基于Nrf2/HO-1信號通路探討補陽還五湯對AngⅡ誘導的H9c2細胞鐵死亡的保護作用

薛亞楠, 王建波, 曲怡, 高佳馨, 張云雨, 張立德*

(1.遼寧中醫藥大學中醫藥創新工程技術中心, 沈陽 110847; 2.中醫臟象理論及應用教育部重點實驗室, 沈陽 110847;3.遼寧中醫藥大學研究生學院, 沈陽 110847)

高血壓作為常見慢性病,是世界1/4以上成年人(全世界估計有10億以上成年人)發病和死亡的主要病因[1],中國高血壓患者人數已達2.45億人[2],嚴重加重了心血管疾病的負擔。長期血壓升高會導致靶器官疾病,尤其是左心室的病理性改變,最終形成高血壓性心臟病而加重心力衰竭、心肌梗死等心血管事件的風險[3]。目前對引起病理性心臟重塑的機制研究尚少,因此進一步研究高血壓心臟病發病機制中新的分子靶點十分必要。

鐵死亡是最新研究發現的一種鐵依賴性、脂質過氧化驅動的細胞死亡級聯反應,以鐵代謝紊亂和脂質過氧化為中心環節,可通過鐵超載和谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)失活來激活,已成為心血管疾病發展的關鍵機制[4]。鐵死亡過程中,胱氨酸-谷氨酸反轉運蛋白活性受到抑制,即進入細胞的胱氨酸量減少,從細胞外運輸的谷氨酸量減少,脂質過氧化物累積[5],然后GPX4失活,導致細胞發生鐵死亡[6]。最新研究發現,抑制糖尿病(DM)和心肌缺血/再灌注(I/R)大鼠的鐵死亡,可減輕大鼠心肌損傷[7]。依據目前研究來看,抑制鐵死亡可能是治療和預防心臟損傷、減輕病理性心臟重塑和幫助預后的潛在靶向治療選擇。補陽還五湯是益氣活血的代表方劑,被臨床靈活加減應用于治療各種類型的高血壓病。臨床研究證實,應用補陽還五湯能改善高血壓患者的血液循環[8],糾正高血壓病氣虛血瘀證引起的細胞凋亡[9]。課題組前期研究也證明該方不僅可以保護血管內皮功能[10],還可通過抑制AngⅡ/AT1R信號通路的激活,保護高血壓心肌損傷[11]。基于以上,現使用血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)構建大鼠H9c2心肌細胞高血壓損傷模型,通過細胞檢測等手段觀察補陽還五湯對Nrf2/HO-1信號通路的調節作用,從鐵死亡的角度探討補陽還五湯對高血壓心肌損傷的保護機制。

1 材料與方法

1.1 細胞株

H9c2(2-1)(CL-0089)由武漢普諾賽生命科技有限公司提供。

1.2 藥物與制備

補陽還五湯:黃芪30 g,赤芍4.5 g,川芎3 g,當歸6 g,地龍3 g,桃仁3 g,紅花3 g。以上藥物購自遼寧中醫悅禾醫院,共52.5 g,用52.5 mL高壓滅菌水將其完全融化,將所得中藥溶液在200 r/min,50 ℃條件下旋轉蒸發濃縮后,用真空冷凝干燥機對濃縮后的藥物進行凍干處理48 h,制成凍干粉。使用前用超純水溶解凍干粉制備中藥母液,0.22 μm濾器過濾除菌后于-20 ℃冰箱保存待用。

