嵌合型抗原受體T細胞在惡性黑色素瘤中應用進展

張立坤 岳武恒 鄒征云

1南京中醫藥大學太倉附屬醫院皮膚科,江蘇太倉, 215400;2南京中醫藥大學太倉附屬醫院腫瘤科,江蘇太倉, 215400;3南京大學醫學院附屬鼓樓醫院腫瘤中心,江蘇南京,210008

惡性黑素瘤(malignant melanoma, MM)是一類起源于黑素細胞的惡性腫瘤,可發生于皮膚黏膜等部位[1,2],我國每年約新增2萬MM病例,約占所有惡性腫瘤的1%,在歐美國家MM是最常見的致死性皮膚腫瘤之一。惡性黑素瘤惡性程度高,易發生遠處轉移(常見于肝、肺、骨、腦),預后差[3,4]。盡管目前已有免疫卡控點抑制劑(例如PD-1單抗、CTLA-4單抗)及BRAF/MEK抑制劑(例如索拉菲尼、維莫拉非尼、達普拉非尼)等靶向與免疫藥物在臨床應用,但仍面臨患者免疫反應性有限、腫瘤耐藥性產生、潛在的嚴重毒副作用等因素制約,僅部分患者可從中獲益[5,6]。嵌合型抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)是近年來備受矚目的工程化腫瘤特異性T細胞療法,對表達特定靶點的腫瘤細胞進行特異性殺傷,可一定程度上克服信號通路分子靶向抑制劑的耐藥性[7],并避免免疫卡控點抑制劑的延遲效應[8]。惡性黑素瘤存在豐富的細胞膜表達標志物,可作為治療靶點,因此CAR-T在MM腫瘤免疫治療中具有一定的潛力價值,本文就近年來CAR-T療法在惡性黑素瘤中的研究進展作介紹。

1 惡性黑素瘤免疫治療研究現狀

惡性黑素瘤免疫治療藥物主要包括免疫卡控點抑制劑、細胞因子、免疫激動劑單抗等[9],涉及相關免疫分子有[10]:①免疫卡控點分子:PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM3、LAG3;②免疫激活作用的配體分子:4-1BB、OX40;③細胞因子:IL-2、IFNα-2b。此外,腫瘤疫苗及工程化T細胞等策略也在MM免疫治療中也展開積極探索,臨床試驗結果展示出良好療效[11,12]。

以免疫卡控點抑制劑為代表的單克隆抗體已在MM免疫治療中廣泛應用,諸如伊匹單抗Ipilimumab(CTLA-4單抗)、帕博利珠單抗Pembrolizumab(PD-1單抗)、納武單抗Nivolumab(PD-1單抗)等免疫卡控點抑制劑已獲批臨床應用于惡性黑素瘤治療[13,14]。此外,OX40單抗等免疫激動劑抗體在治療惡性黑素瘤臨床試驗中也展現出較強的免疫激活作用,活化增強T細胞抗腫瘤效應[15,16]。免疫卡控點抑制劑這類單克隆抗體藥物雖然在部分患者中取得良好療效,但長期用藥過程中仍觀察到嚴重毒副作用而被迫中斷療程[17],尤其在66歲以上老年患者中有30%以上發生免疫相關不良事件[18,19],對毒副作用的預防和及時治療顯得尤為重要。目前已有多種單克隆抗體聯合使用,或單克隆抗體聯合化療的臨床探索,增強免疫治療效果的同時期望減少藥物毒副作用。

白細胞介素-2(interleukin-2,IL-2)是重要的免疫調節劑,高劑量IL-2可有效促進效應T細胞活化增殖,增強抗腫瘤活性[20]。高劑量IL-2治療進展期MM雖然在部分患者中可延長生存期,但是高劑量IL-2易引起嚴重毒副作用,例如低血壓、心律失常、譫妄等,因此通常將IL-2聯合PD-1單抗或聯合SBRT放療可取得更佳療效,并控制相關毒副作用發生[21-23]。干擾素-α-2b(interferon-alpha-2b,IFN-α-2b)具有殺傷腫瘤細胞,增強抗腫瘤免疫反應的作用[24],高劑量IFN-α-2b已作為惡性黑素瘤術后高危復發人群的輔助治療手段,但臨床試驗結果顯示,其對總體生存期的改善并沒有達到預期效果[25],且高劑量IFN-α-2b也伴有流感樣癥狀、皮膚變態反應等副作用[26],仍需進一步優化聯合用藥。

