CircRERE調節miR-128-3p/WEE1軸促進人多發性骨髓瘤細胞系增殖、遷移和侵襲

方 媛，李 軼，王 瑋*

西安市第九醫院1.腫瘤血液科；2.血管介入科，陜西 西安 710054

多發性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一種以漿細胞惡性增殖為特征的血液系統腫瘤。由于極高的轉移率和耐藥性,MM的生存率仍不令人滿意[1-2]。環狀RNA精氨酸-谷氨酸二肽重復序列(circular RNA arginine-glutamate dipeptide repeat sequence,circRERE)在MM患者中上調,敲低circRERE表達可通過海綿狀結合miR-152-3p抑制MM細胞增殖和硼替佐米抗性,促進MM細胞凋亡[3-4]。生物信息學預測顯示circRERE序列中含有miR-128-3p的結合位點。miR-128-3p在MM中表達下調,lncRNA HCP5通過結合miR-128-3p促進MM的進展[5]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase,WEE1)在包括MM在內的多種類型癌中高表達,抑制WEE1表達可促使腫瘤細胞凋亡并抑制其增殖[6]。生物信息學預測顯示WEE1是miR-128-3p的潛在靶基因,且在膠質瘤中miR-128-3p可靶向負調控WEE1表達[7]。基于此筆者推測circRERE可能通過靶向miR-128-3p/WEE1軸來調節MM進展。故本研究旨在觀察circRERE對MM細胞遷移、侵襲和增殖的影響及潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞:人MM細胞系(U266、RPMI-8226、NCI-H929、LP-1)和人胚腎細胞系293T(上海雅吉生物科技有限公司);選取西安市第九醫院的健康體檢者10名作為健康受試者,通過肘靜脈采集外周血5 mL,用CD138富集法從健康受試者外周血中分離正常漿細胞(normal plasma cells,nPCs),健康受試者均簽署知情同意書,本研究獲得西安市第九醫院倫理委員會的審核與批準(H20221021)。

1.1.2 主要試劑:Lipofectamine2000、Trizol(Invitrogen公司);BCA試劑盒、RIPA裂解液和噻唑藍MTT試劑盒(上海碧云天公司);實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)試劑盒、反轉錄試劑盒(TaKaRa公司);兔源一抗anti-磷酸甘油醛脫氫酶(phosphoglyceraldehyde dehydrogen-ase,GAPDH)、anti-WEE1及山羊源二抗(Abcam公司);1%結晶紫染液(北京索萊寶公司);5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)染色液(廣州銳博生物公司);雙熒光素酶試劑盒(上海北諾生物科技有限公司);CircRERE、miR-128-3p和U6引物(南京金斯瑞公司設計合成);sh-circRERE、sh-NC、miR-128-3p inhibitor、inhibitor-NC、miR-128-3p mimic、mimic-NC、野生型circRERE(circRERE-WT)質粒、WEE1-WT質粒,突變型circRERE(circRERE-MUT)質粒和WEE1-MUT質粒(上海吉瑪制藥公司設計、合成)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組與轉染:nPCs和MM細胞系(U266、RPMI-8226、NCI-H929、LP-1)以及HEK-293T細胞均用含1%青霉素-鏈霉素雙抗、10% FBS的RPMI-1640培養基,于37 ℃、5% CO2培養箱中常規培養。

取對數增殖期的RPMI-8226細胞,以5×104個/孔接種至24孔板內,待細胞匯合度達80%時棄去培養基,利用Lipofectamine2000進行轉染,將細胞分為對照組(control)(未進行轉染)、sh-circRERE組、sh-NC組、miR-128-3p inhibitor組、inhibitor-NC組、sh-circRERE+inhibitor-NC組和sh-circRERE+miR-128-3p inhibitor組,轉染48 h后收集各組RPMI-8226細胞。sh-circRERE、sh-NC、miR-128-3p inhibitor和inhibitor-NC的轉染量均為50 pmol/L。

