炎癥性腸病合并皮膚損害患者外泌體差異表達蛋白質及發病機制研究

吳俊俊 李珍 李華銘 李春霞 朱偉琴 王宇芳

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病，是常見的慢性消化系統疾病之一。IBD 可發生在腸內，也可發生在腸外，可能涉及多種器官系統，包括關節、皮膚、眼睛、肝臟、膽汁、肺、腎、免疫系統或血液系統等。胃腸道外器官的累及通常稱為IBD 的腸外表現，其發病率高達6%～47%[1]。近10 年來，關于外泌體與IBD 關系的研究較多，但其與IBD 合并皮膚損害關系的研究較少。目前，臨床上對于合并皮膚損害的IBD 診斷存在延誤現象，部分患者在IBD 診斷前就已經出現皮膚損害，部分患者在IBD 診斷后出現皮膚損害。而診斷的延誤會導致治療的延誤，使患者的生活質量降低，并造成更大的經濟負擔。因此，迫切需要研究新的靶點來進一步闡明該病的發病機制，為臨床精準治療提供方向。外泌體攜帶著大量細胞特異的生物活性分子，如核酸、蛋白質、脂類和糖類等，通過囊泡運輸和向受體細胞運送蛋白質和核酸來調節多種病理生理途徑，在機體免疫調節、動脈粥樣硬化、腫瘤藥物抵抗、抗病毒等多種生理病理過程中發揮著重要作用[2]。近年來學者發現，M2B 巨噬細胞衍生的外泌體通過C-C 基序趨化因子1（C-C chemokine 1，CCL1）/CCR8 軸上調調節性T細胞和IL-4 的水平，下調結腸炎相關細胞因子IL-6、IL-1β、和IL-17A 的水平，從而減輕誘導性結腸炎的嚴重程度[3]。在英夫利昔單抗治療IBD 的研究中，使用蛋白質組學技術檢測出了差異表達蛋白質，為臨床治療提供了更多依據[4]。通過質譜分析蛋白質組學適用于分子機制的研究，利用串聯質量標簽（tandem mass tags，TMT）的MS/MS 蛋白質組學策略已成為蛋白質組學研究中的一個重要策略，有助于鑒別并定量差異表達蛋白質。因此，本研究基于TMT 蛋白質組學分析IBD 合并皮膚損害患者的外泌體，進一步闡明IBD 合并皮膚損害的發病機制，為其臨床診斷、靶向治療、預后轉歸判斷等提供依據，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取杭州市第三人民醫院2020 年1 月至2021 年12 月 收 治 的5 例IBD 以及5 例IBD 合并皮膚損害患者為研究對象，分別為IBD 組、IBD+皮膚損害組；另選取本院同期體檢的5 名年齡和性別匹配的健康志愿者為對照組。IBD 組男2 例，女3 例；年齡22～66（50±17）歲。IBD+皮膚損害組男3 例，女2 例；年齡48～64（61±8）歲；IBD 合并蕁麻疹2 例，IBD 合并濕疹2例，IBD 合并多形紅斑1 例；皮膚損害主要表現為皮疹、瘙癢，部分有脫屑。對照組男3 人，女2 人；年齡49～62（56±5）歲。3 組對象性別、年齡比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。本研究經本院醫學倫理委員會審查通過（批準文號：KL2018031），所有患者知情同意。

1.2 血清外泌體提取 采集入組對象清晨空腹肘靜脈血5 mL，4 ℃2 000 r/min離心10 min，取上清液于1.5 mL無RNA酶EP管中，-80 ℃冰箱儲存備用。將-80 ℃樣品進行解凍，4 ℃13 500 r/min 離心15 min，取上清液，經0.22 μM微孔濾膜過濾，使用Exo Quick Solution 外泌體提取試劑盒從血清中分離外泌體。

1.3 血清外泌體差異表達蛋白質鑒定 采用BCA 法對外泌體蛋白質進行初步定量。加入蛋白酶抑制劑及尿素溶液（終濃度為8 mol/L）后，利用超聲進行裂解，使用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。在蛋白溶液中加入二硫蘇糖醇使其終濃度為5 mmol/L，56 ℃還原30 min。之后加入碘代乙酰胺使其終濃度為11 mmol/L，室溫、避光孵育15 min。最后將樣品的尿素濃度稀釋至低于2 mol/L。按1∶50 的質量比例（胰酶∶蛋白）加入胰酶，37 ℃酶解過夜。再以1∶100 的質量比例（胰酶∶蛋白）加入胰酶，繼續酶解4 h。用0.5 mol/L TEAB 溶解肽段，根據TMT 試劑盒操作說明標記肽段；使用高pH 反向HPLC 分離肽段，色譜柱為Agilent 300Extend C18（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動相梯度為8%～32%乙腈，60 min 分離60 個組分；隨后將肽段合并為14 個組分，真空冷凍干燥。肽段用液相色譜流動相A 相0.1%（v/v）甲酸水溶液溶解后，使用EASY-nLC 1000超高效液相系統進行分離。分離出的肽段經由超高效液相系統分離后被注入NSI 離子源中進行電離，再進行Q Exactive Plus 質譜分析。數據采集模式使用數據依賴型掃描程序，即在一級掃描后選擇信號強度最高的前20 肽段母離子依次進入HCD 碰撞池使用28%的碎裂能量進行碎裂，同樣依次進行二級質譜分析。

1.4 差異表達蛋白質的生物信息學分析 采用基因本論（gene ontology，GO）和京都基因和基因組數據庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）對IBD組與IBD+皮膚損害組差異表達蛋白質進行生物信息學分析。（1）GO 主要用于表述基因和基因產物的各種屬性分析，能從不同角度闡釋蛋白質的生物學作用，主要包括生物進程、細胞組成和分子功能等。（2）KEGG 是一個集合基因組、系統功能信息和化學的綜合性數據庫，主要用于基因組及其功能的系統分析，主要包括代謝通路、復合物、生化反應等。