腫瘤疫苗主要包括細胞負載疫苗(以DC細胞疫苗為主)、多肽疫苗(以化學合成多肽為主)、基因疫苗(以DNA、mRNA為主),配合相應免疫佐劑,可聯合其他免疫藥物應用于MM腫瘤免疫治療[27]。腫瘤疫苗采用的MM靶點包括S-100、Gp100、Melan、MITF及SOX10等腫瘤抗原[28],腫瘤疫苗聯合細胞因子療法(IL-2、IFN-α-2b),在多項惡性黑素瘤臨床試驗中展現了一定的療效[29,30],但是腫瘤疫苗發揮療效需經歷腫瘤抗原遞呈、免疫細胞識別抗原、T細胞活化增殖、誘導產生特異性殺傷T細胞等一系列漫長的免疫應答過程,不利于進展期惡性黑素瘤的疾病控制,研究者將腫瘤疫苗與工程化T細胞聯合應用于MM免疫治療,增強短期內對腫瘤進展的控制,并獲得持續的抗腫瘤免疫效應[31]。由于惡性黑素瘤除了RAS、BRAF突變外缺乏更多可用于疫苗靶點的高頻熱點突變[32],而兼具有強免疫原性的泛突變靶點則更有限,疫苗靶點設計需充分考慮個體化定制,潛在獲益人群局限,這也給進一步的臨床轉化帶來挑戰。相比之下,CAR-T細胞針對的腫瘤靶點為MM特異性生物標志物,對抗原的免疫原性及遞呈水平無嚴格要求,潛在獲益人群更廣[33],盡管CAR-T在實體瘤中存在脫靶效應、免疫微環境抑制等制約因素的挑戰[34],但目前CAR-T細胞在進展期及轉移性MM臨床試驗中,單用或聯合其他免疫療法均展示出一定的臨床應用價值,在傳統免疫藥物之外提供了新的發展方向,值得深入探究。

2 CAR-T治療黑素瘤作用機制

CAR-T細胞經基因工程改造,表達嵌合型抗原受體CAR,經典結構包含①胞外段的抗原靶向結構域;②穿膜段;③胞內段的共刺激結構域;④胞內段的T細胞激活結構域。CAR-T細胞在回輸人體后,由靶向結構域(例如單鏈抗體)特異性結合黑素瘤細胞表面抗原,并通過共刺激結構域(例如CD28、4-1BB)以及T細胞激活結構域(CD3)進行信號轉導,刺激CAR-T細胞增殖、活化,釋放TNF-α、IFN-γ、IL-6等細胞因子,激活免疫系統對黑色素瘤細胞進行殺傷,同時,CAR-T分泌的穿孔素與顆粒酶素可直接對腫瘤細胞殺傷。此外,CAR-T自身 實現抗腫瘤療效。

CAR-T細胞作用機制明確,呈現出特異性強、免疫激活效應廣泛、不依賴于腫瘤抗原遞呈水平及免疫原性等特點,具有廣闊的臨床應用前景,目前已有多項CAR-T細胞療法獲批臨床應用于血液系統腫瘤,而在惡性黑素瘤,尤其是轉移性黑素瘤,已開展多項CAR-T臨床試驗,臨床轉化潛力不俗。

3 CAR-T細胞療法在惡性黑素瘤中的應用

CAR-T細胞為T細胞經基因工程技術改造而來,由嵌合型抗原受體中包含的抗原識別模塊特異性結合腫瘤細胞表面生物標志物,抗原結合后進行CAR-T細胞活化信號轉導,刺激T細胞特異性免疫應答,CAR-T隨后快速活化增殖并釋放殺傷性細胞因子,殺傷表達靶點抗原的腫瘤細胞。基于MM腫瘤細胞表面的多種生物標志物,可作為CAR-T靶點的有雙唾液酸神經節苷脂(disialoganglioside GD2,GD2)、硫酸軟骨素蛋白多糖4(chondroitin sulfate proteoglycan-4,CSPG4)、紐約食管鱗狀細胞癌-1(New York esophageal squamous cell carcinoma 1,NYESO-1)、人黑色素腫瘤相關抗原(Glycoprotein gp100,Gp100)、人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)、血管內皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)、腫瘤壞死因子配體超家族成員7(tumor necrosis factor ligand superfamily member 7,TNFSF7,又稱CD70)等,部分靶點的CAR-T療法已在相應抗原陽性表達MM患者中開展臨床試驗,以評估療效及安全性。

