落葉松中花旗松素的提取、抑菌作用及其與白屈菜紅堿聯用協同抑菌作用機理

荊立成，楊 躍，楊 闊，李玫萱，趙 敏，崔岱宗

（東北林業大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150036）

花旗松素（Taxifolin，TFL）又名二氫槲皮素，是一種具有多種天然活性物質的二氫黃酮類化合物。自然界中，廣泛存在于落葉松、水飛薊、紅蓼、洋蔥和黃芪等多種松科與薔薇科的植物中，其中以落葉松中含量最高[1]，根莖部尤甚。常用的提取方法包括：熱水浸提法、乙醇回流法、酶誘導法、超聲法和有機溶劑萃取法等[2-3]。未來也可能通過構建基因工程菌株大規模發酵生產花旗松素。因花旗松素結構中含有較多的酚羥基，可表現出多種生物學活性與較強的抗氧化作用，現已研究發現其含有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗輻射及抗心血管系統疾病等功能，具備開發為防腐劑、保健品和食品的潛力[4-6]。此外，2021 年4 月，花旗松素已被我國衛健委認定為“新食品原料”，可見其市場前景十分廣闊。

白屈菜紅堿（Chelerythrine，CHE）是一種苯并菲啶型生物堿，具有抗炎抑菌、抗腫瘤、防治蟲害等生物活性[7]。目前研究發現白屈菜紅堿對多種典型病蟲害都具有顯著抑制作用，具備開發生物防治農藥的潛力，用于減輕作物病害[8]。但因單獨使用該藥物抑菌所需濃度較高，因此若能找到其他抗菌劑與之聯合使用，將降低藥量并增強抑菌活性，提升產品性能。已有研究表明，生物堿和黃酮類化合物都具有高效抑菌能力。因此，本實驗將白屈菜紅堿與花旗松素聯合使用觀察其抑菌能力是否增強。

基于此，本研究取材落葉松根莖部，采用超聲輔助乙醇熱浸提法提取花旗松素，經醚類萃取、重結晶技術進行純化，測定其純度與提取率，研究其對革蘭氏陽/陰性菌的抑菌能力和機理，并與白屈菜紅堿聯用進行了藥物聯合抑菌實驗，探究其抑菌效能，以期為未來食品、日化及醫藥領域的產品開發與行業發展提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌（E.coli）、金黃色葡萄球菌（S.aeruse）

東北林業大學微生物學科菌種保藏中心；過氧化氫酶試劑盒、過氧化物酶試劑盒、超氧化物歧化酶試劑盒 蘇州格銳思生物科技有限公司；花旗松素標準品上海源葉生物科技有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物 Oxoid 公司；甲醇（色譜級）Fisher 公司；無水乙醇、甲基叔丁基醚、二甲基亞砜、2-Nitrophenyl-β-D-galactopyranoside（鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷，ONPG）等化學試劑 分析純，國藥集團；Luria-Bertani（LB）培養基；落葉松 來自大興安嶺；白屈菜紅堿（CHE）（純度98%）東北林業大學微生物實驗室。

Agilent 1260 高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；5430R 低溫高速離心機 德國艾本德公司；JEM-2100 透射電子顯微鏡 日本電子株式會社；TU-1901 紫外分光光度計 北京普析通用儀器責任有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 花旗松素提取與純度計算 采用超聲輔助乙醇熱浸提法提取花旗松素[9]。取200 g 落葉松粉末加入2 L 90%乙醇，80 ℃水浴2 h 后超聲（功率300 W）震蕩1 h 過濾得濾液，利用旋轉蒸發儀進行減壓濃縮。取第一次提取液加入甲基叔丁基醚1.2 L，勻速攪拌20 min，靜止30 min，分離得到甲基叔丁基醚萃取液，此步驟重復3～4 次，將其減壓濃縮，凍干得粗提物。再經三次重結晶[10]，凍干得終產物。

準確稱取花旗松素標準品（HPLC≥98%）10 mg溶于乙醇中，定容至10 mL，制備成1 mg/mL 的對照液，配制濃度分別為0.05、0.1、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL的標準待測液，用于繪制花旗松素濃度標準曲線。花旗松素標準液及提取樣品均采用高效液相色譜測試，條件如下：

柱溫30 ℃、流動相40%水:60%甲醇、運行時間10 min、檢測波長288 nm、流速1.0 mL/min。此條件下，花旗松素出峰時間約為（2.672±0.1）min[11-12]。

根據對應出峰時間的出峰面積，將其帶入花旗松素濃度標準曲線得到樣品純度。另取適量花旗松素產物溶于去離子水，采用紫外分光光度計對其進行全光譜掃描，驗證提取物為花旗松素。

