FHL2通過NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)THP-1巨噬細(xì)胞泡沫化

陳衛(wèi)衛(wèi)，廖 煌，史振鴻，羅 穎

海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 心血管內(nèi)科，海南 海口 570216

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)主要表現(xiàn)為動(dòng)脈壁纖維的脂肪病變,病程中伴隨慢性炎性反應(yīng),常導(dǎo)致心梗、中風(fēng)等心血管疾病的發(fā)生,致死率、致殘率極高,是急需重視的疾病之一[1]。在大、中動(dòng)脈內(nèi)皮下內(nèi)膜層血管中,阻塞斑塊的慢性積累會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重狹窄,血流受限,最終致組織缺氧[2]。包含巨噬細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞促進(jìn)了AS的發(fā)生,其中巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈壁內(nèi)積聚是導(dǎo)致AS的必要條件[3],是參與AS疾病進(jìn)程的主要炎性細(xì)胞。疾病初始期由單核細(xì)胞向M1型分化,發(fā)揮清除膽固醇的同時(shí),內(nèi)化脂蛋白顆粒,發(fā)生泡沫化,伴隨炎性細(xì)胞因子、活性氧(reactive oxygen species,ROS)等的分泌[4],進(jìn)一步促進(jìn)AS的發(fā)展。巨噬細(xì)胞泡沫化是AS的關(guān)鍵病理特征,對(duì)AS疾病進(jìn)程具有一定程度的影響,因此明確其泡沫化的分子機(jī)制,對(duì)AS的治療研究具有重要意義。

核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)被激活后,移位至巨噬細(xì)胞核內(nèi),參與下游多種脂質(zhì)代謝靶基因的調(diào)控,進(jìn)一步影響巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)代謝。4個(gè)半LIM結(jié)構(gòu)域蛋白(four and a half LIM domains protein 2,FHL2)參與多條信號(hào)通路,調(diào)節(jié)AS、心律失常、心肌肥厚等疾病的發(fā)展,并與細(xì)胞的增殖、凋亡有關(guān),能夠與TNF受體相關(guān)因子2(TRAF2)、TRAF4和TRAF6相互作用,這些因子是激活NF-κB信號(hào)通路的關(guān)鍵介質(zhì)[5]。推測(cè)FHL2在動(dòng)脈粥樣硬化中具有重要作用,但目前關(guān)于FHL2調(diào)節(jié)AS疾病發(fā)展的研究較少,因此有必要對(duì)此進(jìn)行探討。本研究使用氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞泡沫化模型,利用質(zhì)粒上調(diào)或下調(diào)FHL2在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平,研究FHL2影響巨噬細(xì)胞泡沫化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與細(xì)胞

RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司),胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和PBS(Hyclone公司),ox-LDL(Solarbio公司),IL-6 ELISA試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒和TNF-α ELISA試劑盒(BD公司),BAY 11-7082、油紅O染色試劑盒和PMA(Beyotime公司),兔抗phospho-IκBα單克隆抗體、兔抗IκBα單克隆抗體、兔抗phospho-p65單克隆抗體和兔抗p65單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司),抗FHL2單克隆抗體(Abcam公司),THP-1(人單核細(xì)胞)(中國科學(xué)院細(xì)胞庫)。本研究所用質(zhì)粒及siRNA由金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理:將THP-1細(xì)胞培養(yǎng)至匯合度達(dá)70%～80%后,將細(xì)胞傳代培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用含100 ng/mL PMA的培養(yǎng)基刺激THP-1細(xì)胞,將其誘導(dǎo)為THP-1巨噬細(xì)胞。使用Lipo 2000,按說明書要求操作,將構(gòu)建好的FHL2過表達(dá)質(zhì)粒、FLH2小干擾RNA(si-FLH2)及相應(yīng)的對(duì)照質(zhì)粒和siRNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中,之后換含50 μg/mL ox-LDL的培養(yǎng)基孵育細(xì)胞48 h,使其內(nèi)化脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為THP-1泡沫細(xì)胞。將細(xì)胞分為對(duì)照組(control組);ox-LDL組;FHL2+ox-LDL組;si-FHL2+ox-LDL組。為明確FHL2緩解細(xì)胞泡沫化的機(jī)制增加BAY 11-7082+FHL2+ox-LDL組。