3.1 Anti-GD2 CAR-T 神經節苷脂GD2作為CAR-T靶點在多種腫瘤中應用,在惡性黑素瘤中GD2表達率為38%[35],目前有多項臨床前研究及臨床試驗評價Anti-GD2 CAR-T在惡性黑素瘤中療效。Gargett等[36]利用Anti-GD2 CAR-T聯合PD-1單抗,可對GD2及PD-L1陽性腫瘤細胞造成有效殺傷,并在Ⅰ期臨床試驗(ACTRN12613000198729)研究發現,在轉移性惡性黑素瘤患者中該聯合策略有效延長Anti-GD2 CAR-T在體內持續免疫應答反應,抑制腫瘤生長,且未觀察到嚴重不良反應事件。以GD2為靶點的CAR-T在轉移性MM(NCT02107963)、難治性/復發性MM(NCT02482532)、轉移性葡萄膜MM(NCT03635632)中已有多項臨床試驗開展,旨在評價其安全性及有效劑量,試驗結果暫未公布。除了聯合PD-1單抗,Shum等[37]將IL-7細胞因子受體(IL-7 cytokine receptor,C7R)基因轉入Anti-GD2 CAR-T,以進一步增強工程T細胞活化增殖及抗腫瘤活性,動物實驗結果顯示,經C7R修飾的CAR-T組比對照T細胞組生存期延長近2倍,目前該CAR-T的Ⅰ期臨床試驗(NCT03635632)仍在進行中。

3.2 Anti-HER2 CAR-T HER2在惡性黑素瘤中表達率雖然不及其他靶點豐度高,僅為3%[35],但在葡萄膜惡性黑素瘤這類型MM中表達是顯著升高的,HER2是其重要靶點之一[38]。因葡萄膜MM對免疫卡控點抑制劑等常規免疫治療藥物不敏感,并且驅動基因GNAQ及GNA11缺乏成藥性而無靶向藥物,所以研究者將攻克重點轉向Anti-HER2 CAR-T,體外實驗結果顯示葡萄膜MM腫瘤細胞對Anti-HER2 CAR-T敏感,在人源化小鼠模型中,Anti-HER2 CAR-T可有效抑制葡萄膜MM及皮膚MM生長,并且有部分小鼠為完全緩解狀態,證實該CAR-T在葡萄膜惡性黑色素瘤治療中具有應用前景[38]。目前HER2相關CAR-T的Ⅰ期臨床試驗已啟動(NCT04483778),研究者將采用第二代CAR-T結構進行多靶點的免疫細胞治療,HER2作為被評估靶點之一,其結果將對Anti-HER2 CAR-T后續的臨床應用提供參考。

3.3 Anti-VEGFR2 CAR-T 血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)與惡性黑素瘤血管生成及腫瘤轉移密切相關,基礎研究表明,血管內皮生長因子A(VEGF-A),或VEGF-A與胎盤生長因子(placental growth factor,PGF)形成的異二聚體(VEGF-A/PGF),均可激活VEGFR2,引起血管生成反應,最終促進惡性黑素瘤發生轉移[39]。針對這一靶點,Chinnasamy等[40,41]設計了Anti-VEGFR2 CAR-T,并聯合IL-2,在B16惡性黑素瘤小鼠模型中取得良好療效,將生存期延長至對照組的2～3倍。但針對該靶點的CAR-T在Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(NCT01218867)結果顯示,招募的24例轉移性惡性黑素瘤、腎癌患者接受治療后,23例患者出現疾病進展,僅1例患者出現部分緩解,同時,約20%患者出現嚴重不良反應(肝功能損害、低氧血癥)。為提高該CAR-T療效,Lanitis等[42]提出利用VEGFR2單抗聯合CAR-T治療,在MM小鼠模型中,聯合組抑瘤效果顯著優于單用CAR-T組,腫瘤微環境分析顯示,聯合組中抑制性CAR-T比例減少,CAR-T展現出對腫瘤的持續殺傷能力,這也為未來臨床試驗治療策略設計提供參考。目前對Anti-VEGFR2 CAR-T治療有效率的提升仍需進一步研究,并控制相關毒副作用發生,以期取得更好的臨床應用效果。

