白藜蘆醇治療非小細胞肺癌機制的網絡藥理學分析及實驗驗證

董楊逗，鈕宇恒，張 羽，霍如婕，劉清華，田新瑞,

（1.山西醫科大學基礎醫學院，山西太原 030001；2.山西醫科大學第一臨床醫學院，山西太原 030001；3.山西醫科大學第二醫院，山西太原 030000）

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，發病率和死亡率高于結腸癌、乳腺癌和前列腺癌，在所有惡性腫瘤中排名第一[1-2]。依照組織病理學特征，可分為小細胞肺癌（Small cell lung cancer，SCLC）與非小細胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC）。NSCLC 為肺癌發病率最高的分型之一，占所有肺癌病例的80%～85%[3]。根據組織學類型，NSCLC 主要分為鱗狀細胞癌、腺癌、大細胞癌，每種類型的癌細胞通過不同的方式生長和擴散[4]。可用于肺癌的治療包括手術、放療、化療、免疫調節治療和分子靶向治療[1]。以化療為基礎的方案仍然是治療的首選選擇。然而，化療對晚期NSCLC 患者仍然不夠有效，5 年生存率僅為15%，中位生存期為10～12 個月[5]。因此，需要進一步探索NSCLC 發生發展的機制，為NSCLC 治療尋找新的靶點。

白藜蘆醇是一種天然的多酚類植物抗毒素，它廣泛存在于葡萄皮，葡萄酒，漿果，堅果等物質中[6]。相關研究證實，白藜蘆醇具備諸多生理和藥理活性，如抗氧化、抗炎、保護心臟和抗癌屬性[7]。白藜蘆醇的抗癌特性已在幾種不同類型的癌癥中得到證實，包括乳腺癌、結腸癌、子宮內膜癌等[6-8]。Wang 等[9]發現在NSCLC 原位大鼠模型中，白藜蘆醇通過抑制STAT3/HIF-1α/VEGF 通路抑制腫瘤進展。另一項研究報道了白藜蘆醇通過調控p53、Bax、Bcl-2 和caspase-3 的表達來抑制人肺腺癌A549 細胞的增殖并誘導凋亡[10]。這些研究為檢測白藜蘆醇與NSCLC之間的關系提供了線索，但白藜蘆醇對肺癌發揮抑制作用的潛在靶點和分子機制仍未完全清楚。

網絡藥理學是以系統生物學理論為基礎，針對特定分子靶標進行藥物分子模擬及設計的新興學科，通過對靶點網絡的綜合分析，發掘藥物作用的潛在信號通路，明確藥物療效的作用機理[11]。分子對接技術是利用計算機高精度對接模擬，基于分子模型模擬配體-靶標相互結合[12]。本研究應用網絡藥理學方法和分子對接技術進行靶標預測，分析白藜蘆醇抑制NSCLC 的可能作用機制，運用臨床病例驗證及細胞實驗進一步評估，提高結果的可靠性。為后續研究及臨床應用提供一定參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人肺腺癌A549 細胞 上海細胞庫；白藜蘆醇（分子質量228.24 g/mol，純度＞99.99%）、脫脂牛奶粉末 MCE 公司；青-鏈霉素溶液、0.25%胰酶細胞消化液、聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上海碧云天公司；胎牛血清（FBS）、DMEM 細胞培養基 美國賽默飛公司；PBS 緩沖液、PMSF 蛋白酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑 生工生物工程公司；預染蛋白Marker、BCA 蛋白定量試劑盒、RIPA 裂解液、5×上樣緩沖液（5×loading Buffer）、TBST 緩沖液、聚丙烯酰胺凝膠快速配置試劑盒（SDS-PAGE）、ECL化學發光液 武漢博士德公司；Anti-GAPDH 抗體、Anti-SRC 抗 體、Anti-EGFR 抗 體、Anti-p-PI3K 抗體、Anti-p-AKT 抗體、HRP 標記羊抗兔IgG 武漢ABclonal 公司。