1.2.2 轉(zhuǎn)染基因表達(dá)的驗(yàn)證:細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后,提取細(xì)胞總蛋白,確定濃度后,加樣,利用SDS-PAGE膠分離,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉,洗3次,加入1∶1 000稀釋的一抗(FHL2)孵育過夜,洗3次,加入二抗,ECL顯色液顯色曝光,檢測(cè)FHL2的表達(dá)情況。

1.2.3 ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌:收集各處理組細(xì)胞的培養(yǎng)上清,按要求處理樣品后,按照說明書所述操作,讀取A450數(shù)值。

1.2.4 油紅O染色檢測(cè)巨噬細(xì)胞泡沫化程度:取各組細(xì)胞,吸去細(xì)胞培養(yǎng)基,取適量染色洗滌液,覆蓋細(xì)胞20 s,棄掉洗滌液,加入油紅O染色工作液,染色15～20 min,洗滌液洗30 s,棄掉,加入PBS靜置30 s,棄掉后,在加入300 μL PBS,顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。

1.2.5 Western blot檢測(cè)NF-κB的活化:本部分所用一抗為:p-IκBα、IκBα、p-p65、p65。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 成功誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞

PMA刺激48 h后細(xì)胞呈不規(guī)則長(zhǎng)梭形,有偽足且貼壁,形態(tài)特征與巨噬細(xì)胞吻合(圖1)。因此,成功誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 PMA誘導(dǎo)前后THP-1細(xì)胞形態(tài)Fig 1 Morphology of THP-1 cells after PMA treatment(n=3)

2.2 FHL2敲低及過表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建

將FHL2質(zhì)粒、si-FHL2轉(zhuǎn)染至誘導(dǎo)成功的細(xì)胞中,si-FHL2組FHL2蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯下降,FHL2組中上調(diào)(P<0.05)(圖2)。成功構(gòu)建了敲低表達(dá)或過表達(dá)FHL2的細(xì)胞,可用于后續(xù)研究。

*P<0.05,**P<0.01 compared with control.

2.3 敲低FLH2能降低IL-6、IL-1β、TNF-α分泌水平

si-FHL2+ox-LDL組細(xì)胞IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌水平較ox-LDL組明顯降低,而ox-LDL組、FHL2+ox-LDL組細(xì)胞因子分泌水平與control組相比明顯上調(diào)(P<0.01),其中FHL2+ox-LDL組上調(diào)更為顯著(P<0.001)(圖3)。

*P<0.01, **P<0.001 compared with control group; # P<0.01, # # P<0.001 compared with ox-LDL group.

2.4 FLH2表達(dá)下調(diào)緩解細(xì)胞泡沫化

與對(duì)照組相比,ox-LDL組細(xì)胞內(nèi)脂滴較大且數(shù)量較多,FHL2+ox-LDL組泡沫化更為明顯,而si-FHL2+ox-LDL組細(xì)胞ox-LDL組、FHL2組相比,脂滴明顯減小、減少,泡沫化程度較輕(圖4)。

圖4 油紅O染色檢測(cè)泡沫化Fig 4 Detection of foaming by oil red O staining (n=3)

2.5 FLH2調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路的活化緩解細(xì)胞泡沫化

與對(duì)照組相比,ox-LDL組p-P65、p-IκBα表達(dá)水平顯著增加,其中FHL2+ox-LDL組上調(diào)更為顯著,而si-FHL2+ox-LDL組細(xì)胞則表現(xiàn)為表達(dá)水平降低(P<0.05)(圖5A)。與FHL2+ox-LDL組相比,BAY 11-7082+FHL2+ox-LDL組p-IκBα表達(dá)水平降低(圖5C)。與ox-LDL組相比,FHL2+ox-LDL組細(xì)胞泡沫化嚴(yán)重,而BAY 11-7082+FHL2+ox-LDL組與FHL2+ox-LDL組相較,泡沫化程度相對(duì)較輕(圖5B)。

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with control; # P<0.05 compared with ox-LDL; ▲ P<0.001 compared with FHL2+ox-LDL.