3.4 Anti-CD70 CAR-T CD70作為生物標志物高表達于惡性黑素瘤、腦膠質瘤等多個癌種,根據臨床樣本檢測結果,CD70在原發性MM和轉移性MM中表達率分別達到95%和37%[43],是CAR-T療法的潛力靶點。Yang等[44]針對CD70靶點,設計了一種雙靶點CAR-T,利用CAR結構中的Anti-CD70 scFv和Anti-B7-H3 scFv,同時靶向惡性黑素瘤細胞膜的CD70及B7-H3,在MM小鼠模型中,這種雙靶點CAR-T比單靶點CAR-T展現出更強的抑瘤效應,也為后續以CD70為靶點的CAR-T研究提供思路,在靶向結合腫瘤細胞的基礎上,利用共刺激分子進一步增強免疫反應,腫瘤靶向與免疫共刺激的雙重效應,或成為未來CAR-T的重要研究方向之一。目前Anti-CD70 CAR-T已開展Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(NCT02830724),在CD70陽性惡性黑素瘤中評價療效及安全性,試驗結果值得期待。

3.5 Anti-Gp100 CAR-T Gp100是惡性黑素瘤細胞最常見的過表達蛋白,陽性率超過60%,而在正常組織中低表達,其作為腫瘤抗原具有免疫原性,已有相關腫瘤疫苗研究,但在MM腫瘤免疫治療中療效有限,常需聯合其他療法控制腫瘤進展[45]。雖然Gp100為胞內蛋白,無法直接作為CAR-T靶點,但Zhang等[46]利用Gp100被遞呈于細胞膜的抗原肽/HLA-A2復合物作為靶點,將特異性結合該復合物的TCR樣抗體GPA7(TCR-like Antibody)作為CAR-T抗原識別區域,成功構建靶向MM胞膜遞呈Gp100的CAR-T,體內外實驗均顯示該CAR-T可抑制Gp100陽性的MM腫瘤細胞生長,證實了遞呈于胞膜的Gp100作為CAR-T靶點的可行性。以Gp100為靶點的CAR-T目前在招募6名Ⅳ期MM或復發性MM患者進行Ⅰ期臨床試驗(NCT03649529),以初步評估療效及安全性。

3.6 Anti-NYESO-1 CAR-T NYESO-1是一種癌睪抗原(cancer-testis antigen),腫瘤特異性強,在惡性黑素瘤中表達率約為10%～15%[47,48],而在正常組織中僅睪丸組織表達,其余均不表達。NYESO-1作為細胞內抗原蛋白,以往工程化T細胞利用TCR-T對其遞呈抗原進行識別結合并殺傷腫瘤細胞,而隨著TCR樣抗體的發展,已有針對NYESO-1遞呈抗原/HLA復合物的scFv或mAb,并應用于CAR-T構建,使得Anti-NYESO-1 CAR-T在惡性黑素瘤中應用成為可能。Liu等[49]利用HLA-A2/NYESO-1 (抗原表位肽157-165)復合物為抗原制備scFv,并將該scFv應用于CAR-T構建,體內外試驗顯示,Anti-NYESO-1 CAR-T對陽性惡性黑素瘤細胞特異性殺傷,CAR-T分泌IFN-γ水平約為對照T細胞的10倍,CAR-T治療組腫瘤體積僅為對照T細胞組的約1/3～1/2,動物實驗療效顯著。以NYESO-1為靶點的CAR-T已進入Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(NCT03638206),招募NYESO-1陽性惡性黑素瘤患者,臨床試驗在進行中,憑借NYESO-1良好的腫瘤特異性,該CAR-T未來臨床應用前景可期。

4 CAR-T療法面臨的挑戰與機遇

盡管目前惡性黑素瘤的CAR-T治療開展了數十項臨床試驗(表1),但公布試驗結果的較少,大部分處于招募階段,臨床前研究取得的體內外良好療效,能否在臨床試驗中取得成功仍是挑戰。為進一步提高CAR-T療效,一方面可聯合免疫卡控點抑制劑,或在CAR-T中引入免疫共刺激信號,以增強工程T細胞活化增殖能力,并持續抗腫瘤活性[50];另一方面,利用腫瘤炎性反應,增強工程T細胞在腫瘤微環境的募集與浸潤,克服免疫微環境抑制,也是發揮療效的關鍵因素[51]。總體而言,CAR-T在MM中的臨床應用仍然是機遇與挑戰并存。