1.2.2 RT-qPCR檢測circRERE、miR-128-3p表達:使用Trizol從nPCs和MM細胞系及1.2.1各組RPMI-8226細胞中提取總RNA,通過NanoDrop 2000測定RNA濃度后,使用反轉錄試劑盒合成cDNA。U6作為miR-128-3p的內參,GAPDH作為circRERE的內參。采用RT-qPCR試劑盒和RT-qPCR儀進行PCR擴增反應。circRERE、miR-128-3p的定量采用2-ΔΔCt法。引物序列:circRERE:forward 5′-TTTG CAGGAATGTGTGATGG-3′,reverse 5′-ATGAATCC ACTCG GGCTTTA-3′;miR-128-3p:forward 5′-GGGT CACAGTGAACCG-3′,reverse 5′-AACTGGTGTCGTG GAGTCGGC-3′;GAPDH:forward 5′-GTCTCCTCTGA CTTCAACAGCG-3′,reverse 5′-ACCACCCTGTTGCT GTAGCCAA-3′;U6:forward 5′-GTGCTCGCTTCGG CAGCAC AT-3′,reverse 5′-TACCTTGCGAAGTGCTT AAAC-3′。

1.2.3 Western blot檢測WEE1表達: 用RIPA裂解液提取nPCs和MM細胞及1.2.1各組RPMI-8226細胞總蛋白質。蛋白質樣品使用BCA法進行定量。然后將蛋白質通過凝膠電泳分離,并轉移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉阻斷1 h后,4 ℃下與兔源anti-GAPDH、anti-WEE1一抗過夜孵育。次日,用山羊源二抗在室溫下孵育膜2 h。最后,根據制造商的說明,滴加ECL發光液顯色。采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行灰度分析,定量蛋白表達。

1.2.4 MTT法和EdU免疫熒光染色實驗測定細胞增殖:MTT實驗:RPMI-8226細胞接種至96孔板(1×104個/孔),孵育48 h,添加MTT試劑,4 h后加入DMSO,繼續孵育10 min。用酶標儀測量490 nm處吸光度(A)。增殖率(%)=(A轉染處理組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。

EdU免疫熒光染色:轉染后的RPMI-8226細胞分別在添加50 μmol/L EdU標記液的培養基中孵育2 h,4%多聚甲醛固定后,甘氨酸孵育后,阿波羅染色(Apollo)30 min,5 μg/mL DPAI進行DNA染色30 min,熒光顯微鏡下檢測EdU陽性細胞。

1.2.5 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移:RPMI-8226細胞接種至24孔板(5×104個/孔),孵育48 h后棄去培養基,用100 μL槍頭在孔中間豎著劃一條直線,PBS清洗2遍去除劃下的細胞,繼續培養48 h,而后于倒置顯微鏡下拍照,借助Image J軟件計算細胞劃痕面積愈合率。

1.2.6 Transwell小室法檢測各組RPMI-8226細胞侵襲:預先于Transwell小室的上表面涂上Matrigel膠,收集轉染的RPMI-8226細胞,在無血清RPMI-1640培養基中重懸。將4×104個細胞接種于孔徑為8.0 μm的24孔室的上室,將含10% FBS的RPMI-1640培養基作為化學引誘劑加入下腔。37 ℃,孵育48 h,用棉簽輕輕拭去上表面的細胞,隨后置于固定液中30 min,PBS清洗、晾干后置于1%結晶紫染液中染色10 min,借助倒置顯微鏡計數細胞數量,即為侵襲細胞數量。

1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗證實miR-128-3p與circRERE或WEE1的靶向作用關系:通過ENCORI在線數據庫預測miR-128-3p與circRERE或WEE1的結合位點。將circRERE、WEE1野生序列或突變序列分別插入到pmiRGLO載體,構建circRERE-WT/MUT質粒、WEE1-WT/MUT質粒。