1.3 實驗試劑及儀器

AngⅡ(貨號:A1042),美國APExBIO公司;Ferrostatin-1(Fer-1)(貨號:A4371),美國APExBIO公司;胎牛血清(FBS,Gibco公司);DMEM高糖培養基(貨號:CM-0089),武漢普諾賽生命科技有限公司;青鏈霉素混合液(貨號:No.P1400),索萊寶;胰蛋白酶-EDTA消化液(貨號:KGY0012),凱基生物;CCK-8試劑盒(貨號:KGA317),美國APExBIO公司;Nrf2 Ab-AF0639-50ul(貨號:AF0639),Affinity Biosciences;HO-1 Ab-AF0639-50ul(貨號:AF0639),Affinity Biosciences;Alexa Fluor 488標記山羊抗兔IgG(貨號:A0423),碧云天;免疫染色強力通透液(貨號:P0097),碧云天;細胞鐵含量檢測試劑盒(貨號:BC5315),北京索萊寶科技有限公司;Rat GPX4 Elisa kit(貨號:E31103),Andy gene;Rat GSH Elisa kit(貨號:E31034),Andy gene。

光譜型激光掃描共聚焦顯微鏡系統(FV10i);CO2恒溫培養箱(Thermos scientific);超凈工作臺(ESCO);細胞計數儀(LUAII);熒光定量 PCR儀(Applied Biosysterms 7500 Fast Real-Time PCR Systerm);梯度 PCR 擴增儀(Applied Biosystems);多功能酶標儀(SpectraMax I3奧地利Molecular Devices公司)。

2 方法

2.1 H9c2大鼠心肌細胞培養

H9c2細胞在37 ℃、5% CO2、飽和濕度環境下用含10% FBS和1%P/S Solution的DMEM高糖培養基培養。用胰蛋白酶-EDTA消化液消化和傳代,選擇對數期生長的細胞進行后續實驗。

2.2 細胞分組和給藥

將傳代后的H9c2細胞分為五組:正常組(ZC)、模型組(MX)、補陽還五湯低劑量組(BD)、中劑量組(BZ)、高劑量組(BG)和陽性對照組(YX)。待細胞生長至80%左右時,正常組繼續培養,模型組用含1 μmol/L AngⅡ的培養基培養,補陽還五湯低劑量組用含補陽還五湯顆粒0.5 mg/mL及1 μmol/L AngⅡ的培養基培養,中劑量組用含補陽還五湯顆粒1 mg/mL及1 μmol/L AngⅡ的培養基培養,高劑量組用含補陽還五湯顆粒2 mg/mL及1 μmol/L AngⅡ的培養基培養,陽性對照組用含10 μmol/L Fer-1及1 μmol/L AngⅡ的培養基培養,各組培養24 h后棄上清液,進行后續不同實驗檢測。

2.3 觀察指標及方法

2.3.1 CCK-8法檢測細胞活力

對數期生長的H9c2細胞接種至96孔細胞培養板,鋪板24 h后按照組別分別予以不同處理,每組10孔,24 h后吸去上清,根據試劑盒說明書使用CCK-8比色法檢測H9c2細胞活性(OD值表示)。用酶標儀檢測在波長450 nm處的吸光度,每組重復實驗3次,計算公式為

Ca=Asample/Acontrol×100%

(1)

式(1)中:Ca為細胞活性;Asample為加樣組吸光度值;Acontrol為空白組吸光度值。

2.3.2 細胞鐵含量檢測

選擇對數期生長的H9c2細胞接種于6孔細胞培養板,鋪板24 h后按照組別分別予以不同處理,每組2孔,24 h后棄上清,每組加入0.5 mL提取液,冰浴超聲波破碎細胞(功率200 W,超聲3 s,間隔7 s,重復30次),于4 ℃,8 500 r/min離心10 min后取上清后按照測定步驟操作,用酶標儀檢測在波長510 nm處的吸光度,用96孔板測得計算吸光度值差值,每組重復實驗3次。細胞鐵含量計算公式如下。

CFe=27.922ΔAm/ΔAs

(2)

ΔAm=Am-Ablank

(3)

ΔAs=As-Ablank

(4)

式中:CFe為細胞鐵含量,ng/104cell;ΔAm為測定吸光度差值;Am為測定值;Ablank為空白值;As為標準值。

2.3.3 免疫熒光法檢測Nrf2蛋白表達

將H9c2細胞以合適濃度接種于共聚焦小皿,待細胞貼壁后按照組別干預處理24 h后,棄培養液,用PBS清洗;加入預冷的4%多聚甲醛固定1 h,PBS清洗;免疫染色強力通透液通透10 min,PBS清洗;5%BSA封閉1 h,加入PBS配制的一抗,4 ℃過夜后PBS清洗,使用PBS配制的熒光二抗避光孵育2 h,PBS清洗后,滴加適量抗熒光衰減封片劑(含DAPI),于激光共聚焦顯微鏡下拍照。