1.2.2 花旗松素對供試菌MIC 濃度測定及抑菌活性

配制LB 液體培養基：蛋白胨2 g，酵母提取物1 g，NaCl 2 g，蒸餾水200 mL，pH7.2～7.4，高壓滅菌待用。用0.01 mol/L PBS 溶解花旗松素，加入適量LB液體培養基，配制終濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg/mL 的花旗松素溶液，分別加入培養至對數生長期的E.coli、S.aureus菌液80 μL，終體積8 mL。各管充分混勻后置恒溫培養箱37 ℃ 130 r/min 振蕩培養。24 h 后取各組菌液測定OD600值。

抑制率＞80%所含最低藥物濃度為最小抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）[13]。

1.2.3 細菌形態學觀察 分別在培養至對數生長期的E.coli、S.aureus菌液中加入終濃度為0、0.5、1 MIC 的花旗松素溶液，每組設置三個重復，混勻后置于37 ℃培養箱，130 r/min 震蕩培養，于1、2、4、6、8、10、12 和24 h 分別取樣測定600 nm 處吸光值[14]，繪制生長曲線。另取適量菌液通過掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察菌體形態變化，樣品處理方法參照胡梅[15]。培養大腸桿菌、金黃色葡萄球菌與添加終濃度為1 MIC 的二氫槲皮素培養至12、24 h。放入離心管中（設置三組管）離心后倒去上清液并收集大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌泥與經二氫槲皮素處理后的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌泥。先將蓋玻片用純水和無水乙醇分別超聲清洗15 min，將離心后菌泥接觸到蓋玻片上并均勻分散，等自然晾干，之后加入適量的3%戊二醛固定液將樣品全部覆蓋后放置-4 ℃冰箱固定12 h。使用現配制的乙醇（濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%，每次濃度重復3 次，更有效脫水作用）進行乙醇濃度梯度脫水，每次震蕩脫水10～15 min 即可。之后保存樣品于-4 ℃冰箱樣品自然晾干待測。

1.2.4 細菌胞內大分子物質泄露情況的測定 采用分光光度法測定花旗松素處理后菌體內大分子物質含量[16]，以評價菌體被破壞的程度。將培養至對數期的菌體8000 r/min 離心10 min，用0.01 mol/L PBS清洗3 次并重懸，分別加入花旗松素使其終濃度為1/2、1、2 MIC，以無花旗松素的細菌培養液為對照，放置于37 ℃搖床130 r/min 振蕩培養，于1、4、8、24 h 取混懸樣液1 mL，8000 r/min 離心10 min，取上清適當稀釋后，立即于260、280 nm 測定吸光值，每組重復三次。

1.2.5 細菌細胞質膜滲透性的測定 參照吳海霞[17]方法。制備待測菌液，分別加入不同濃度梯度的花旗松素（1/2、1、2 MIC）設置三組平行，再加入1 mg/mL的ONPG（鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷）混勻，37 ℃水浴，每隔1 h 測于405 nm 的吸光值OD2（共測4 個小時時間段）。陰性對照為加入緩沖液，吸光度值為OD1。細胞質膜滲透性增加導致的吸光度值為OD=OD2-OD1。

重懸待測菌液，分別加入不同濃度花旗松素，使其終濃度為2 MIC，每組設置三組平行充分混勻，37 ℃水浴孵育1 h 后離心，取上清液再加入1 mg/mL的ONPG（鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷），37 ℃條件下再水浴孵育4 h，測定在405 nm 下的吸光度值OD2。細菌經超聲波破碎（冰浴，功率200 W，超聲5 s，間隔5 s）離心后取上清液，測吸光度值OD1作為陽性對照。上清液中β-半乳糖苷酶相對活性（%）=OD2/OD1×100，通過分光光度計測定β-半乳糖苷酶水解乳糖類似物ONPG 產物的特征吸收評價花旗松素對細胞質膜滲透性的影響。

1.2.6 細菌胞內抗氧化酶系活性的測定 采用1.1 中材料對花旗松素作用于細菌后的CAT 酶、POD酶和SOD 酶活性變化進行測定[18]。

取適量培養至對數生長期的E.coli、S.aureus，配制終濃度為1 MIC 的TFL 溶液，以0 MIC 為對照，分別裝于2 mL 離心管內，每組設置3 組平行重復，培養至1、4、8、24 h。將樣品離心后加入1 mL 提取液冰浴超聲破胞，之后在4 ℃條件下12000 r/min 離心10 min，取上清根據試劑盒說明書進行實驗。