CKX41 倒置顯微鏡 日本Olympus 公司；Midi 40 細胞培養箱 美國Thermo Fisher Scientific 公司；Mini-PROTEAN? Tetra Cell 垂直電泳儀、rans-Blot SD 半干電轉膜儀、ChemiDoc? Imaging System WB 全自動化學發光成像儀 上海伯樂公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 白藜蘆醇靶點的篩選 通過數據庫PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）得到化合物白藜蘆醇化學結構，并保存對應Canonical SMILES 號。此外，通過結合Swiss Target Prediction（swisstargetprediction.ch）和Target net 數據庫（targetnet.scbdd.com）得到白藜蘆醇的潛在作用靶點。

1.2.2 NSCLC 的靶點篩選 通過數據庫Genecards（https://www.genecards.org）和數據庫OMIM（https://www.omim.org）以及數據庫TTD（db.idrblab.net），對NSCLC 潛在靶點進行篩選。

1.2.3 藥物-疾病-靶點網絡分析 將數據庫預測的白藜蘆醇的靶點和NSCLC 的靶點上傳到Venny 2.1.0平臺（bioinfogpcnb.csic.es/tools/venny），獲取藥物的靶點和疾病的靶點交集，繪制白藜蘆醇與NSCLC 的交集靶點Venny 圖。

1.2.4 PPI 網絡構建與分析 將篩選出的白藜蘆醇與NSCLC 共有靶點，導入STRING 數據庫（https://string-db.org），種屬定義為“Homo sapiens”進行分析，構建藥物靶蛋白和疾病靶蛋白PPI 網絡，其最低閾值取中等 “medium confidence”得到靶蛋白相互作用的核心網絡關系。導入Cytoscape 3.7.2 軟件包，進一步繪制藥物靶蛋白和疾病靶蛋白相互作用網絡圖。對網絡的拓撲參數進行軟件分析和計算，得到各個靶點的度值（degree）和介數（betweenness centrality，BC）等，直觀顯示排名前十名的靶標蛋白[11]。

1.2.5 GO 和KEGG 富集分析 為了解釋藥物靶點對基因功能的影響，將以上選取的白藜蘆醇和NSCLC共有靶點引入Metascape 數據庫（https://metascape.org）中，與R 語言結合，獲得對應的GO 和KEGG通路富集結果。

1.2.6 分子對接 選取白藜蘆醇和NSCLC 互作蛋白PPI 網絡中度值排名前三位的關鍵靶點，實現了白藜蘆醇與靶蛋白的分子對接，通過進一步在PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）檢索獲取白藜蘆醇的3D 結構式。在PDB 數據庫（https://www.rcsb.org）將關鍵靶點PDB 格式進行下載，EGFR、SRC、ESR1 等靶蛋白PDB 編號分別為6z4b、1o4k 以及2r6y。用Pymol 軟件處理去水和配體，保存[6]。利用Autodock Vina 和Pymol 軟件將3 個關鍵靶點與白藜蘆醇進行分子對接。

1.2.7 癌癥基因組圖譜分析臨床數據 從癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫獲得NSCLC 病人（樣本數為1017 例）和健康人群（樣本數為627 例）的臨床信息，使用R 軟件v4.0.3 對篩選出的八個核心靶基因進行統計分析，兩組樣本顯著性通過Wilcox 檢驗，P＜0.05被認為具有統計學意義。

1.2.8 細胞培養及干預 將A549 細胞懸液接種于培養皿，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。實驗分為空白對照組和白藜蘆醇藥物干預組。待細胞處于對數生長期時進行給藥處理，空白對照組不做藥物處理，藥物干預組分別使用濃度為30、50 μmol/L 的白藜蘆醇干預。

1.2.9 Western Blot 檢測蛋白表達 收集各組細胞加入增強型RIPA 裂解液冰上孵育45 min，將裂解液在12000 g，4 ℃下離心10 min 提取蛋白。蛋白濃度使用BCA 蛋白定量試劑盒檢測。將總蛋白與上樣緩沖液混合，進行SDS-PAGE 電泳，凝膠常規處理后，將蛋白轉移到PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入合適濃度的GAPDH（內參），SRC、EGFR、p-PI3K、p-AKT 一抗4 ℃孵育過夜，與抗兔辣根過氧化物酶偶聯抗體在室溫下孵育1 h，孵育后常規洗膜處理，ECL 化學發光顯影，使用Bio-Rad 凝膠成像系統觀察蛋白表達。Image J 軟件對目的條帶進行統計分析，蛋白相對表達水平=目的條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值。

