基于高通量測序的雞糞堆肥過程細菌群落結構分析

張 慧 林戎斌 林陳強 賈憲波 蘇光秋 陳濟琛

（1福建省農業科學院土壤肥料研究所，福建福州 350001；2屏南縣農業農村局，福建屏南 352300）

隨著畜禽養殖業的高質量發展以及環境保護政策的實施，禽畜糞便等農業廢棄物的資源化、無害化處理[1-2]，有利于減少禽畜糞便隨意排放造成的污染，如何實現禽畜糞便的回收再利用、變廢為寶成為研究的熱點之一[3-5]。禽畜糞便通過堆肥發酵處理將其中的致病菌和寄生蟲殺死，得到高品質的腐殖質，可為植物和土壤提供肥料，有利于可再生能源的發展[6]。近年來，Illumina 測序平臺Solexa 高通量測序技術逐漸被應用于堆肥微生物種群結構與演替規律的相關研究，Antunes 等[7]對高溫堆肥過程的宏基因組和基因轉錄組結果的分析表明，堆肥過程中表現出持續的嗜熱譜（50～70 ℃），在高溫階段真菌活性近乎消失。黃家慶等[8]利用高通量測序技術對豬糞堆肥的研究發現，豬糞堆肥添加生物炭后，堆肥物料理化性質發生了改變，生物炭為堆肥細菌提供了合適的生長環境。Yan 等[9]采用高通量測序技術分析了堆肥稻草中固態厭氧發酵產氣過程中微生物種群信息，結果表明，微生物種群主要由甲烷桿菌屬、擬桿菌綱、梭菌和變形菌門細菌組成。

本研究利用高通量測序技術分析雞糞和菇渣堆肥過程中的細菌群落結構變化及演替規律，深入探討細菌在雞糞堆肥過程中的作用，為畜禽糞便資源化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 堆肥原料和樣品采集

堆肥發酵在福建省某公司廠內進行，雞糞來自尤溪，菌渣來自順昌，雞糞和菌渣按質量比4∶6 均勻混合，初始含水率為60%～65%，碳氮比（C/N）為29∶1（表1），槽式堆肥規格為80.0 m×5.0 m×1.5 m（長×寬×高），通過翻堆進行通氣，每3 d翻2次，每日監測環境和堆體溫度。槽式堆肥發酵持續30 d，在第1、2、7、20 和30 天分別從堆體上、中、下層進行取樣，每層取5 個樣點，均勻混合，分別記作FJ0、FJ1、FJ2、FJ3和FJ4。堆肥樣品分2 份，一份500 g 放置實驗室4 ℃保存，另一份100 g 放置-80 ℃保存，分別用于理化指標測定和高通量測序分析。

表1 堆肥原料理化參數

1.2 堆肥樣品理化指標測定

堆體溫度和空氣環境溫度利用數顯溫度計測定；含水率采用恒重法測定；pH采用電位法測定；總有機碳和全氮分別采用重鉻酸鉀容量法和硫酸雙氧水消煮—凱氏定氮法測定；總有機碳和全氮兩者的比值為碳氮比。

1.3 堆肥樣品DNA提取和高通量測序

使用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取堆肥樣品細菌總DNA，用NanoDrop超微量紫外分光光度計測定總DNA的濃度和純度，以濃度和純度均較高的總DNA為模板，用引物338F和806R進行細菌16S rRNA基因的PCR擴增。PCR擴增體系：10 ng DNA模板，0.4 μL FastPfu 聚合酶，0.8 μL引物，2.0 μL 2.5 mmol/L dNTPs，4.0 uL 5×FastPfu 緩沖液。PCR 反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s；72 ℃延伸60 s，共30個循環；最后72 ℃延伸10 min。使用Universal DNA純化試劑盒純化PCR產物，純化產物由上海美吉生物公司利用Miseq PE300 平臺進行高通量測序。

1.4 生物信息學分析

基于Illumina 分析平臺對原始測序數據進行過濾處理，去除OTU 單序列和嵌合體序列得到優化序列，進行序列對比，在相似度97%水平上進行OTU聚類，有效序列信息物種采用RDP 分類器軟件進行分類學分析，同時對堆肥樣品進行α多樣性相關分析，多樣性指數包括ACE、Chao1、Shannon、Coverage和Simpson等。

2 結果與分析

2.1 堆肥過程中的理化性質變化

溫度是堆肥過程中重要的評價指標之一，是影響堆肥腐熟的關鍵因素。從圖1 可以看出，堆肥開始后，堆體溫度逐漸上升，第7 天溫度最高，達到68 ℃，而后逐漸下降，達到環境溫度時基本穩定。堆肥過程中堆體溫度變化可以分為4 個時期：升溫期（第1—2天），高溫期（第3—15天），降溫期（第16—20 天）和腐熟期（第21—35 天）。由表2 得知，隨著堆肥不斷進行，含水率、pH 值和總有機碳含量呈下降趨勢，全氮含量則為上升趨勢。