取對數增殖期的293T細胞,以5×104個/孔接種至24孔板內,待細胞匯合度達80%時利用Lipofectamine2000進行轉染,實驗分組如下:1)circRERE-WT+miR-128-3p mimic組、circRERE-WT+mimic-NC組、circRERE-MUT+miR-128-3p mimic組、circRERE-MUT+mimic-NC組;2)WEE1-WT+miR-128-3p mimic組、WEE1-WT+mimic-NC組、WEE1-MUT+miR-128-3p mimic組、WEE1-MUT+mimic-NC組。48 h后,收集細胞,用裂解緩沖液裂解。根據制造商的方案,使用雙熒光素酶試劑盒評估熒光素酶活性。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 CircRERE、miR-128-3p、WEE1在MM細胞系中的表達

與正常漿細胞nPCs比較,MM細胞RPMI-8226、U266、NCI-H929、LP-1中circRERE、WEE1表達增加,miR-128-3p表達減少(P<0.05)(圖1)。其中,RPMI-8226細胞中circRERE、WEE1表達水平最高,miR-128-3p表達水平最低,故選擇RPMI-8226細胞進行后續實驗。

*P<0.05 compared with nPCs cells; # P<0.05 compared with RPMI-8226 cells.

2.2 各組RPMI-8226細胞中circRERE、miR-128-3p、WEE1的表達

與對照組比較,sh-circRERE組RPMI-8226細胞circRERE、WEE1表達減少,miR-128-3p表達增加(P<0.05);miR-128-3p inhibitor組miR-128-3p表達減少,WEE1表達增加(P<0.05);與sh-circRERE組比較,sh-circRERE+miR-128-3p inhibitor組RPMI-8226細胞miR-128-3p表達減少,WEE1表達增加(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with control group; # P<0.05 compared with sh-NC group; &P<0.05 compared with inhibitor-NC group; △ P<0.05 compared with sh-circRERE group; ▲ P<0.05 compared with miR-128-3p inhibitor group; ☆ P<0.05 compared with sh-circRERE+inhibitor-NC group.

2.3 敲低circRERE和/或miR-128-3p表達后RPMI-8226細胞增殖、遷移和侵襲

與對照組比較,sh-circRERE組RPMI-8226細胞增殖率、EdU陽性細胞比例、劃痕面積愈合率、侵襲數均減少(P<0.05),miR-128-3p inhibitor組增殖率、EdU陽性細胞比例、侵襲數、劃痕面積愈合率均增加(P<0.05);sh-circRERE+miR-128-3p inhibitor組與sh-circRERE組比較,增殖率、EdU陽性細胞比例、侵襲數、劃痕面積愈合率均增加(P<0.05)(圖3,4,5)。

*P<0.05 compared with control group; # P<0.05 compared with sh-NC group; &P<0.05 compared with inhibitor-NC group; △ P<0.05 compared with sh-circRERE group; ▲ P<0.05 compared with miR-128-3p inhibitor group; ☆ P<0.05 compared with sh-circRERE+inhibitor-NC group.

*P<0.05 compared with control group; # P<0.05 compared with sh-NC group; &P<0.05 compared with inhibitor-NC group; △ P<0.05 compared with sh-circRERE group; ▲ P<0.05 compared with miR-128-3p inhibitor group; ☆ P<0.05 compared with sh-circRERE+inhibitor-NC group;Scale bar=200 μm.

*P<0.05 compared with control group; # P<0.05 compared with sh-NC group; &P<0.05 compared with inhibitor-NC group; △ P<0.05 compared with sh-circRERE group; ▲ P<0.05 compared with miR-128-3p inhibitor group; ☆ P<0.05 compared with sh-circRERE+inhibitor-NC group.

2.4 CircRERE/miR-128-3p、miR-128-3p/WEE1靶向關系驗證

ENCORI數據庫預測miR-128-3p與circRERE、WEE1的結合位點(圖6A)。雙熒光素酶報告實驗中,circRERE-WT+miR-128-3p mimic組與circRERE-WT+mimic-NC組比較,熒光素酶活性下降(P<0.05);WEE1-WT+miR-128-3p mimic組與WEE1-WT+mimic-NC組比較,熒光素酶活性下降(P<0.05)(圖6B)。

A.binding sites prediction of miR-128-3p and circRERE or WEE1; B,C.double luciferase experiment confirmed the targeting relationship between miR-128-3p and circRERE(B) or between miR-128-3p and WEE1(C); *P<0.05 compared with mimic-NC.