2.3.4 RT-PCR法檢測鐵死亡通路相關因子表達

經AngⅡ造模及藥物干預處理后,使用Trizol裂解液從細胞中提取總RNA測量RNA濃度和純度,用逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA,隨后用熒光定量PCR儀進行擴增,β-actin作為內參基因。引物由北京博邁德基因技術有限公司合成,各分子引物序列見表1。

表1 擴增使用引物

2.3.5 ELISA法檢測細胞中GSH和GPX4含量

于六孔板中種植H9c2細胞,鋪板24 h后按照組別分別予以不同處理后,使用胰蛋白酶消化細胞后,用PBS稀釋細胞懸液(細胞濃度達106/mL),通過反復凍融使細胞破壞并放出細胞內成分,3 000 r/min離心20 min后收集上清。按照ELISA試劑盒說明書進行標準操作流程,用酶標儀檢測450 nm波長各孔吸光度,計算蛋白表達量。

2.3.6 Western Blot檢測細胞中Nrf2、HO-1蛋白表達

于25 mL細胞培養瓶中培養H9c2細胞,待細胞生長至對數期時按照組別予以相應處理24 h后,收集細胞,加入含1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑的RIPA裂解混合液提取蛋白,BCA法測定蛋白濃度后進行定量。60 μg蛋白上樣后用SDS-PAGE電泳和電轉移PVDF膜,使用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后孵育一抗4 ℃過夜,TBST洗滌3次后二抗室溫孵育2 h,TBST洗滌3次,用ECL發光試劑盒進行曝光,β-actin作為內參對目的蛋白進行對比分析。

3 統計學處理及結果

3.1 統計學處理

3.2 補陽還五湯對AngⅡ誘導的H9c2心肌細胞活力的影響

與正常組相比,模型組H9c2心肌細胞活力明顯下降(P<0.01);與模型組相比,補陽還五湯中劑量組、高劑量組和陽性對照組細胞活力均有所提升,其中高劑量組和陽性對照組效果顯著(P<0.01)。提示補陽還五湯和陽性藥物Fer-1能保護AngⅡ損傷的H9c2細胞活力,結果見圖1。

a表示與ZC組比較P<0.01;b表示與MX組比較P<0.01;數據以均值±標準差表示;每組實驗重復3次

3.3 補陽還五湯對AngⅡ環境下H9c2心肌細胞鐵含量的影響

與正常組相比,模型組H9c2細胞鐵含量明顯增加(P<0.01);與模型組相比,補陽還五湯高劑量組和陽性對照組細胞鐵含量均明顯減少(P<0.01),補陽還五湯中劑量組未見顯著性差異。提示補陽還五湯和陽性藥物Fer-1能降低AngⅡ誘導的H9c2細胞內鐵含量的表達,結果見圖2。

數據以均值±標準差表示;每組實驗重復3次

3.4 補陽還五湯對AngⅡ環境下H9c2心肌細胞Nrf2表達的影響

與正常組相比,模型組H9c2細胞綠色熒光值顯著降低(P<0.01),說明Nrf2蛋白表達明顯下降;與模型組相比,補陽還五湯中劑量組、高劑量組和陽性對照組綠色熒光值均顯著增加(P<0.01),說明經藥物治療后H9c2細胞內Nrf2蛋白表達明顯增多,且補陽還五湯高劑量組效果優于中劑量組。提示補陽還五湯和陽性藥物Fer-1能提升AngⅡ誘導的H9c2細胞內Nrf2蛋白表達的降低,結果見圖3和圖4。