1.3 數據處理

數據處理使用GraphPad Prism 8 統計軟件分析，數據檢測至少重復3 次，以均數 ±標準差（D）表示。組間比較采用方差分析，方差齊性時，用oneway ANOVA 檢驗，兩兩比較則用LSD-t檢驗；方差不齊時，采用Kruskal-Wallis H 檢驗。P＜0.05 表示有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 白藜蘆醇藥物靶點及非小細胞肺癌疾病靶點的獲取

從PubChem 中檢索化合物白藜蘆醇的Canonical SMILES 號，通過Swiss Target Prediction 數據庫和Target net 數據庫檢索獲取到預測靶點一共174個。應用Genecards、OMIM、TTD 這三個數據庫進行疾病靶點的篩選，得到652 個NSCLC 相關靶點。

2.2 PPI 網絡分析及關鍵靶點篩選

預測得到的白藜蘆醇靶點與NSCLC 相關靶點交集共40 個，如圖1 所示。將40 個靶點上傳至STRING 數據庫，得到靶點之間的PPI 網絡，不同顏色的邊代表不同類型，邊的粗細代表關聯分值大小，節點即為靶點，如圖2 所示。將度值從大到小排序，前五位的有EGFR、SRC、ESR1、HSP90AA1、TNF；介數越大的靶點在藥物作用過程中越關鍵，其排名前5 位的靶點分別為ESR1、MMP9、CDC42、TNF、RELA，如表1 所示。整合度值和介數前5 位的靶點，去除重復，得到以下基因EGFR、SRC、ESR1、HSP90AA1、TNF、MMP9、CDC42、RELA為主要關鍵靶點。預測其可能為白藜蘆醇作用的關鍵靶標。

圖1 白藜蘆醇-非小細胞肺癌疾病靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of resveratrol-NSCLC disease target

圖2 白藜蘆醇治療非小細胞肺癌的蛋白互作網絡分析圖Fig.2 PPI network at intersection targets of resveratrol and NSCLC

表1 白藜蘆醇治療非小細胞肺癌疾病前10 個關鍵靶點Table 1 Top 10 key targets of resveratrol for non-small cell lung cancer disease

2.3 GO 與KEGG 富集分析

將篩選出的40 個靶標基因于Metascape 數據庫做GO 功能分析和KEGG 通路富集分析。GO 富集分析包括三種，分別是生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）以及細胞組分（cellular component，CC）。利用R 語言可視化處理排序在前10 位具有顯著性差異的基因富集結果，如圖3 所示。BP 研究結果表明交集基因集中于調控細胞凋亡信號通路（regulation of apoptotic signaling pathway）、細胞凋亡信號通路負調節（negative regulation of apoptotic signaling pathway）、激酶活性正調節（positive regulation of kinase activity）等生物過程。CC 的富集結果顯示交集基因主要分布在薄膜筏（membrane raft）、膜微域（membrane microdomain）、局部粘連（focal adhesion）等細胞部位。MF 富集結果表明交集基因參與調控蛋白酪氨酸激酶活性（protein tyrosine kinase activity）、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性（protein serine/threonine/tyrosine kinase activity）、轉錄輔助因子結合（transcription coactivator binding）等分子功能發揮治療非小細胞肺癌的作用。

圖3 GO 富集分析結果Fig.3 GO enrichment analysis results

在Metascape 數據庫進行KEGG 通路富集分析共獲得131 條KEGG 條目，取前10 個主要通路進行數據處理后，得到KEGG 通路分析氣泡圖，縱坐標代表靶標基因主要參與的信號通路，如圖4 所示。結果顯示，白藜蘆醇治療NSCLC 的相關信號通路有腫瘤蛋白多糖通路（proteoglycans in cancer）、內分泌抵抗通路（endocrine resistance）、雌激素信號通路（estrogen signaling pathway）、人巨細胞病毒感染通路（human cytomegalovirus infection）、PI3K-AKT（PI3K-Akt signaling pathway）等多條信號通路。

