菌噬菌體474x1 pH 穩定性Fig.5 pH stability of V.parahaemolyticus phage 474x1

2.6 副溶血弧菌噬菌體474x1 全基因組DNA 的提取

使用苯酚-氯仿法提取了噬菌體474x1 全基因組DNA，用超微量分光光度計測定提取的噬菌體474x1 DNA 終濃度為220 ng/mL 且OD260/280為1.88，說明提取出的DNA 濃度適宜且含有的雜質較少，滿足測序要求。

噬菌體474x1DNA 進行瓊脂糖凝膠電泳結果如圖6 所示，可以發現DNA 電泳條帶單一無其它條帶，且DNA 分子量較大，說明完整地提取出了噬菌體474x1 的基因組DNA。

圖6 噬菌體474x1 的全基因組提取Fig.6 Extraction of whole genome DNA of V.parahaemolyticus phage 474x1

2.7 副溶血弧菌噬菌體474x1 全基因組分析

噬菌體474x1 的基因組長度為47830 bp，堿基分布情況為A（30.42%）、T（29.16%）、C（20.45%）、G（19.96%），GC 平均含量為40.41%。噬菌體474x1全基因組序列BLASTn 比較結果顯示，噬菌體474x1 與副溶血弧菌噬菌體Vp41s3（索引號：MZ0 73369.1）有較高的同源性，同源性99.06%，覆蓋率為77%。但與其他弧菌噬菌體同源性均小于80%，如與霍亂弧菌噬菌體ICP2（索引號：HQ641345.1）同源性為78.55%，與創傷弧菌噬菌體Saratov-15（索引號：MT767883.1）同源性為78.45%。ANI 熱圖顯示474x1 與副溶血弧菌噬菌體Vp41s3 同源性最高（同一性×覆蓋率=73%），但與其他噬菌體基因組同源性均小于50%（圖7）。

圖7 平均核苷酸同源性熱圖Fig.7 Average nucleotide identity heatmap

2.8 副溶血弧菌噬菌體474x1 基因組功能基因注釋

使用RAST 在線注釋工具進行功能基因注釋。結果顯示，噬菌體474x1 基因組共有69 個開放閱讀框（open reading frame，ORFs），其中有24 個ORFs位于正鏈上，45 個ORFs 位于負鏈上。基因組長度為47830 bp，最長的ORFs 為4245 bp，最短的僅126 bp，平均長度643 bp。ORFs 總長為44376 bp，占全長的92.78%。經BLAST 比對，推測出的69個ORFs 中有14 個ORFs 已確定功能。通過這些特征基因功能將其分為4 個模塊，包括DNA 復制與調控模塊（ORF29、ORF35、ORF36、ORF39、ORF45、RF47、ORF49、ORF51、ORF54、ORF55）、DNA包裝模塊（ORF4、ORF5）、結構模塊（ORF1）、附加功能模塊（ORF32）。除了這14 個具有特定功能的基因外，其他的ORFs 都為假定蛋白，約占79.71%，其基因組圖譜如圖8 所示。采用tRNAscan-SE 篩查全基因組中無tRNA 基因，表明474x1 依賴宿主翻譯。通過VFDB 數據庫和CARD 數據庫預測噬菌體474x1 基因組不含毒力基因與抗生素抗性基因。因此，該結果表明噬菌體474x1 應用于食源性致病菌防控的安全性。

圖8 噬菌體474x1 的基因組圖譜Fig.8 Genomic map of phage 474x1

2.9 副溶血弧菌噬菌體474x1 進化樹分析

基于噬菌體474x1ORF4 末端酶大亞基構建的系統發育進化樹如圖9 所示，副溶血弧菌噬菌體474x1 與副溶血弧菌噬菌體Vp41s3（短尾噬菌體）在同一個進化分支上，另外與霍亂弧菌噬菌體ICP2，創傷弧菌噬菌體Saratov-12、Saratov-15 形成一簇，有著很近的親緣關系。

圖9 基于末端酶大亞基構建的系統進化樹Fig.9 Phylogenetic tree constructed based on terminal enzyme large subunit

2.10 噬菌體對基圍蝦中副溶血性弧菌的抑制作用

蝦肉在4 ℃放置12 h，副溶血弧菌濃度變化如圖10A 所示。在放置期間，接種5 lgCFU/mL 細菌的對照組菌量沒有明顯增長，從第0 h 的3.73 lgCFU/mL 下降到第12 h 的3.55 lgCFU/mL。實驗組的菌量相比于對照組在12 h 內均有明顯下降，具有統計學差異（P＜0.05），MOI=1000 實驗組在第3 h 相較對照組菌量下降了0.39 lgCFU/mL，MOI=10000 實驗組在第12 h 相較對照組菌量下降了0.92 lgCFU/mL，具有極顯著性差異（P＜0.01）。

圖10 副溶血弧菌噬菌體474x1 對蝦肉中副溶血弧菌抑菌效果實驗Fig.10 Bacteriostatic effect of phage 474x1 on V.parahaemolyticus in prawn meat