圖3 補陽還五湯對AngⅡ環境下H9c2心肌細胞內Nrf2蛋白表達的影響(熒光圖600×)Fig.3 Effect of Buyang Huanwu Decoction on the expression of Nrf2 protein in H9c2 myocardial cells under AngⅡ environment (fluorescence map 600×)

a表示與ZC組比較P<0.01;b表示與MX組比較P<0.01;數據以均值±標準差表示;每組實驗重復3次

3.5 補陽還五湯對AngⅡ誘導的H9c2心肌細胞鐵死亡信號通路相關因子表達的影響

與正常組相比,模型組H9c2細胞內GPX4、Nrf2和HO-1的mRNA表達均顯著低于正常組(P<0.01);補陽還五湯中劑量組、高劑量組和鐵死亡抑制劑組GPX4、Nrf2和HO-1的mRNA表達均顯著高于模型組(P<0.01);補陽還五湯低劑量組與模型組相比未見顯著差異(P<0.01),結果見圖5。

a表示與ZC組比較P<0.01;b表示與MX組比較P<0.01;數據以均值±標準差表示;每組實驗重復3次

3.6 補陽還五湯對各組H9c2細胞內GPX4、GSH、Nrf2和HO-1蛋白表達的影響

與正常組相比,模型組GPX4、GSH、Nrf2和HO-1蛋白表達明顯減少;與模型組相比,補陽還五湯高劑量組和陽性對照組GPX4、GSH、Nrf2和HO-1蛋白表達顯著增高,補陽還五湯低劑量組未見顯著差異,但補陽還五湯中劑量組有表達上升趨勢,結果見圖6。

a表示與ZC組比較P<0.01;b表示與MX組比較P<0.01;數據以均值±標準差表示;每組實驗重復3次

4 討論

高血壓病歸屬于中醫學的“眩暈”“頭痛”等范疇,氣虛血瘀型為臨床上較常見證型,氣虛血瘀、氣血不和而致眩暈、頭痛、乏力等癥狀,故在治療上以補氣、活血通絡為主。補陽還五湯作為益氣活血的代表方劑被臨床靈活加減應用于治療各種類型的高血壓病,這與中醫理論體系的基本特點——辨證論治相契合。中醫理論認為,人體內部各組織器官不是孤立存在而是相互關聯的有機統一整體,任一環節出現問題皆會影響整體生命活動。大量研究證實,高血壓繼發左心室肥厚患者預后不良,心血管病的發生率是其他危險因素(如年齡、高膽固醇血癥、糖尿病等)的2～4倍[12-13],患中風[14]、室性心律失常和心源性猝死[15]的風險也更高,這與中醫理論體系的另一基本特點——整體觀念相契合。目前已知鐵死亡在心肌病、心肌梗死(MI)、缺血/再灌注損傷(IRI)和心力衰竭(HF)中皆起著關鍵作用。由于鐵死亡和鐵過量是心肌細胞死亡主重要原因,所以抑制鐵死亡是減少心肌細胞死亡和改善心臟病狀況的新策略。因此,從鐵死亡角度探究高血壓性心肌損傷的分子機制對闡釋中醫藥防治高血壓性心臟病具有重要意義。

腎素-血管緊張素系統(RAS)在心血管疾病中的作用已得到充分證實,在維持血壓穩定、細胞外液容量內穩態和心血管重構中皆起著關鍵作用[16-18]。RAS失控可導致多種病理條件,主要是動脈血壓的升高,通過直接作用于心臟、血管和腎臟等組織,導致靶器官的損傷[19]。AngⅡ作為RAS的主要活性肽,可誘導小鼠的病理性心臟重塑和功能障礙[20],激活AngⅡ受體可誘導血管收縮、內皮功能障礙、炎癥等[21]。因此,通過體外培養H9c2大鼠心肌細胞,采用1 μmol/L的AngⅡ誘導H9c2細胞構建高血壓性心肌細胞損傷模型,采用10 μmol/L的Fer-1為陽性對照組[22]。結果顯示,與正常組相比,AngⅡ誘導的H9c2細胞活性明顯降低,鐵含量明顯升高,補陽還五湯和鐵死亡抑制劑Fer-1的使用能緩解AngⅡ引起的H9c2細胞死亡,且鐵含量有所下降,提示鐵死亡可能參與了AngⅡ誘導的H9c2細胞損傷,補陽還五湯可能是通過抑制鐵死亡的途徑對心肌細胞損傷起到了保護作用。