圖4 KEGG 富集分析結果Fig.4 Results of KEGG enrichment analysis

2.4 分子對接分析

為了進一步評估白藜蘆醇與關鍵靶標之間的結合能力，提高靶標網絡的準確性，利用Autodock Vina 對排名前三位核心靶點和白藜蘆醇做分子對接分析，對接過程中設置參數，調整X-Y-Z 坐標和網格大小，找到靈活對接的最佳對接條件，并記錄受體和配體的對接位置。分子對接結果的分析是指結合能，結合能小于0，說明受體分子與配體分子能自發結合且產生相互作用，結合能越小，說明化合物所需的自由能越少，對接能力越強，對接后分子的穩定性越高[6,11]。對接結果表明，白藜蘆醇和三個核心靶蛋白結合自由能均在-5 kcal/mol 以下，表明結合高度穩定，具有對接意義，如表2 所示。最后，使用Pymol軟件可視化分析和觀察白藜蘆醇和靶標的對接結果，結果顯示白藜蘆醇通過可見的氫鍵相互作用與其蛋白質靶標結合，靶點的疏水口袋也被白藜蘆醇藥物所占據，如圖5 所示。

圖5 前三位核心靶點和白藜蘆醇分子對接可視化結果Fig.5 Molecular docking visualization of the top three core targets and resveratrol

表2 對接參數及相應計算結果Table 2 Docking parameters and corresponding calculation results

2.5 核心靶基因在NSCLC 中的表達水平

為探究核心靶基因的表達水平與NSCLS 發生發展的關系，利用癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫獲得基因表達數據以及NSCLC 患者（n=1017）和正常健康人群（n=627）臨床數據集，通過篩選、提取并分析靶基因在TCGA 數據庫中 NSCLC 患者及健康對照人群中的表達數據，結果表明與健康人群相比，核心 靶 基 因EGFR、SRC、ESR1、HSP90AA1以 及MMP9的表達在NSCLC 病人中顯著上調，差異具有統計學意義（P＜0.05）；而TNF、CDC42以及RELA的表達相比于健康人群，在NSCLS 病人中顯著下調，差異具有統計學意義（P＜0.05），如圖6 所示。這些發現表明通過網絡藥理學篩選預測的靶基因與NSCLC 的發生發展密切相關。

圖6 NSCLC 患者和健康人群中各靶基因的表達水平Fig.6 Expression levels of each target gene in NSCLC patients and healthy population

2.6 白藜蘆醇對A549 細胞蛋白表達的影響

根據網絡藥理學和臨床樣本分析的數據，進一步探究白藜蘆醇對相關靶基因及信號通路的影響。根據上述結果，在八個核心靶基因中選擇排名前兩位的EGFR 和SRC 進行初步驗證，TCGA 臨床樣本結果提示EGFR 和SRC 在NSCLC 中具有高表達或高活性的特點，如圖6 所示。且有研究表明SRC 可通過與激活的EGFR 起協同作用，參與激活其下游信號通路，從而影響腫瘤細胞的增殖[13-14]。根據KEGG 富集分析，PI3K-AKT 通路具有較強的生物學意義，為進一步分子生物學實驗驗證提供了方向。因此，使用不同濃度（30、50 μmol/L）的白藜蘆醇處理人肺腺癌A549 細胞，利用Western Blot 實驗進行初步探究白藜蘆醇對靶蛋白EGFR 和SRC 及其下游PI3K/AKT 信號通路蛋白的影響，如圖7 所示。WesternBlot 結果顯示，與空白對照組相比，白藜蘆醇藥物干預抑制了A549 細胞中SRC、EGFR、p-PI3K和p-AKT 的活性并以劑量依賴的方式降低了蛋白的表達，差異具有統計學意義（P＜0.05），如圖8所示。

圖7 白藜蘆醇對人肺腺癌A549 細胞的作用假設模型Fig.7 Hypothesis of the effect of resveratrol on human lung adenocarcinoma A549 cells

圖8 不同濃度白藜蘆醇對人肺腺癌A549 細胞蛋白表達的影響Fig.8 Effect of different concentrations of resveratrol on protein expression in human lung adenocarcinoma A549 cells