3 討論

AS的主要特點(diǎn)表現(xiàn)為動(dòng)脈脂質(zhì)沉積,常伴有平滑肌細(xì)胞增殖,逐步形成硬化斑塊,炎癥幾乎參與了AS的所有階段,是AS起始和發(fā)展過程中生理病理變化的基礎(chǔ)[6],分為脂肪條狀、粥樣及復(fù)雜硬化斑塊、臨床病理并發(fā)癥等4個(gè)階段,復(fù)雜粥樣硬化斑塊的主要特征為泡沫細(xì)胞的積累[7]。泡沫細(xì)胞是巨噬細(xì)胞內(nèi)化脂蛋白后,自身脂質(zhì)代謝紊亂形成的。巨噬細(xì)胞是機(jī)體主要的免疫細(xì)胞之一,能夠分泌產(chǎn)生相關(guān)細(xì)胞因子,調(diào)節(jié)機(jī)體的炎性反應(yīng),進(jìn)而影響AS的疾病進(jìn)程[7]。

FHL蛋白由4個(gè)完整和一個(gè)半LIM結(jié)構(gòu)域組成,屬于一個(gè)家族,包括FHL1、FHL2、FHL3、FHL4和ACT,其中FHL1和FHL3主要在骨骼肌中表達(dá),FHL2則主要在心臟中表達(dá)。FHL2是一種多功能的適配器蛋白,能與細(xì)胞表面受體、胞質(zhì)適配器和結(jié)構(gòu)蛋白、激酶和核轉(zhuǎn)錄因子相互作用,參與細(xì)胞的增殖、凋亡、黏附遷移及基因的表達(dá)[8],FHL2已被發(fā)現(xiàn)在心血管發(fā)育、AS、血管生成中發(fā)揮重要作用[9]。FHL2缺失的小鼠在高膽固醇飲食后,其AS病變較正常小鼠減輕[10];高脂飲食后ApoE/FHL2-/-小鼠AS斑塊較小,且巨噬細(xì)胞含量減少[11]。在本文中,通過在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-FHL2,經(jīng)油紅O染色發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞的泡沫化程度減輕,相關(guān)炎性細(xì)胞因子的分泌也下調(diào),緩解AS的發(fā)展。

NF-κB信號(hào)通路能調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng),影響炎性因子的分泌。通常情況下,NF-κB信號(hào)通路中IκB與異二聚體結(jié)合,通路不被激活,當(dāng)細(xì)胞被刺激后,IκB磷酸化降解,異二聚體轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)中,調(diào)節(jié)IL-6、TNF-α、IL-1β等炎性細(xì)胞因子的分泌[12]。而IL-6、TNF-α、IL-1β均可對(duì)AS產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。通過抑制IL-6的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠減少AS的發(fā)生[13];雷洛昔芬通過抑制IL-6/STAT3信號(hào)通路抑制AS的發(fā)展[14]。TNF-α作為一種促AS細(xì)胞因子,敲除TNF-α、ApoE的小鼠AS減輕,炎癥標(biāo)志物減少[15-16]。IL-1β被阻斷后,血液?jiǎn)魏思?xì)胞的炎性反應(yīng)減弱,進(jìn)而AS斑塊減小[15]。因此在本研究中,通過ELISA檢測(cè)了這三種細(xì)胞因子的分泌情況,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染siFHL2后,IL-6、TNF-α、IL-1β的分泌水平均下調(diào)。為進(jìn)一步明確FHL2調(diào)節(jié)AS的機(jī)制,si-FHL2可以下調(diào)phospho-p65、phospho-IκBα的表達(dá),NF-κB信號(hào)通路不被激活。且使用BAY 11-7082處理后,FHL2組細(xì)胞泡沫化程度相對(duì)減輕。綜上,下調(diào)FHL2的表達(dá)可以通過調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路的活化,下調(diào)IL-6、TNF-α、IL-1β的分泌水平,緩解THP-1巨噬細(xì)胞泡沫化。本研究為AS的治療提供了新的思路,為明確FHL2在動(dòng)脈硬化疾病中的潛在作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。