1.2.7 花旗松素與白屈菜紅堿聯合抑菌 使用Bliss 獨立模型計算藥物聯用作用指數[19]，使用以下其公式計算協同指數：

式中，FAB：指在聯用藥物時細菌的生長速率（24 h測得OD 值），A 為花旗松素，B 為白屈菜紅堿。FA，FB：分別指有A、B 時細菌的生長速率；F0：指沒用藥處理時細菌的生長速率；S：為藥物聯用作用指數，該參數若為正值，則代表藥物聯用對菌體具協同作用；負值則呈拮抗作用[20]。

1.2.8 花旗松素與白屈菜紅堿的聯合抑菌機制 同1.2.4、1.2.5 和1.2.6 操作，分別測定菌體的胞內大分子物質泄漏、細菌膜滲透性和抗氧化酶系的變化。實驗中，將花旗松素樣品變更為0.25 MIC 的花旗松素和0.25 MIC 的白屈菜紅堿混合液。

1.3 數據處理

采用SPSS 26.0 軟件進行數據處理，采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。Origin 2021 軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 花旗松素提取及純度計算

根據高效液相色譜測定不同濃度花旗松素標準品所得峰面積，繪制標準曲線（圖1A）。據此計算在落葉松中提取所得花旗松素樣品（圖1C）純度為90%。經紫外分光光度計全光譜掃描（圖1B），發現樣品最大吸收峰值位于288 nm，這與劉文叢等[21]研究結果一致，可確定提取物為純度較高的花旗松素。

圖1 花旗松素標準曲線及全波長掃描光譜圖和液相分析結果Fig.1 Taxifolin standard curve,full-wavelength scanning spectrum and liquid phase analysis results

2.2 花旗松素的MIC 測定及抑菌活性

MIC 表示受試物抑菌能力的指標[22]，能更準確反映其抑菌活性。結果如圖2 所示，花旗松素對E.coli和S.aureus均具有較好的抑菌效果。當花旗松素的質量濃度達到1.2 mg/mL 時，對兩株細菌的抑菌活性大于80%，分別為81.12%和83.95%。

圖2 花旗松素對菌體MIC 測定Fig.2 MIC determination of taxifolin on the bacteria

細菌的生長曲線反映了當前培養條件下的微生物群體生長規律。如圖3 所示，在細菌培養液中加入花旗松素后將嚴重影響大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長，各時段菌液的OD600值均明顯降低。相較未添加花旗松素的對照組菌液，加入1/2 MIC 花旗松素后1 h 即發生明顯變化，遲緩期延長，12 h 時近似達到細菌生長峰值，進入穩定期?；ㄆ焖伤貪舛葹? MIC 時，細菌的生長即刻被抑制，生長速率極其緩慢，未見生長對數期。培養至8 h 時的大腸桿菌組OD600值僅為0.173，較對照組下降了86.4%。由此可見，花旗松素對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性明顯，細菌生長在1 MIC 濃度下幾乎被完全抑制。

圖3 花旗松素對供試菌生長曲線的影響Fig.3 Effects of taxifolin on the growth of the tested bacteria

2.3 花旗松素對菌體形態影響

為觀測花旗松素對供試菌作用后對其外觀和微觀結構的影響，研究加入2 MIC 濃度的花旗松素，通過掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡進行觀察。如圖4 所示，正常培養的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌外部光滑，細胞形態飽滿，結構緊密，菌體之間界限清晰。但當培養液中添加花旗松素后，菌體表面逐漸粗糙，邊緣模糊，伴有明顯褶皺和凹陷，變形明顯[23]。隨處理時間延長，菌體形態更加不整，外壁不全，可見大量細胞碎片，出現消融跡象[24]。由此可見，花旗松素的作用可能是使細菌形態改變，細胞壁溶解，細胞膜破裂，并伴隨大量內容物泄露，最終導致細菌消解死亡。

圖4 花旗松素對細菌形態結構變化的影響Fig.4 Effects of taxifolin on the morphology structure changes of bacteria

2.4 花旗松素對菌體核苷酸泄露影響

當菌體細胞膜受到損傷后，胞內大分子物質會向胞外滲出[23]，因此根據核酸和蛋白質的含量變化可作為評價細胞膜完整性的指標。實驗通過核酸、蛋白質等大分子物質在260、280 nm 處的吸光值判斷菌體胞內大分子泄漏情況[24-25]。結果如圖5 所示，在花旗松素作用下，兩株菌的OD260和OD280值均有顯著增加（P＜0.05），且隨濃度升高而增大。這說明隨花旗松素濃度增加，細菌細胞膜的通透性更高，使正常情況下不能透過細胞膜的大分子物質大量泄漏，進而影響細胞正常生長，抑制菌體繁殖。