2 結果

2.1 血清外泌體差異表達蛋白質的鑒定 通過質譜分析共得到二級譜圖416 950 張，可利用的有效譜圖36 899 張，譜圖利用率為8.8%。通過譜圖解析鑒定肽段8 412 條，其中特異性肽段7 860 條。本研究共鑒定829 種蛋白質，其中包含定量信息的蛋白質726 種。與對照組比較，IBD 組有15 種蛋白質表達上調，21 種蛋白質表達下調，見圖1A；IBD+皮膚損害組有24 種蛋白質表達上調，25 種蛋白質表達下調，見圖1B；與IBD 組比較，IBD+皮膚損害組有12 種蛋白質表達上調和8 種蛋白質表達下調，見圖1C。

圖1 差異表達蛋白質的火山圖（A：IBD 組比對照組；B：IBD+皮膚損害組比對照組；IBD+皮膚損害組比IBD 組）

2.2 差異表達蛋白質的GO 分析結果 GO 分析顯示，IBD 組與對照組、IBD+皮膚損害組與對照組、IBD+皮膚損害組與IBD 組差異表達蛋白質涉及的生物過程包括刺激反應、細胞過程、單有機過程、生物調節等，細胞組成主要包括細胞、細胞膜外域、細胞器等，分子功能主要包括結合、催化活性等，見圖2。

圖2 差異表達蛋白質的GO 分析結果（A：IBD 組比對照組；B：IBD+皮膚損害組比對照組；C：IBD+皮膚損害組比IBD 組）

2.3 差異表達蛋白質的KEGG 分析結果 KEGG 分析顯示，IBD 組與對照組差異表達蛋白質主要與細胞黏附、離子跨膜運輸調控、細胞形態分化等有關；IBD+皮膚損害組與對照組差異表達蛋白質主要與細胞分泌、細胞分解代謝、分泌調節有關；IBD+皮膚損害組與IBD組差異表達蛋白質主要與細胞胺代謝、NIK/NF-κB 信號通路、細胞周期過程的負調控等有關，見圖3（插頁）。

圖3 差異表達蛋白質的KEGG 分析結果（A：IBD 組比對照組；B：IBD+皮膚損害組比對照組；C：IBD+皮膚損害組比IBD 組）

3 討論

隨著蛋白質組學分析技術的不斷提高，IBD 發病機制研究也在不斷深入，這為臨床精準治療提供了新的方向。本研究結果發現，與對照組比較，IBD 組有15種蛋白質表達上調，21 種蛋白質表達下調；IBD+皮膚損害組有24 種蛋白質表達上調，25 種蛋白質表達下調；與IBD 組比較，IBD+皮膚損害組有12 種蛋白質表達上調和8 種蛋白質表達下調。考慮到這些蛋白質表達的差異性可能在IBD 合并皮膚損害的發病機制中起著重要作用，故本研究利用生物信息學技術對這些差異表達蛋白質作進一步分析。IBD 的發病機制較為復雜，包括環境因素、遺傳易感性、基因和免疫因素等多個方面[5-7]。IBD 合并皮膚損害的患者會表現出不同于腸內病變的病理學改變，可能是因為中性粒細胞功能異常或細胞免疫功能受損所致的。本研究GO 分析發現，與IBD 組比較，IBD+皮膚損害組外泌體蛋白質在刺激反應、細胞過程及單有機過程等方面有著豐富的生物學功能，與目前臨床上對IBD 病理及生理學認識是一致的。KEGG 分析發現，與IBD 組比較，IBD+皮膚損害組外泌體蛋白質在細胞胺代謝、NIK/NF-κB 信號通路、細胞周期過程的負調控等方面有著豐富的生物學功能。某研究對結腸炎動物模型進行蛋白質組學分析發現，通過激活AMPK/核因子紅系2 相關因子2/血紅素加氧酶-1 通路可抑制高遷移率族群1/NF-κB級聯，增強結腸黏膜細胞的自噬和抑制凋亡，減輕結腸炎癥反應[8]。促炎細胞可通過激活NK-κB 信號通路，進而激活一系列與免疫相關的基因。在多數細胞中，TNF 也可以殺死細胞，但NK-κB 的激活可以阻止TNF 誘導的細胞死亡[9]。TNF 是一種促進炎癥反應并參與IBD 發病的細胞因子，與其他細胞和組織不同的是，腸上皮細胞在暴露于TNF 后會發生快速的細胞死亡，其具體機制尚不清楚。相關實驗證實，TNF 介導的慢性IBD 的發病機制具有重要臨床意義[10]，目前通過抗TNF 治療IBD 也取得了良好的療效[11-12]。腸黏膜的另一個關鍵性調控信號通路是Wnt/β-catenin 信號通路，它在維持上皮干細胞功能中發揮關鍵作用[13]。與IBD 組比較，本研究生物信息學分析顯示的IBD+皮膚損害組外泌體差異表達蛋白質的生物學功能與蛋白質結構是一致的，這或許可以解釋IBD 合并皮膚損害患者自身免疫因素的重要性。從細胞學角度分析，維持細胞膜穩定性也是非常重要的，這或許為將來靶向研究提供了方向。

綜上所述，本研究基于TMT 蛋白質組學分析篩選出IBD+皮膚損害患者血清外泌體差異表達蛋白質，這些蛋白質參與IBD 合并皮膚損害的代謝相關通路及生物學功能。