谷胱甘肽(GSH)是細胞抗氧化防御中最重要的成分之一,是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的一種簡單的三肽。谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)作為維持細胞內抗氧化系統平衡的關鍵酶[23],主要作用是維持GSH兩種類型之間的平衡[24]。細胞通過胱氨酸/谷氨酸反轉運體系統xC-/xCT從細胞外環境輸入胱氨酸獲得半胱氨酸。輸入的胱氨酸通過胱氨酸還原酶被還原,被谷氨酸-半胱氨酸連接酶(GCL)和谷胱甘肽合成酶(GSS)用于生成GSH。當胱氨酸/谷氨酸反轉運體系統xC-/xCT受到抑制時,細胞內GSH合成減少導致氧自由基堆積而引起細胞發生鐵死亡[25]。核因子E2相關因子(Nrf2)是啟動內源性抗氧化反應元件的轉錄因子之一,調控著數百個基因,其中許多基因直接或間接參與調節鐵死亡,包括GSH、鐵和脂質的代謝以及線粒體功能,幾乎所有與鐵死亡相關的基因都由Nrf2 轉錄調控[26]。Nrf2不僅可以誘導細胞GSH增加,還可以通過直接上調GPX4轉錄保護細胞免受過氧化物生成和鐵死亡的影響[27-29]。增強Nrf2的表達可減輕心肌氧化應激對糖尿病心臟起到保護作用[30]。此外,當體內自由基增多時,Nrf2還可以通過活化易位到細胞核并結合到特定的DNA位點應對氧化應激,進而啟動下游抗氧化酶如血紅加氧酶-1(HO-1)的轉錄表達防止細胞發生氧化[31],HO-1將血紅素降解為膽綠素和亞鐵等,通過抗凋亡和抗氧化作用參與到鐵死亡的過程而發揮保護心臟的作用[32]。換言之,Nrf2與其下游抗氧化反應元件GSH、GPX4、HO-1等是調節鐵死亡和脂質過氧化的重要信號分子[33]。既往研究表明,Nrf2/HO-1信號軸還具有逆轉線粒體凋亡的作用,從而減緩疾病進程而作為緩解高血壓心臟病的治療方法[34];瑞舒伐他汀可通過調節Nrf2和Smads之間的相互作用,改善心功能,減少心肌肥厚[35]。然而,高血壓繼發心肌損傷是否由于鐵死亡相關通路被激活尚不明確。

5 結論與展望

采用AngⅡ誘導H9c2細胞構建高血壓性心肌細胞損傷模型,研究心肌損傷的機制及補陽還五湯在心肌損傷中的藥理作用。結果表明AngⅡ可誘發H9c2細胞鐵死亡及相關因子表達的降低。與模型組相比,補陽還五湯高劑量組能明顯提升GPX4、GSH、Nrf2、HO-1基因和蛋白表達,從而改善細胞活力,與陽性對照組結果一致;補陽還五湯低劑量組未見治療效果,中劑量組僅AngⅡ條件下H9c2細胞鐵死亡相關通路的基因表達起到了顯著效果,蛋白表達未見顯著性差異,證實補陽還五湯高劑量組治療AngⅡ誘導的H9c2細胞損傷效果最佳。由此推測補陽還五湯預防和保護高血壓性心肌損傷,其可能作用機制與上調Nrf2/HO-1通路相關因子的表達進而調控鐵死亡有關。通過構建體外模型為補陽還五湯對高血壓性心肌損傷的保護作用提供了參考資料,但介于補陽還五湯復方中藥材的多樣性和復雜性,使其作用途徑和靶點也不單一,因此該復方是否通過調節鐵死亡保護高血壓性心肌損傷,仍需進一步實驗驗證。