圖5 花旗松素對供試菌胞內大分子物質泄露的影響Fig.5 Effects of taxifolin on leakage of intracellular macromolecular substances of the tested bacteria

隨培養時間推移，兩株細菌對照組的OD260和OD280值也有所增加，這可能是由于細胞受到了輕微的破損或者機械損傷，但含有花旗松素的實驗組明顯較對照更高。以E.coli為例，培養至24 h 的1/2、1、2 MIC 實驗組OD260測試值是同期對照組的1.18、1.52 和1.88 倍，表明菌體有大量內容物泄露，與花旗松素濃度呈正相關，且泄漏量隨處理時間延長而增大。對比兩株供試菌受到影響的程度，E.coli組OD260變化較S.aureus組更大，這可能是由于花旗松素對革蘭氏陰性菌的細胞壁膜破壞更明顯所致。

2.5 花旗松素對菌體細胞質膜滲透性影響

β-半乳糖苷酶是細菌胞質內的水解酶，可分解乳糖。研究發現，ONPG 作為乳糖類似物可進入菌體細胞被β-半乳糖苷酶水解，產生半乳糖和在405 nm有特征吸收的鄰-硝基苯酚。若細胞膜遭受破壞，膜通透性增強，ONPG 可迅速進入菌體細胞[26]。因此可以通過測定OD405判斷鄰-硝基苯酚的產生量，進而評價花旗松素對細胞膜滲透性的作用。結果如圖6 所示，可見添加花旗松素后，E.coli和S.aureus的細胞質膜滲透性均有顯著增加（P＜0.05）。在培養作用初期，花旗松素對E.coli膜滲透性作用明顯，隨花旗松素濃度增大而增強。隨處理時間延長，花旗松素對S.aureus膜滲透性影響逐漸增強，4 h 時細菌膜滲透性較E.coli更高。

圖6 花旗松素對供試菌細胞膜滲透性作用及β-半乳糖苷酶泄漏情況Fig.6 Effects of taxifolin on cell membrane permeability of test bacteria and leakage of β-galactosidase

將花旗松素處理后的菌液離心測試β-半乳糖苷酶相對活性，觀察胞外β-半乳糖苷酶泄漏情況。結果表明，2 MIC 花旗松素處理E.coli和S.aureus后，檢測到胞外β-半乳糖苷酶的相對活性分別為79.15%和70.1%，說明花旗松素的引入使菌體細胞膜受到破壞，導致上清液中有大量β-半乳糖苷酶泄漏，這與胞內大分子物質泄漏的測試結果一致。

2.6 花旗松素對菌體胞內抗氧化酶活性影響

在遭受環境脅迫時，微生物胞內電子氧化呼吸鏈會受到影響，自由基代謝平衡被打破，誘導氧化應激[19]。過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）是胞內清除超氧自由基的抗氧化酶系，保護機體免受應激損傷[27]。如圖7 所示，在花旗松素作用下，E.coli和S.aureus胞內POD、CAT、SOD 酶活較對照組明顯升高，且隨作用時間延長而增大。當花旗松素作用于E.coli到24 h 時，各實驗組差異最大，其POD、CAT、SOD 酶活分別是對照組的1.72、1.22、1.53 倍。在花旗松素對S.aureus作用中，CAT 和SOD 在8 h 時最顯著，分別是對照組的1.21、1.71 倍，24 h 時POD 差異最大，是對照組的2.54 倍。這說明花旗松素作用后使細菌均產生了不同水平的氧化壓力，生成了更多的ROS 造成菌體損傷，而細菌自身為應對這類刺激產生了更高水平的抗氧化酶。

圖7 花旗松素對供試菌胞內抗氧化酶系活性的影響Fig.7 Effects of taxifolin on the activities of antioxidant enzyme system of the bacteria

2.7 花旗松素與白屈菜紅堿聯合抑菌效果

如圖8，當將白屈菜紅堿和花旗松素以1/4 CHE+1/4 TFL 濃度混合用于聯合抑菌時發現，對于E.coli而言，藥物聯用效果在前4 h 中不明顯，在6～24 h 過程中較1/4 MIC 白屈菜紅堿和1/4 MIC 花旗松素單獨作用效果更顯著。對S.aureus來說，兩種藥物聯用后對細菌生長的抑制作用持續到24 h，效果明顯。通過Bliss 獨立模型[28]計算藥物聯合作用對E.coli和S.aureus生長速率結果分別為-0.0279和0.0142，表明花旗松素和白屈菜紅堿藥物聯用后對E.coli表現為拮抗作用，而對S.aureus表現為協同作用。后續實驗將對藥物聯用于S.aureus的協同作用機制進行主要分析。