3 討論

CircRNA的異常表達在腫瘤的發生和發展中具有重要作用,被認為是MM發病的關鍵因素[8]。CircRERE在MM組織和細胞中呈高表達,且其能夠增強MM細胞對硼替佐米的耐藥性,有望成為MM潛在的治療靶點[3]。在本研究中,circRERE在MM細胞中呈高表達,敲低其表達可降低RPMI-8226細胞的增殖率、劃痕愈合率和侵襲細胞數,表明circRERE可能作為一種促癌基因參與MM進展,敲低circRERE可抑制RPMI-8226細胞增殖、遷移和侵襲。

miRNA通過與靶基因mRNA的3’端非編碼區結合以使其降解或抑制其翻譯,負調控下游靶標的表達,能夠影響增殖、凋亡、遷移等過程,與MM的發生發展密切相關[9]。miR-128-3p為miRNA家族一員,在MM中表達下調,上調其表達能夠抑制MM進展。在本研究中,miR-128-3p在MM細胞中呈低表達,并且在MM細胞中抑制miR-128-3p表達會刺激細胞增殖、遷移和侵襲,表明miR-128-3p在MM中作為抑癌基因發揮作用。

CircRNA主要通過發揮miRNA海綿的功能來調節基因表達,從而調控腫瘤的生物學過程[10]。Circ_0000190通過調控miR-767-5p/MAPK4軸抑制MM的進展[11];Circ_0007841通過介導miR-129-5p/JAG1軸增加MM細胞對硼替佐米的耐藥性[12]。為了探究circRERE在MM中的調控機制,本研究通過生物信息學工具、雙熒光素酶報告基因檢測篩選并鑒定了circRERE的靶標miRNA。結果顯示,miR-128-3p是circRERE的靶標;敲低circRERE表達后RPMI-8226細胞miR-128-3p表達增加,提示circRERE可能通過抑制miR-128-3p表達參與MM進展。在敲低circRERE的同時下調miR-128-3p表達,結果發現,下調miR-128-3p可明顯減弱敲低circRERE對RPMI-8226細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用,證實敲低circRERE可上調miR-128-3p表達,從而阻斷MM細胞的惡性生物學行為。

WEE1是一個與細胞周期有關的基因,其能夠調控G2/M檢查點阻滯,為細胞在有絲分裂開始之前的受損DNA修復提供時間和條件,促進包括MM在內的多種癌的進展,為MM潛在的治療靶點[13]。在本研究中,MM細胞系中WEE1表達的水平顯著升高,使用生物信息學分析和雙熒光素酶報告實驗,WEE1被預測和驗證為miR-128-3p的靶標。miR-128-3p能夠通過靶向調控WEE1而促進膠質母細胞瘤細胞的生存并增強其對替莫唑胺的耐藥性[7]。有報道指出在胃癌中miR-128-3p能夠通過調節CLDN18影響胃癌的侵襲和遷移[14]。本研究結果顯示,敲低miR-128-3p表達后RPMI-8226細胞WEE1表達增加,而敲低circRERE表達后RPMI-8226細胞miR-128-3p表達增加,WEE1表達減少,表明miR-128-3p可能通過靶向負調控WEE1表達而抑制RPMI-8226細胞增殖、遷移和侵襲。這些提示敲低circRERE可能通過上調miR-128-3p,抑制WEE1表達,促進MM進展。

綜上所述,敲低circRERE可能通過靶向上調miR-128-3p、下調WEE1抑制RPMI-8226細胞遷移、侵襲和增殖,為開發MM治療的有效靶點提供了參考依據。未來可采用更多的細胞系并結合體內實驗驗證circRERE在MM中的作用與分子機制。