3 討論與結論

本研究共篩選出40 個白藜蘆醇治療NSCLC的作用靶點，并以可視化和交互的模式呈現。通過構建交集靶點的PPI 蛋白互作網絡和拓撲學分析，最終獲得八個關鍵靶基因，分別為EGFR、SRC、ESR1、HSP90AA1、TNF、MMP9、CDC42、RELA。EGFR屬于酪氨酸激酶受體家族，在上皮源性惡性腫瘤中經常過度活躍[15]。靶向EGFR 的受體酪氨酸激酶抑制劑已用于NSCLC 的臨床治療[16]。但仍有TKIs 治療耐藥的出現[17]。因此白藜蘆醇有可能為其聯合NSCLC 的靶向治療協同抗腫瘤活性帶來新契機。SRC 參與許多細胞信號轉導的調控，對腫瘤的生長、轉移以及血管生成有著至關重要的作用[18]。在NSCLC 中具有高表達或高活性的特點[19]。研究表明，SRC 可通過與激活的EGFR 起協同作用，參與激活下游信號通路影響腫瘤細胞增殖[13]，也可通過調節G1/S 轉化影響細胞周期[20]。ESR1 是雌激素受體的一種亞型[21]，研究表明ESR1 通過與靶基因啟動子中的雌激素應答元件和AP-1 增強子元件結合，促進基因轉錄[22]。此外，ESR1 信號傳導也可能與影響T 細胞浸潤的腫瘤微環境因素相關[23]。HSP90α是熱休克蛋白家族成員[24]，被認為在肺癌的侵襲和遷移調節中起關鍵作用[25]。TNF 及其受體在NSCLC 中廣泛表達[26]，研究表明TNF 可以促進細胞死亡或腫瘤生長[27]。MMP9 是一種基質金屬蛋白酶[28]，研究發現MMP9 的表達水平在NSCLC 中顯著上調，通過PI3K 信號轉導級聯抑制EGFR 信號可顯著調節NSCLC 的MMP9 的表達[29]。CDC42 已被確定在許多人類癌癥中表達異常，包括NSCLC[30]。此外，也有研究報道腫瘤區域RELA 表達與炎癥浸潤強度相關[31]。

GO 功能富集分析白藜蘆醇治療NSCLC 的相關靶基因，提示白藜蘆醇抗癌作用與細胞凋亡有密切關系。已有研究證實了白藜蘆醇通過促進細胞凋亡在NSCLC 中的抗腫瘤作用[9]，這與本研究預測結果一致。KEGG 通路富集分析表明白藜蘆醇在治療NSCLC 的過程中主要涉及腫瘤蛋白多糖、雌激素、PI3K-AKT 等多條信號通路。研究發現雌激素途徑在NSCLC 發展中的作用是多方面的，一方面，雌激素可易位到細胞核調節基因的轉錄[32]；另一方面雌激素可以激活SRC 導致下游信號傳導的激活，包括RAS/RAF/MEK/ERK 和PI3K/AKT 途徑[33-34]。PI3K/AKT 通路調節細胞生長和增殖，在癌癥中經常由于突變、擴增、缺失、甲基化和翻譯后修飾而失調[35]。在NSCLC 中，PI3K/AKT 信號通路與腫瘤發生進展密切相關[36]。以上富集分析顯示了白藜蘆醇的潛在靶點分布于多個生物過程及信號通路，這些有效成分協同起到防治NSCLC 的作用，為后續研究提供了思路。

利用TCGA 數據庫初步分析臨床樣本中靶基因的表達與NSCLC 發生發展的關系。結果提示核心靶基因EGFR、SRC、ESR1、HSP90AA1以及MMP9的表達在NSCLC 中顯著上調，TNF、CDC42以及RELA的表達在NSCLS 中顯著下調（P＜0.05）。進一步在細胞水平上探討白藜蘆醇抗NSCLC 的潛在作用機制，由于SRC 的激活參與了癌癥的進展且與EGFR 之間存在相互作用，影響著許多下游蛋白，抑制SRC 可能會中斷EGFR 的下游信號通路。通過Western Blot 實驗，結果提示白藜蘆醇抑制了A549細胞中SRC、EGFR、p-PI3K、p-AKT 的活性和蛋白表達，這可能導致癌細胞侵襲和遷移能力的下降。揭示了白藜蘆醇發揮其抗癌效應可能是通過抑制NSCLC 中SRC 相關信號通路，包括PI3K/AKT 信號通路。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學與實驗驗證就白藜蘆醇治療NSCLC 的抗癌效應進行了初步探討，為后續白藜蘆醇的基礎研究和臨床應用提供理論依據和參考價值。