圖1 堆肥過程中溫度的變化

表2 堆肥過程中堆肥樣品的理化參數變化

2.2 堆肥過程中細菌群落豐度和多樣性

堆肥樣品的DNA 序列結果在NCBI 上的登錄號為PRJNA678850。堆肥樣品細菌16S rDNA V3—V4區測序過濾后，有效序列數為40 741～59 781 條，OTUs數為312～720條，在97%相似水平下聚類統計，得到各個堆肥樣品OTU中的豐度信息。ACE指數和Chao1指數代表細菌菌群豐富度，指數值越大說明豐富度越高[10]；Simpson 指數反映細菌群落優勢度，指數值越大細菌群落多樣性越低[11]；Shannon 指數也是反映各堆肥樣品多樣性的指數之一，多樣性程度隨數值增大而升高。由表3可知，5個堆肥樣品物種覆蓋率指數在0.991 2～0.996 7，ACE指數和Chao1指數隨著堆肥溫度升高而增大，指數值在高溫期最大，隨著堆肥溫度降低指數值有所減?。籗impson指數隨著溫度升高而減小，指數值在高溫期最??；Shannon指數值在高溫期最大，說明在堆肥過程中，高溫期堆肥中細菌菌群豐富度最高，群落多樣性最大。

表3 堆肥樣品細菌多樣性指數

2.3 堆肥體系中細菌群落在門和綱水平上的分布

如圖2所示，在細菌門水平上，雞糞堆肥過程中主要有厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、鹽厭氧菌門（Halanaerobiaeota）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和綠彎菌門（Chloroflexi）等，相對豐度之和占到總量的93%以上，其他細菌相對豐度占比均低于1%。其中，厚壁菌門是好氧堆肥過程中木質纖維素降解的主要菌群[12]，可以促進纖維素的降解和利用。厚壁菌門的相對豐度在雞糞堆肥各時期均占主導地位，可能與其孢子的耐熱性有關[13]，其在腐熟期的相對豐度最高，較堆肥當天升高了1.21倍，隨著堆肥溫度變化先降低后升高，對菌渣的降解具有重要作用；擬桿菌門具有降解高分子量化合物的作用[14-17]，其在腐熟期相對豐度最低，在堆肥當天最高；鹽厭氧菌門是一類兼性厭氧菌[15，18-19]，在降溫期相對豐度最高，比堆肥當天升高16.92倍。

圖2 堆肥體系中主要的細菌門及相對豐度

如圖3所示，在綱水平上，雞糞堆肥過程中主要有梭菌綱（Clostridia）、芽孢桿菌綱（Bacilli）、擬桿菌綱（Bacteroidia）、Limnochordia、鹽厭氧菌綱（Halanaerobiia）、Thermovenabulia 和放線菌綱（Actinobacteria）等細菌，相對豐度之和占到總量的95%以上，其他細菌相對豐度占比均低于1%。其中，芽孢桿菌綱細菌可以分解蛋白質，在升溫期和高溫期相對豐度較低，腐熟期相對豐度最高，較堆肥當天升高7.01 倍；梭菌綱細菌在升溫期相對豐度達到最高，比堆肥當天升高2.30倍，之后逐漸降低；擬桿菌綱細菌在腐熟期相對豐度最低，在堆肥當天最高；鹽厭氧菌綱細菌在降溫期相對豐度最高，Limnochordia是耐中高溫的兼性厭氧菌，在高溫期相對豐度最高。

圖3 堆肥體系中主要的細菌綱及相對豐度

2.4 堆肥樣品屬水平細菌群落聚類分析

對樣品間OTUs 分析，將相對豐度排名前50 的細菌屬雙向二維聚類，在圖4 中顏色的梯度及相似程度可以清楚獲知樣本間細菌相對豐度的變化，顏色逐漸加紅代表細菌屬的相對豐度逐漸升高，顏色逐漸加藍代表細菌屬的相對豐度逐漸降低。圖4中5 個堆肥時期樣品可以分成2 個大類，FJ0細菌群落結構與其他堆肥時期樣品細菌群落結構有顯著差異，FJ0單獨為一類，FJ1、FJ2、FJ3和FJ4細菌群落結構較相似聚為一類，說明經過發酵，堆肥細菌類群發生變化，但在發酵過程中，堆肥細菌類群較類似。

圖4 堆肥樣品屬水平細菌的OTUs聚類分析熱圖

3 結論與討論

本試驗通過高通量測序分析發現，在雞糞堆肥過程中細菌群落是不斷演化的。α多樣性相關分析表明，高溫期堆肥中細菌菌群豐富度最高，群落多樣性最大，說明在此階段細菌群落代謝活動最旺盛，高溫期是有機質腐化最快的時期，對堆肥物料轉化起作用的微生物數量和種類迅速增加[20]，微生物的代謝活動加速了堆體升溫，延長了高溫期，充分利用微生物以提高堆肥腐熟度對好氧堆肥具有重要意義。在細菌綱水平上，雞糞堆肥過程中主要有梭菌綱、芽孢桿菌綱和擬桿菌綱等；在細菌門水平上，雞糞堆肥過程中主要有厚壁菌門、擬桿菌門和鹽厭氧菌門等。厚壁菌門具有纖維素降解作用，其相對豐度在雞糞堆肥各時期均占主導地位，這與王建才等[12]的研究結果一致，其在腐熟期的相對豐度最高，隨著堆肥溫度變化先降低后升高，說明厚壁菌門對菌渣的降解具有重要作用，外源加入此類菌群能否加快物料降解與腐熟，有待進一步研究。

本研究利用高通量測序技術分析了雞糞和菇渣堆肥過程中的細菌群落結構變化及演替規律。結果表明，在雞糞堆肥期間細菌群落結構隨發酵時間延長發生變化；其中高溫期堆肥中細菌菌群豐富度最高，群落多樣性最大；厚壁菌門為雞糞堆肥各階段的主要類群。