圖8 藥物聯合對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌抑菌及協同指數的計算Fig.8 Calculation of bacteriostatic and synergistic index of drug combination on E.coli and S.aureus

2.8 花旗松素與白屈菜紅堿聯合抑菌的探究

如圖9，相較于前文中對花旗松素作用于S.aureus的胞內大分子物質泄漏情況，1/4 白屈菜紅堿+1/4 花旗松素濃度的白屈菜紅堿和花旗松素聯用后，測得實驗組OD260和OD280值明顯較花旗松素單獨作用更高，甚至分別是24 h 2 MIC 濃度花旗松素的1.04 倍和1.6 倍。此外，通過在405 nm 處測試鄰-硝基苯酚的吸光度值發現，在藥物聯用作用下培養液吸光度值隨菌體生長和培養時間延長而逐步上升，說明有大量的ONPG 被β-半乳糖苷酶水解，表明細胞膜滲透性增強。而且，培養上清液中β-半乳糖苷酶活達87.01%，較2 MIC 花旗松素單獨作用S.aureus酶活性高16.91%，這也說明藥物聯用后對菌體細胞膜破壞更嚴重，導致β-半乳糖苷酶泄露量增多。

圖9 藥物聯用對金黃色葡萄球菌核苷酸及酶泄露和細胞膜滲透性的影響Fig.9 Effects of drug combination on nucleotides and enzymes leakage and cell membrane permeability of S.aureus

聯合抑菌作用后胞內POD、CAT 和SOD 酶活變化如圖10 所示。相較對照組，各抗氧化酶活均有所上升。經比較分析，24 h CAT、SOD 和POD 酶活較單獨使用1 MIC 濃度花旗松素對S.aureus作用要更高，分別是其1.28、1.25、1.11 倍。表明1/4 MIC濃度花旗松素和1/4 MIC 濃度白屈菜紅堿對菌體殺傷作用更大，氧化壓力更強。

圖10 藥物聯用對金黃色葡萄球菌POD、CAT、SOD 酶活性的影響Fig.10 Effects of drug combination on the activities of POD,CAT and SOD enzymes of S.aureus

3 結論

本實驗通過在落葉松中利用超聲輔助乙醇熱浸提法得到純度較高的花旗松素純度為90%，將其用于抑菌研究。發現其對革蘭氏陰性和陽性菌具有較好的抑菌效果，花旗松素對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌MIC 均為1.2 mg/mL，抑菌效果達到80%以上。并通過觀察抑菌過程中的形態變化，發現明顯褶皺、凹陷干癟、菌體表面有不規則突起，均勻且出現空腔，開始出現消融現象，胞內大分子物質泄漏24 h OD260均與對照組相比增長了3.21、3.01 倍，說明花旗松素對菌體細胞膜產生破壞作用，導致大量核苷酸泄露。2 MIC 花旗松素處理E.coli和S.aureus后，檢測到胞外β-半乳糖苷酶的相對活性分別為79.15%和70.1%，說明花旗松素的引入使菌體細胞膜受到破壞，導致上清液中有大量β-半乳糖苷酶泄漏，這與胞內大分子物質泄漏的測試結果一致?？寡趸富钚詼y定中發現酶活性增強，與花旗松素破壞菌體產生了更多的ROS 引起菌體應激性增強有關。與白屈菜紅堿進行藥物聯合抑菌實驗，發現二者對革蘭氏陰性菌表現為拮抗作用，而革蘭氏陽性菌具有協同作用，這可能是由于細菌細胞壁膜組成成分差異所致。在聯合抑菌實驗中，添加較低濃度的花旗松素和白屈菜紅堿即可達到更好的抑菌效果，細胞膜滲透性大幅增加比單獨作用S.aureus酶活性高16.91%，這也說明藥物聯用后對菌體細胞膜破壞更嚴重，導致β-半乳糖苷酶泄露量增多，1/4 MIC 藥物聯用對菌體殺傷力更大氧化壓力也隨之增強，伴有大量的胞內大分子物質泄漏。這說明二者聯用的協同抑菌效果主要是通過增強對細胞膜的破壞實現的?；诖?，我們在下一步研究計劃中將主要針對典型食源性致病菌，挖掘花旗松素及其與生物堿聯用的廣譜抑菌性能和機理，以擴展花旗松素產品的應用領域，制造可觀的生態經濟效益，使其成為特色林業產業發展的新亮點。