惡性黑素瘤的免疫微環境常呈抑制性狀態,為使CAR-T充分在微環境浸潤并激活抗腫瘤免疫應答,腫瘤細胞免疫原性死亡(immunogenic cell death,ICD)與免疫細胞的炎性浸潤是重要環節[52]。Wang等[53]將CCR2、CCR4等趨化因子受體表達于CAR結構中,CAR-T在引起腫瘤細胞ICD同時,CAR-T細胞可進一步結合腫瘤微環境中釋放的趨化因子,進而增強其在腫瘤組織的募集浸潤,持續發揮抗腫瘤效應。此外,Evgin等[54]將含有干擾素基因的溶瘤病毒通過基因工程技術應用于CAR-T細胞構建,增強腫瘤組織的炎性反應,有效募集CAR-T浸潤于腫瘤微環境發揮療效。因此,提高ICD水平并增強CAR-T在腫瘤組織的浸潤是未來提升CAR-T在惡性黑色素瘤中療效的重要策略。

CAR-T在腫瘤免疫微環境中出現的PD-1及CTLA-4表達水平上調并發生T細胞耗竭,也是制約療效的關鍵因素[55,56],針對PD-1/PD-L1等免疫抑制調控軸,除了聯合使用免疫卡控點抑制劑等單抗藥物,Rafiq[57]及Ping等[58]各構建了一種可分泌Anti-PD-1 scFv的多功能CAR-T,可通過旁分泌及自分泌形式產生scFv阻斷PD-1免疫抑制信號通路,不僅增強CAR-T自身抗腫瘤活性,同時也產生“旁觀者效應”,增強微環境中其他殺傷性T細胞的抗腫瘤活性,在實體瘤動物模型中取得良好療效。此外,Anti-PD-L1 scFv分泌型CAR-T亦被成功構建并在臨床前研究中證實可增強CAR-T對實體瘤療效[59],未來該策略有望繼續應用于CTLA-4、TIM3等scFv分泌型CAR-T構建,克服免疫抑制及T細胞耗竭的制約,提升CAR-T應用于惡性黑色素瘤的療效。

除了阻斷免疫卡控點信號通路,上調免疫共刺激信號也是增強CAR-T療效的重要策略,例如T細胞表面的TIGIT分子(T cell Ig and ITIM domain),是T細胞免疫應答共刺激信號組成部分,但由于惡性黑色素瘤細胞表達的CD155可作為配體結合TIGIT而抑制T細胞免疫應答[60],因此Hoogi等[61]將CAR-T進一步基因改造后表達嵌合共刺激開關受體(chimeric costimulatory switch receptor,CSR),利用TIGIT 胞外結構域與CD28信號轉導結構域融合表達作為CSR,發揮免疫信號共刺激開關分子作用,MM動物模型評價療效發現,這種共刺激增強型CAR-T顯著增強IFN-γ、TNF-α分泌,治療組腫瘤體積縮小近50%,小鼠生存期亦顯著延長。利用CSR增強CAR-T免疫反應殺傷腫瘤細胞或可為未來應用于MM的CAR-T設計提供參考。

5 結語

惡性黑素瘤在我國人群好發于肢端皮膚(例如足底、手指末端等)及黏膜部位(例如鼻腔與口咽黏膜等),因易發生遠處轉移,目前仍是皮膚腫瘤中預后最差的[62],致死率排名前列,采用傳統手術、化療、放射治療或相互聯合在進展期及轉移性MM患者中并未取得理想療效,因此綜合抗腫瘤治療是當前臨床實踐迫切需要的,包括CAR-T在內的免疫治療是其中不可忽視的重要組成部分。盡管目前CAR-T療法可能引起細胞因子風暴、神經毒性、移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)、過敏反應等毒副作用,仍是未來需要改善和控制的重點,但CAR-T療法經各類免疫增強策略優化后展現出的腫瘤殺傷能力仍是極具臨床應用前景,也是目前MM免疫治療所需要的重要力量。CAR-T細胞療法在多項臨床前研究中已展現出對惡性黑素瘤的良好抑瘤效果,并且CAR-T聯合ICD藥物、免疫卡控點抑制劑,以及scFv分泌型、免疫共刺激型等新型CAR-T的出現,進一步增強了在實體瘤中應用的療效及安全性。目前針對轉移性及難治性/復發性MM患者的多項CAR-T臨床試驗開展中,相信未來隨著基因工程技術的發展及免疫微環境研究的深入,CAR-T療法在惡性黑素瘤中將具有更廣闊的應用前景。