蝦肉在25 ℃放置12 h，副溶血弧菌濃度變化如圖10B 所示。在放置期間，接種5 lgCFU/mL 細菌的對照組菌量呈穩步增長的趨勢，在第12 h 增長到5.66 lgCFU/mL。實驗組的菌量相比于對照組在12 h 內均有明顯下降，MOI=1000 實驗組在第6 h 相較對照組菌量下降了1.04 lgCFU/mL，MOI=10000在第6 h 相較對照組菌量下降了1.82 lgCFU/mL，具有極顯著性差異（P＜0.01）。

3 討論與結論

目前，國內已有學者相繼分離出副溶血弧菌烈性噬菌體，丁云娟等[11]從水產品市場的污水中分離出來一株烈性噬菌體qdvp001，彭勇等[12]從青島岸邊海水中分離出兩株副溶血弧菌噬菌體VPp2、VPp3。本實驗室周敏等[13]從海鮮內臟、污水中分離出一株烈性噬菌體F23s1。本實驗也從基圍蝦樣品中分離出寬譜噬菌體474x1，對研發生物抑菌劑有重要價值。

本研究中，宿主譜的結果表明474x1 能夠裂解23 株耐藥副溶血弧菌中的19 株，表現出較寬的裂解譜范圍，宿主譜的差異可能是由于細菌細胞表面存在的受體的差異影響了噬菌體的吸附[14]。此外，噬菌體吸附具有高度特異性，這也意味著噬菌體對其他細菌是無害的，特別是那些有益的菌群。這也表明，474x1可以在未來用于防治特定的細菌性疾病，如弧菌病。

MOI 指的是噬菌體與宿主菌的比率。不同的噬菌體感染和殺滅細菌的方式不同，因此具有不同的最佳MOI。例如兩株副溶血性弧菌裂解噬菌體VB_VPS_BA3 和VB_VPS_CA8，最佳MOI 為0.1[15]。Ibrahim 等[16]對一株能夠裂解溶藻弧菌、哈維氏弧菌和副溶血弧菌的烈性噬菌體PhVh6 測定的最佳MOI為1。在本研究中，噬菌體增殖的最佳MOI 為0.01，表明以較低數量噬菌體感染宿主菌時，最終能獲得高效價的噬菌體，在生產中可用較低的成本得到大量噬菌體。

研究噬菌體的一步生長曲線可以發現噬菌體的生長規律[17]。挑選出潛伏期短裂解量大的噬菌體，對提高工業生產有巨大意義。474x1 的潛伏期與噬菌體VppYZU92[5]相似，后者的潛伏期較短為10 min，裂解量為35 PFU/cell。另一株噬菌體VppYZU64的潛伏期較長為35 min，但裂解量為150 PFU/cell[5]。在本研究中，474x1 的潛伏期較短且裂解量偏大，為10 min 和115 PFU/cell，十分適合規模化制備。

在各種脅迫條件下對噬菌體效價穩定性的測定結果有助于為噬菌體在細菌控制中的應用提供參考[18-19]。在本研究中，測定了噬菌體對溫度和pH 的抵抗力，以確定這些噬菌體對副溶血性弧菌感染的生防效果。溫度是影響噬菌體存活的一個重要因素[20]。它在噬菌體的附著、穿透和增殖過程中起著重要作用[21]。在本研究中，474x1 在50 ℃下穩定，在60 ℃孵育1 h 后效價下降，在70 ℃以上30 min 后完全失活，當應用于食品粗加工環境中時，它仍然可以存活。此外，環境的酸堿度會影響噬菌體的穩定性[19]。據報道，低pH 影響噬菌體聚集，降低其在細菌細胞上的吸附能力[22]。474x1 在較寬的pH 范圍保持高效價，與vap04 相似[23]。

本實驗選擇了2 種貯藏溫度，其中，4 ℃代表保藏溫度，25 ℃代表室溫。4 ℃下副溶血弧菌菌量均低于25 ℃下同一時間點菌量，這可能是因為低溫會抑制副溶血弧菌的生長。隨著貯藏時間的延長，25 ℃下MOI=1000 和MOI=10000 實驗組中的菌量均明顯下降，在第12 h 時實驗組中副溶血性弧菌數量分別比對照組降低0.18、0.87 lgCFU/mL，說明噬菌體474x1 能夠顯著（P＜0.01）抑制宿主菌的生長，但不能完全殺滅副溶血弧菌。高璐[23]在噬菌體對魚汁的抑菌實驗中，三株噬菌體Vmp03、Vpp07、Vap04 在魚汁分別對其宿主菌均有一定的抑制能力。在25 ℃條件下，經過Vmp03 處理后的實驗組相較對照組的菌量在第8 h 下降約2 lgCFU/mL；經過Vpp07、Vap04 處理后的實驗組相較對照組的菌量在第6 h 下降約1 lgCFU/mL。本實驗在25 ℃下MOI=1000，MOI=10000 的實驗組相較對照組在第6 h 時菌量分別下降1.04、1.82 lgCFU/mL，抑菌效果和高璐的研究相似。

綜上所述，474x1 是一株新的副溶血性弧菌噬菌體。該噬菌體裂解譜寬、裂解量大、潛伏期短。它在高溫下失活，但在60 ℃以下表現出較好的穩定性，能耐受寬范圍的pH，在食品中也有良好的抑菌效果，由于缺乏抗生素抗性基因和毒力基因，474x1 在不久后將會用來防控水產品副溶血性弧菌。